Name: Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprende a inducir recombinación Cre-lox en corteza cerebral de ratón mediante electroporación in utero. Este método permite estudios de pérdida de función in vivo en neuronas corticales para investigar fenotipos neuronales.

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Los autores agradecen el apoyo generoso de la James Madison University Departamento de biología y la James Madison University microscopía de luz y centro de la proyección de imagen. Dr. Mark L. Gabriele para consejos útiles con respecto a la preparación de jóvenes tejido postnatal, y DRS. Justin W. Brown y Corey L. Cleland generoso coordinación de espacio y materiales quirúrgicos. Esta investigación fue financiada en parte por una beca de investigación colaborativa 4-VA, una colaboración para el avance de la Commonwealth de Virginia (G.S.V.) y por Virginia Academia de ciencia pequeño proyecto de investigación becado (G.S.V.). Se ha generosamente apoyado por una dotación de Betty Jo Butler amoroso 58 para la beca de investigación de pregrado (a K.M.B.), una beca de investigación de verano de Farrell (para K.M.B.), James Madison University segundo siglo becado (a K.M.B.), un James Beca centenario de la Universidad de Madison (a C.J.H.), una Universidad James Madison búsqueda 30 Lucy Robinson Memorial Scholarship (para Z.L.H.) y una Universidad de James Madison de la ciencia y las matemáticas Facultad ayuda subsidio (G.S.V.).

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Aquí, presentamos la combinación de la electroporación en el útero con recombinase de Cre en los ratones de floxed para generar el tejido del cerebro de mosaico. Una ventaja de este enfoque es que una nueva línea de mouse no es necesario que se generan cada vez un diferente subtipo celular debe orientarse: electroporación en el útero puede utilizarse para apuntar neuronas excitatorias, las neuronas inhibitorias o glia dependiendo de la época y la ubicación de electroporación15<su...

La generación de un mosaico genético, es un paradigma experimental clásico para entender la función de un gen de interés. Para determinar si un gen es necesario para un fenotipo celular, el enfoque más sencillo está causando una pérdida de función del gen en el organismo (por ejemplo, knockout). Sin embargo, para determinar si un gen se requiere específicamente en un determinado tipo de célula, golpe de gracia del gene en el organismo no es un enfoque válido. En cambio, se requiere un método que causará la pérdida de función de un gen en una célula determinada, mientras que está rodeado por tejido de tipo salvaje (es decir, genéticamente imperturbable), en otras palabras, crear tejido mosaico. Si la célula mutante muestra un fenotipo mutante, pero no las células circundantes de tipo salvaje, las funciones del gene de una manera autónoma de células. Análisis de tejido de mosaico, en el que las células mutantes están rodeadas por tejido de tipo salvaje, es ideal para la comprensión de la célula autónoma funciones de genes, especialmente en el cerebro donde las neuronas y glia forman una vasta red interconectada de tejido.
Varias formas de tejido cerebral de mosaico han proporcionado poderosos modelos para investigar la célula autónoma funciones de genes. Estudios se centraron en el trasplante neuronal1, mosaicism ligadas al cromosoma X femenino2,3,4, y mosaicism somático endógena5,6 han extraído sus conclusiones basados en mosaico tejido cerebral. Supresión condicional de un gen a través del sistema de recombinación del Cre-lox es un método que aprovecha la gran disponibilidad de líneas de ratón transgénico. En este método, se introducen dos loxP sitios a ambos lados de una secuencia necesaria de un gen (como un exón), dejándola flanqueado por sitios loxP que enfrentan a ambos en la misma dirección ("floxed"). Recombinase de CRE accisas la secuencia entre la loxP sitios7. Recombinación mediada por la CRE se logra por los ratones de floxed paso a otra línea de ratón expresan recombinase de Cre junto con un marcador fluorescente en un subconjunto de células ("línea de la reportera de Cre"). Esto se ha demostrado en una variedad de maneras para descubrir las funciones de un gen en subconjuntos de células como neuronas excitatorias o astrocitos8. Líneas de reportero de CRE pueden expresar CreERT2 para permitir la recombinación mediada por la Cre a ser droga-inducible (solo-neurona etiquetado con knockout inducible Cre-mediada, o SLICK)9. En otra estrategia llamada análisis de mosaico con doble marcadores (MADM)10,11, Cre-mediada intercromosomal recombinación permite un mutante homocigótico para crearse junto con tejido heterozigótico. En estos enfoques, una nueva línea de ratones debe ser producido cada vez para cada gen candidato o subtipo celular que se ha probado. Por otra parte, recombinase de Cre puede introducirse postnatal a través de iontoforesis12 o vectores virales (e.g. virus adeno-asociados13 o lentivirus14 llevar celulares específicos de subtipo promotores). Esta estrategia crea fuerte y postnatal de etiquetado. Para desarrollar las neuronas corticales cerebrales escasamente y prenatally, una estrategia ideal es en el útero la electroporación del recombinase de Cre con un marcador fluorescente.
Además de combinar la recombinación del Cre-lox a través de electroporación en el útero para producir mosaico tejido en vivo, introducimos varias adaptaciones a los procedimientos de otros protocolos publicados15,16, 17,18,19,20,21. Proporcionamos información para mejorar el éxito en las mujeres embarazadas en tiempo de cría. También describiremos nuestros dos estrategias para introducir rala y brillante etiqueta de neuronas en el tejido cortical: una estrategia es valorar los niveles de una construcción única codificación recombinase de Cre y un marcador fluorescente22. Otra estrategia es utilizar el sistema de "Supernova", diseñado específicamente con estos parámetros en mente23,24. Además, nos ofrecen mejoras en la producción de microinyección consistente pipetas y simplificaciones a la cirugía en el útero la electroporación. Finalmente, describiremos los pasos críticos en un preparado histológico simplificado que permite el análisis de espinas dendríticas y cenadores dendríticas y axonales, sin más manchas o inmunohistoquímica.

