Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero

El objetivo general de este procedimiento es generar un mosaico genético en la corteza cerebral del ratón mediante la inducción de la recombinación de Cre-Lox a través de la electroporación en el útero. Este método de generación de mosaicos genéticos puede ayudar a responder preguntas clave en neurobiología. Por ejemplo, determinar si un gen es necesario para un determinado fenotipo neuronal de forma autónoma de la célula.

La principal ventaja de esta técnica es que el eficaz sistema de recombinación Cre-Lox se combina con una técnica de administración de genes igualmente eficaz en la electroporación uterina. Aunque este método se centra en dirigirse a las neuronas corticales de la capa dos-tres, se puede utilizar para dirigirse a las neuronas en otras profundidades de las capas corticales. Cuando intentamos hacer mosaicos genéticos en nuestro tejido cerebral, nos encontramos con varios problemas para lograr que nuestros animales de experimentación sobrevivieran después del nacimiento, por lo que introdujimos varias simplificaciones y refinamientos a nuestra técnica.

Prepare una pipeta con un cono muy largo y una punta muy fina, típica de las pipetas para inyección de células madre embrionarias o transferencia nuclear, insertando primero el capilar de vidrio en el extractor de pipetas. Después de sujetar las abrazaderas, active el programa para el protocolo de tracción, creando un cono en el capilar de vidrio. Asegúrese de que la longitud del cono esté entre 10 y 15 mm utilizando un microscopio óptico compuesto.

A continuación, para romper la punta de la pipeta, centro una toallita de una sola capa sobre un vaso de precipitados de 50 ml y estírelo con una mano. Con la otra mano, empuje la pipeta extraída, con el lado del cono hacia abajo, perpendicularmente a través del centro de la toallita, causando una ruptura limpia en el cono. Verifique el tamaño de la abertura bajo un microscopio óptico compuesto.

A continuación, calibre la pipeta aspirando 1 mcL de azul de tripano al 0,4 % y PBS en una pipeta parcialmente llena y gradúe la pipeta con marcas de 1 mcL en función de la altura de 1 mcL en la pipeta. Utilice la pipeta calibrada para graduar otras pipetas extraídas antes de desecharlas. Coloque las pipetas en el soporte de pipetas libres de polvo y otras partículas.

Después de anestesiar profundamente a una rata embarazada en E-15.5, pruebe el reflejo de enderezamiento inclinando suavemente la cámara de inducción y observando la respuesta del ratón. Si el reflejo de enderezamiento está ausente, transfiera el ratón al área de preparación quirúrgica y administre isoflurano inhalado a través de un cono nasal para mantener un plano quirúrgico de anestesia. Use fórceps para probar el reflejo del pedal para verificar la anestesia.

Controle la frecuencia respiratoria con esfuerzo, buscando una respiración profunda y regular y que las membranas mucosas sean de color rosado y húmedas. Aplique suficiente ungüento oftálmico veterinario sobre los ojos para cubrirlos por completo y protegerlos contra la sequedad. Masajee la crema depilatoria en el área abdominal con hisopos de algodón hasta que el pelaje abdominal se disuelva.

A continuación, limpie el vello abdominal y limpie cuidadosamente cualquier residuo restante y la crema depilatoria con etanol al 70% y bastoncillos de algodón. Aplique una solución exfoliante a base de yodo en el área abdominal con movimientos circulares.

Luego, use un paño quirúrgico para aislar el área quirúrgica y mantener las condiciones estériles. Después de hacer una incisión de 2 cm en la línea media ventral en la piel, busque la línea alba para visualizar la línea media del recto abdominal. Tire del músculo hacia arriba y lejos del abdomen y haga una incisión de 2 cm en la línea media para exponer la cavidad abdominal mediante técnicas asépticas.

Con una punta de micropipeta estéril de 10 mcL, dispense carprofeno en la cavidad abdominal para la analgesia. A continuación, sujete una pinza antimosquitos Hartmann en el borde izquierdo de la incisión del recto abdominal. Apoye las pinzas en la placa de Petri volcada a la izquierda de la incisión, manteniendo abierto el lado izquierdo de la incisión.

Después de sujetar el lado derecho de la incisión de manera similar, coloque una esponja de gasa alrededor del área de la incisión. Usando pinzas de anillo sin un tornillo de límite adjunto, tire del útero entre dos embriones vecinos sin aplastar ni dañar ningún tejido. Comience a extraer todos los embriones a través de la incisión, colocándolos encima de la esponja de gasa.

