Un análisis de la inmunofluorescencia celular Simple para detectar autoanticuerpos contra el Receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) en sangre

El objetivo general de este ensayo es detectar autoanticuerpos contra el receptor NMDA en la sangre de pacientes con sospecha de encefalitis autoinmune. La medida ayuda a responder a las preguntas clave en el diagnóstico diferencial de pacientes con síntomas neuropsiquiátricos agudos. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de una medida de cribado sencilla y fiable.

Comience este procedimiento preparando placas de cultivo recubiertas de gelatina. Alícuota 200 microlitros de una solución de gelatina al 2% en cada pocillo de una placa de cultivo de 48 pocillos e incubar la placa a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos. Después de 30 minutos, aspire la solución de gelatina de los pocillos.

Siembra en cada pocillo 5 veces 10 hasta la 4ª célula HEK293 en 200 microlitros de medio de cultivo celular, que contiene 10% de FBS. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo gastado en cada pocillo con 200 microlitros de medio de cultivo fresco, que contenga 10% de FBS.

Escalando de acuerdo con el número total de pocillos en el experimento, prepare la solución A mezclando el plásmido NR1-GFP con el medio de cultivo. Prepare la solución B mezclando el reactivo de transfección con el medio de cultivo. Prepare la solución C mezclando la solución A y la solución B e incubando la mezcla a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos.

A continuación, alícuota 40 microlitros de solución C a cada pocillo que contenga las células HEK293. Agite la placa suavemente e incube la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada suministrada con un 5% de dióxido de carbono durante la noche. Compruebe la expresión de la proteína recombinante NR1-GFP en las células huésped bajo un microscopio fluorescente con un aumento de 40 a 200 veces, antes de proceder al ensayo de inmunofluorescencia basado en células.

Para comenzar este ensayo, primero aspire el medio gastado de los pocillos de la placa de cultivo y luego lave cada pocillo con 200 microlitros de PBS tres veces. Agregue 200 microlitros de solución de paraformaldehído al 4% a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos. Aspire la solución de paraformaldehído de los pocillos y lave cada pocillo con 200 microlitros de PBS tres veces.

A continuación, agregue 200 microlitros de leche descremada al 10% en solución PBST a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente agitando suavemente durante una hora. Aspire la leche descremada al 10% en solución de PBST de los pocillos y lave los pocillos con 200 microlitros de PBST una vez. Incubar los pocillos con plasma diluido de uno a 100 en PBST como anticuerpo primario con una agitación suave a temperatura ambiente durante una hora.

Después de una hora, aspire el plasma diluido de los pocillos y lave cada pocillo con 200 microlitros de PBST tres veces. A cada pocillo, agregue 200 microlitros de IgG antihumana de cabra, conjugada con Alexa Fluor 594 e incube la placa de cultivo a temperatura ambiente con una agitación suave durante una hora. A continuación, aspire la IgG antihumana de cabra conjugada con la solución Alexa Fluor 594 y lave cada pocillo con 200 microlitros de PBST tres veces.

Después del tercer lavado con PBST, agregue 100 microlitros de solución de glicerol, que contiene DAPI, a cada pocillo. Observe y obtenga imágenes de las células bajo un microscopio fluorescente utilizando el filtro correcto para cada tinte y un ocular de 10 veces con objetivos de cuatro, 10 veces y 20 veces. Estas imágenes representativas tomadas de 24 a 30 horas después de la transfección, muestran células HEK293 que expresan NR1-GFP.

Aproximadamente el 30% de las células tenían la señal verde bajo el microscopio fluorescente. En las imágenes correspondientes de Alexa Fluor 594, la señal roja en el panel B indica la unión de los autoanticuerpos anti-receptor NMDA a la NR1 expresada en las células HEK293. La señal roja débil en el panel E indica el ruido de fondo de las imágenes de Alexa Fluor 594.

Las células que expresan NR1-GFP se utilizaron para detectar la presencia de autoanticuerpos anti-receptor NMDA en una muestra de plasma humano. En estas imágenes combinadas, el color amarillo indica la colocalización de los autoanticuerpos NR1-GFP y anti-NMDA receptor. Las flechas indican ejemplos de células con colocalización prominente.

Una muestra de plasma que muestre una superposición superior al 30% de las señales verde y roja se interpretará como positiva en este caso. En la imagen combinada del control negativo, hay poca superposición de señales verdes y rojas, lo que confirma la unión específica de los autoanticuerpos del receptor anti-NMDA al NR1-GFP en el ensayo. Una vez dominada, la técnica se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente.

Al intentar esta técnica, es importante recordar que es solo una medida de detección. Después de estos procedimientos, se pueden realizar otras medidas, como el análisis de Western blot y el análisis basado en tejidos, para responder a preguntas adicionales como la especificidad de los casos positivos. Después del desarrollo, la técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la psiquiatría exploren el diagnóstico diferencial de pacientes con emergencia aguda de salud mental.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el ensayo para detectar autoanticuerpos contra el receptor NMDA en la sangre.