<table><tbody><tr><td>Ratones C57BL/6J</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>#000664</td><td>Ver "1. Configuración del ratón" (paso 1.1, "ratones de tipo salvaje")</td></tr><tr><td>GFP. Cre vector vacío</td><td>AddGene</td><td>#20781</td><td>Véase "2. Configuración del ADN" (paso 2.1: "construcción de ADN única que codifica para la recombinasa Cre, así como un marcador fluorescente"). GFP. El vector vacío Cre fue un regalo de Tyler Jacks.</td></tr><tr><td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69138</td><td>Véase "2. Configuración del ADN" (paso 2.1 Sistema "Supernova") y http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) fue un regalo de Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69136</td><td>Véase "2. Configuración del ADN" (paso 2.1 Sistema "Supernova") y http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) fue un regalo de Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#85006</td><td>Véase "2. Configuración del ADN" (paso 2.1 Sistema "Supernova") y http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) fue un regalo de Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>Kit Maxi de Plásmido EndoFree (10)</td><td>Qiagen</td><td>#12362</td><td>Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.3 "kit de purificación de plásmidos sin endotoxinas")</td></tr><tr><td>Polvo de azul de tripano, grado de biorreactivo</td><td>Sigma</td><td>T6146-5G</td><td>Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "azul de tripano")</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio, ACS, 2,5 kg</td><td>VWR</td><td>BDH9286-2,5KG</td><td>Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "NaCl")</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio, ACS, 500 g</td><td>VWR</td><td>#97061-566</td><td>Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "KCl")</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-100G</td><td>Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "Na2HPO4")</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td>Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "KH2PO4")</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, reactivo ACS, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "HCl")</td></tr><tr><td>P-97 Extractor de micropipetas</td><td>Instrumento Sutter</td><td>P-97</td><td>Ver "3. Configuración de la pipeta" (paso 3.1 "Tirador capilar de vidrio")</td></tr><tr><td>Filamento de canal de 3,0 mm de ancho</td><td>Instrumento Sutter</td><td>FT330B</td><td>Ver "3. Configuración de pipetas" (paso 3.1 "Extractor de capilares de vidrio")</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de pared delgada, 4", 1 / 0.75 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>Ver "3. Configuración de pipetas" (paso 3.1.1 "capilar de vidrio")</td></tr><tr><td>Toallitas de tecnología blanda de una sola capa, 4.5"</td><td>Phenix</td><td>LW-8148</td><td>Ver "3. Configuración de pipetas" (paso 3.2.1 "toallita de tareas de una sola capa"); se pueden utilizar otras toallitas de una sola capa (por ejemplo, Kimwipes).</td></tr><tr><td>Pinzas Graefe, 7 cm, rectas, 0,7 mm 1x2 dientes</td> World <td>Precision Instruments</td><td>#14140</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "Pinzas de Graefe")</td></tr><tr><td>Tijeras de iris, 11,5 cm, rectas, paquete de 12</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503708-12</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "Tijeras de iris")</td></tr><tr><td>Pinzas para mosquitos Hartman, 9 cm, rectas, paquete de 12</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503728-12</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "Pinzas para mosquitos Hartman")</td></tr><tr><td>Esponjas no tejidas de uso general, 2" x 2", 4 capas</td><td>Medrepexpress</td><td>#2204-c</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "Esponjas de gasa no tejidas")</td></tr><tr><td>Pinzas con punta de anillo, 10 cm, rectas, 2,2 mm ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503203</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "pinzas con punta anular")</td></tr><tr><td>Placas de Petri Pyrex completas, D.O. y tiempos; H 100 mm y veces; 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160102-12EA</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "Placas de Petri")</td></tr><tr><td>Bandeja de instrumentos de tipo plano, acero inoxidable, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"</td><td>Amazon</td><td>B007SHGAHA</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "bandeja de acero inoxidable")</td></tr><tr><td>Pinza de platino, 5 mm</td><td>BTX</td><td>#45-0489</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.3 y 4.16 "electrodos tipo pinza")</td></tr><tr><td>ECM 830 Pedal</td><td>BTX</td><td>#45-0211</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.3 y 4.17 "pedal")</td></tr><tr><td>ECM 830 Generador</td><td>BTX</td><td>#45-0052</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.3 "generador")</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia de isoflurano para un solo animal con caja de inducción pequeña</td><td>Aparato