Conecte una pipeta calibrada al conjunto del tubo aspirador e inyecte exactamente 1 mcL de solución de ADN preparada a través de la pared uterina en un ventrículo lateral de cada embrión. Use el pulgar y el índice para manipular los embriones, permitiendo que los embriones sean empujados suavemente contra la pared uterina durante la inyección. Los ventrículos laterales aparecen como dos parches más oscuros en el telencéfalo dorsal del embrión.

Confirme el éxito de la inyección observando el azul de tripano llenando el ventrículo lateral. Después de inyectar todos los embriones, coloque el cátodo de los electrodos tipo pinza en el útero, directamente sobre la corteza medial y caudal para dirigirse a la corteza visual. Coloca el ánodo justo debajo y por delante de la cabeza del embrión.

Con el pedal, active la entrega de pulsos de 550 ms de 50 voltios separados por un intervalo de 950 ms. Después de electroporar todos los embriones, regrese el útero a la cavidad abdominal en la misma orientación en la que se encontró. Utilice solución salina para lubricar el útero mientras lo guía manualmente y con extrema suavidad, teniendo cuidado de no desplazar a los embriones de su posición en el útero.

Cierre los músculos abdominales con suturas reabsorbibles. Use una puntada interrumpida simple, atando los extremos con un nudo de cirujano. Cierre la capa de la piel con suturas reabsorbibles.

Aplique una pequeña cantidad de adhesivo de papel para sellar la herida. Aplique adhesivo de papel tisú a los nudos para evitar que se desabrochen. Utilice una micropipeta para eliminar cualquier adhesivo tisular que rodee la herida y que pueda aspirarse.

Una vez que el adhesivo tisular esté seco, retire al animal del isoflurano y permita que la hembra se recupere sola en una jaula caliente. Continúe monitoreando el mouse hasta que esté completamente recuperado y se comporte normalmente. Una vez retirado, vuelva a colocar a la hembra en la jaula con el macho.

Coloque la calavera sobre una superficie plana con toallitas húmedas de una sola capa humedecidas con 1-x PBS. Con unas pinzas, primero retire el hueso occipital. A continuación, retire con cuidado los huesos parietales, sacando las pinzas y alejándolas de la superficie del cerebro.

Retire con cuidado las meninges para evitar daños en la corteza. Coloque la parte posterior de las pinzas debajo del cerebro a lo largo del cráneo para cortar los nervios craneales y extraer el cerebro. Utilice una cuchilla de afeitar de un solo filo para hacer un corte coronal de aproximadamente 0,5 mm rostral al bregma, y otro corte coronal de aproximadamente 0,5 mm caudal al tejido de interés.

El bloque de tejido ya está listo para el seccionamiento. La inyección de 1 mcL de 2 mg/mL de GFP Cre da como resultado una distribución escasa de células marcadas, algunas de las cuales pueden ser brillantes. Debido a que el tejido está seccionado a 100 micras, se conservan la mayoría de los árboles dendríticos.

Cuando la electroporación en el útero se realiza en el día embrionario 15.5, el marcaje se produce a través de las capas corticales dos y tres. Las espinas dendríticas se pueden observar a grandes aumentos. La inyección de 1,5 mcL de 2 mg/mL de GFP Cre da como resultado un marcaje muy denso, que puede ser subóptimo ya que es difícil rastrear el origen de las neuritas y las espinas dendríticas.

Sin embargo, al seleccionar una célula brillante en la periferia del área etiquetada, aún es posible obtener imágenes de una neurona y sus procesos. Alternativamente, la inyección de construcciones SuperNova da como resultado una distribución dispersa de neuronas de capa dos-tres que están muy brillantemente marcadas. Una vez dominada, la cirugía de electroporación en el útero tomará menos de 30 minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento con otras construcciones de ADN, es importante recordar probar diferentes concentraciones y volúmenes, esto ayudará a lograr la escasez deseada de etiquetado requerida para el análisis en mosaico. Nuestros resultados representativos utilizaron un solo constructo o un constructo SuperNova inventado recientemente. En este último, descubrimos que podíamos lograr un excelente marcaje disperso, al tiempo que maximizábamos el brillo de las neuronas.

Esta técnica podría adaptarse para crear tejido cerebral en mosaico de otras maneras. Por ejemplo, la edición de genes CRISPR y Cas9 puede combinarse con la electroporación en el útero, o la recombinación de Cre-Lox puede combinarse con la inyección intraventricular de vectores virales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de varias técnicas simplificadas y refinadas utilizadas para lograr un mosaico genético disperso, de modo que pueda combinar la recombinación de Cre-Lox y la electroporación en el útero.

Le deseamos la mejor de las suertes.