de Harvard</td><td>#72-6468</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.4 y 4.6 "cono de nariz", paso 4.4 "cámara de inducción")</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co</td><td>#0536108691</td><td>Ver "4. Electroporación intrauterina" (paso 4.7 "Pomada oftálmica veterinaria")</td></tr><tr><td>Space Gel (AIMS)</td><td>VWR</td><td>#95059-640</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.8 "bolsa sellada llena de solución salina sobresaturada")</td></tr><tr><td>Crema Gel Depiladora, Fórmula Sensible</td><td>Veet</td><td>#062200809951</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.9 "Crema depilatoria")</td></tr><tr><td>10ul Arrancador de punta de baja retención (960 puntas/paquete)</td><td>Productos de investigación</td><td>Phenix TSP-10LKIT</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.12 "estéril 10 y micro; L punta de micropipeta")</td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.15 "Conjunto del tubo aspirador")</td></tr><tr><td>Sutura reabsorbible trenzada, 4-0, Aguja NFS-2(FS-2), 27"</td><td>Medrepexpress</td><td>MV-J397</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.19 "suturas reabsorbibles")</td></tr><tr><td>" LiquiVet Rápido" Adhesivo para tejidos</td><td>Medrepexpress</td><td>VG3</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.20 "adhesivo tisular")</td></tr><tr><td>Jeringas hipodérmicas, polipropileno, punta Luer lock, capacidad 1.0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.21 "Jeringa de 1 mL")</td></tr><tr><td>Agujas de jeringa BD Precisionglide calibre 26, L 1/2 pulg.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192392-100EA</td><td>Véase "4. Electroporación en el útero" (paso 4.21 "26G, &frac12; &rdquo; aguja")</td></tr><tr><td>Nestlets Material de anidación</td><td>Ancare NES3600</td><td></td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.24 "Materiales de anidación")</td></tr><tr><td>Semillas de girasol, aceite negro,</td><td>estéril Bio-Serv</td><td>S5137</td><td>Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.24 "semillas de girasol")</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.1.1 "PFA")</td></tr><tr><td>Economía Pinzas #3, 11 cm, puntas de 0,2 x 0,4 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>#501976</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.5 "pinzas")</td></tr><tr><td>Agar polvo</td><td>Alfa Aesar</td><td>#10752</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.8.1 "agar")</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de un solo filo, hoja #9 Stanley</td><td>Tools</td><td>#11-515</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.9 "cuchilla de afeitar de un solo filo")</td></tr><tr><td>Disco de muestras S D 50 mm</td><td>Leica</td><td>#14046327404</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.9 "Disco de muestra de micrótomo vibratorio")</td></tr><tr><td>Bandeja tampón S montaje</td><td>Leica</td><td>#1404630132</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.10 "bandeja tampón")</td></tr><tr><td>VT1000 S Vibratome</td><td>Leica</td><td>#14047235612</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.10 "micrótomo vibratorio")</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de doble filo</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.10 "hoja")</td></tr><tr><td>Portacuchillos S</td><td>Leica</td><td>#14046230131</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.10 "portacuchillos")</td></tr><tr><td>Studio Elements Golden Taklon Mango Corto Juego de Pinceles Redondos</td><td>Amazon B0089KU6XE</td><td></td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.12.1 "pincel de punta fina")</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides Servicios de</td><td>Microscopía Electrónica</td><td>#71869-11</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.12.1 "portaobjetos de microscopio")</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml</td><td>Thermofisher</td><td>P36970</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.12.3-5.12.4 "montaje")</td></tr><tr><td>Cubreobjetos, 24 x 50 mm, n.º 1</td><td>Phenix Research Products</td><td>MS1415-10</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.12.4 "cubreobjetos")</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.13.1 "DAPI")</td></tr><tr><td>Microscopio vertical de platina fija</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.15 "Microscopio óptico")</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Nikon</td><td>TE2000/C2si</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.15 "microscopio confocal")</td></tr><tr><td>4x objetivo, NA = 0.20</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 4X</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.15 "objetivo de baja potencia")</td></tr><tr><td>objetivo 20x, NA = 0.75</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.15 "objetivo de potencia media")</td></tr><tr><td>Objetivo 60x, NA = 1.40</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo VC 60X Aceite</td><td>Ver "5. Histología" (paso 5.15 "objetivo de alta potencia")</td></tr></tbody></table>

inducción de la recombinación del cre-lox en la corteza cerebral de ratón a través de electroporación en el útero

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Funciones neuronales células autónomas de genes pueden ser reveladas por una pérdida o ganan de función de un gen en una población pequeña y escasa de neuronas. Para ello requiere generar un mosaico en que las neuronas con la pérdida o ganancia de función de un gen están rodeadas por tejido genéticamente imperturbable. Aquí combinamos el sistema de recombinación del Cre-lox con electroporación en el útero con el fin de generar el tejido de cerebro de mosaico que se puede utilizar para estudiar la función celular Autónoma de genes en las neuronas. Construcciones de ADN (disponibles en repositorios), codificación para una etiqueta fluorescente y recombinase de Cre, se introducen en el desarrollo de las neuronas corticales que contienen genes flanqueados con sitios loxP en los cerebros de embriones de ratón con el útero en electroporación. Asimismo, describen varias adaptaciones para el método de electroporación en el útero que aumentan la supervivencia y reproducción. Este método también implica establecer un título para la recombinación mediada por la Cre en una población densa o escasa de neuronas. Preparaciones histológicas de tejido cerebral marcada no requieren (pero puede ser adaptadas a) immunohistochemistry. Los constructos utilizados garantizan que etiqueta fluorescente las neuronas llevan el gen del recombinase de Cre. Preparaciones histológicas permiten análisis morfológico de neuronas a través de la proyección de imagen confocal de cenadores dendríticas y axonales y espinas dendríticas. Debido a la pérdida o ganancia de función se realiza en tejido mosaico escaso, este método permite el estudio de la célula autónoma necesidad y suficiencia de productos gen en vivo.

La sola construcción GFP. CRE (véase lista de materiales) fue electroporated en E15.5 y visualizados en P14. Dependiendo de la concentración de la construcción y el volumen de la inyección, puede obtenerse un resultado escaso o densa22,26. Por ejemplo, la inyección de 1 μl de 2 mg/mL GFP. Resultados CRE en una escasa distribución de las células marcadas, algunas de las cuales pueden ser brillante (figura 1A</s...

Funciones célula Autónoma de genes en el cerebro pueden ser estudiadas mediante la inducción de la pérdida o ganan de función en poblaciones dispersas de las células. Aquí, describimos en el útero la electroporación para entregar recombinase de Cre en poblaciones escasas de desarrollo de las neuronas corticales con genes floxed a causar la pérdida de función en vivo.

Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

El objetivo general de este procedimiento es generar un mosaico genético en la corteza cerebral del ratón mediante la inducción de la recombinación de Cre-Lox a través de la electroporación en el útero. Este método de generación de mosaicos genéticos puede ayudar a responder preguntas clave en neurobiología. Por ejemplo, determinar si un gen es necesario para un determinado fenotipo neuronal de forma autónoma de la célula.La principal ventaja de esta técnica es que el eficaz sistema de recombinación Cre-Lox se combina con una técnica de administración de genes igualmente eficaz en la electroporación uterina. Aunque este método se centra en dirigirse a las neuronas corticales de la capa dos-tres, se puede utilizar para dirigirse a las neuronas en otras profundidades de las capas corticales. Cuando intentamos hacer mosaicos genéticos en nuestro tejido cerebral, nos encontramos con varios problemas para lograr que nuestros animales de experimentación sobrevivieran después del nacimiento, por lo que introdujimos varias simplificaciones y refinamientos a nuestra técnica.Prepare una pipeta con un cono muy largo y una punta muy fina, típica de las pipetas para inyección de células madre e

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de ratón E15

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

Este artículo describe en detalle un protocolo para electroporar en el útero de la corteza cerebral y el hipocampo en E14.5 en ratones. También se muestra que este es un método valioso para estudiar las dendritas y espinas en estas dos regiones cerebrales.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

En este video, una cría de ratón modificada genéticamente portadora del gen Ccm2 flanqueada por sitios loxP y Cre recombinasa fusionada con un receptor de estrógeno se utiliza para inducir malformaciones cavernosas cerebrales (MCC). La administración de 4-hidroxitamoxifeno activa Cre en las células endoteliales, lo que conduce a la deleción de Ccm2 y la formación de CCM en el cerebro.

Inducción mediada por Cre-LoxP de malformaciones cavernosas cerebrales en un modelo de ratón

Fuente: Denaxa, M., el al., Trasplante de progenitores interneuronales corticales modificados quimiogenéticamente en cerebros de ratón posnatales tempranos. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el procedimiento para inyectar un vector plásmido que lleva el gen de interés en progenitores interneuronales en un corte de cerebro embrionario, seguido de electroporación para la entrada de plásmidos y la expresión génica. Estos progenitores modificados se pueden usar más tarde para tratar...

Transferencia de genes asistida por electroporación integrada en agarosa en progenitores de interneuronas corticales de ratón

La migración neuronal está regulada por numerosos factores autónomos y no autónomos de células.  Este protocolo muestra cómo se puede utilizar la electroporación en el útero para determinar si un fenotipo en un ratón transgénico se debe a la interrupción de un mecanismo intrínseco celular o al deterioro de la interacción entre la neurona y su entorno.

La inducción de la proteína a través de Supresión In Utero La electroporación para definir Déficits en Neuronal migración en modelos transgénicos

Aprovechando una estrategia genética binaria, proporcionamos un protocolo detallado para el rastreo de circuitos neuronales en ratones que expresan trazadores transsinápticos complementarios después de la recombinación mediada por Cre. Debido a que la producción de trazadores específicos de células está codificada genéticamente, nuestro enfoque experimental es adecuado para estudiar la formación y maduración de circuitos neuronales durante el desarrollo del cerebro embrionario murino a una...

Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Este protocolo describe en detalle cómo transfectar específicamente diferentes regiones en el sistema nervioso central C57BL/6 a través de la electroporación en el útero. En este protocolo se incluyen instrucciones detalladas para las transfecciones de regiones que se desarrollan en la corteza, el hipocampo, el tálamo, el hipotálamo, el núcleo septal lateral y el cuerpo estriado.

Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

Los astrocitos azulejos de la corteza cerebral uniformemente, haciendo que el análisis de su morfología compleja desafiante a nivel celular. El protocolo proporcionado aquí utiliza etiquetado multicolor basado en electroporación de útero para señalar astrocitos corticales y analizar su volumen y morfología con una canalización de análisis de imágenes fácil de usar.

En Utero Electroporación de marcadores de color multiaconsejables integradores del genoma (MAGIC) para individualizar los astrocitos corticales del ratón

Aprende a inducir recombinación Cre-lox en corteza cerebral de ratón mediante electroporación in utero. Este método permite estudios de pérdida de función in vivo en neuronas corticales para investigar fenotipos neuronales.

Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero

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