Name: Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a realizar pruebas de tolerancia a glucosa intraperitoneal, pletismografía y fijación pulmonar para estudiar el impacto de la obesidad y los trastornos metabólicos en la función respiratoria.

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Los experimentos fueron apoyados por la Marga y Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Alemania; 210-02-16 (MAAA), proyecto 210-03-15 (MAAA) del proyecto y por la Fundación de investigación alemana (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Alemania; Centro de Medicina Molecular de Colonia (CMMC; Hospital de la Universidad de Colonia; Programa de adelanto de carrera; MAAA), fortuna Köln (Facultad de medicina, Universidad de Colonia; KD).

Animales todos los procedimientos se realizaron en cumplimiento de protocolos de actuación aprobados por las autoridades del gobierno local (tierra NRW, AZ: 2012.A424) y estaban de acuerdo con la ley de bienestar animal alemán y las normas sobre el bienestar de los animales utilizados para experimentos o para otros fines científicos. Desde análisis de función de pulmón pueden afectar la estructura del pulmón y por lo tanto posteriores analiza histológica, debe realizarse la medición de Res Cdyn y preparación y fijación del pulmón para histomorfometría en diferentes animales. Sin embargo, es posible medición de Res y Cdyn después de ipGTT. Puesto que el estrés durante la ipGTT puede interferir con la anestesia necesaria para la función pulmonar, pruebas, un período de recuperación de aproximadamente 2 semanas después de ipGTT se recomienda para permitir ratones para recuperarse de la pérdida de peso corporal y cambios en sangre parámetros12.
1. preparación para la prueba de tolerancia a glucosa Intraperitoneal (ipGTT)
Nota: Después de 12 h de ayuno, la ipGTT completa toma aproximadamente 2 h.
<ol><li>Puesto que el estrés influye significativamente en glucosa en la sangre, asegúrese de que tanto la adaptación de ratones, así como la formación del científico, se realizan.</li>
	<li>Transferencia de los animales a la zona experimental bajo condiciones tranquillas y sin estrés.</li>
	<li>Considerar la aplicación de una dieta hipercalórica para inducir obesidad en ratones. Consulte la sección de discusión para más información.</li>
	<li>Animales rápidos para 12 h noche a la mañana, sin limitar el acceso al agua. Al día siguiente, después de 12 h de ayuno, prepare el medidor de glucosa de la sangre según el fabricante de protocolo (véase tabla de materiales) introduciendo una nueva tira reactiva en el puerto de la tira de prueba.</li>
	<li>Haga una incisión en la punta de la cola con unas tijeras estériles, manteniendo ligeramente el ratón en su cola y medir inmediatamente la glucemia ayunas aplicando una gota de sangre de flujo libre (mínimo de la muestra tamaño 0.5 μl) a la tira de prueba de medidor de glucosa en la sangre. Nota: Un temporizador de cuenta atrás comienza en la pantalla después de la aplicación suficiente de la muestra de sangre. Después de 4 s, el resultado aparece en la pantalla.</li>
	<li>Luego, pesar y etiquetar los animales individualmente con el color de la marca.</li>
	<li>Administrar 2 g glucosa/kg cuerpo peso mediante inyección intraperitoneal. Asegúrese de que el volumen de inyección es de 0,1 mL/10 g de peso (aguja de 27 G y jeringa de 1 cc).</li>
	<li>Posteriormente, medida de glucosa en sangre después de 15, 30, 60 y 120 min, aplicando una gota de sangre de flujo libre en una nueva tira reactiva. Nota: Flujo de sangre puede aumentarse dando masajes suaves de las salas de punta de la cola. Si encrusts la herida de la cola, límpiela con un hisopo estéril empapado con solución de cloruro de sodio 0.9%.</li>
	<li>Permitir a los animales descansar en sus jaulas hogar con acceso ilimitado al agua entre las mediciones.</li>
</ol>2. pulmón función análisis a medida Res y cDyn
Nota: Para medir Res y cDyn, ratones que deba ventilarse bajo anestesia profunda. Manejo de animales libre de estrés y un seguimiento adecuado de la anestesia son esenciales. Instrucciones generales técnicas estériles, consulte el artículo de Hoogstraten-Miller et al. 15
<ol><li>Calibrar el pletismógrafo antes de cada serie de experimentos y preparar la configuración de estudio dentro del software (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Antes de la cirugía, profundamente anestesiar animales mediante inyección intraperitoneal de xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y ketamina (100 mg/kg de peso corporal) (aguja de 27 G y jeringa de 1 cc). Asegúrese de que el volumen de inyección es de 0,1 mL/10 g por peso corporal. Nota: Dado que la ketamina tiene un adecuado efecto analgésico en ratones, ningún tratamiento adicional es necesario. El procedimiento invasivo catéter traqueal/pletismógrafo toma aproximadamente 5-7 minutos, luego de adquisición de datos puede comenzar.</li>
	<li>Coloque el ratón en la posición supina sobre una almohada para mantener la temperatura corporal.</li>
	<li>Cubrir los ojos con ungüento para evitar la sequedad bajo anestesia.</li>
	<li>Monitoree constantemente la profundidad de la anestesia con la respuesta de pellizco del dedo del pie. Nota: La administración adicional de anestésicos puede ser necesaria para mantener un plano quirúrgico de anestesia.</li>
	<li>Humedezca la piel del área quirúrgica en la región de la tiroides con etanol al 70%.</li>
	<li>Cuidadosamente haga una incisión en la piel en la línea media de aproximadamente 1 cm entre la muesca yugular del esternón y el symphyses del tubérculo de la mentum levantando con pinzas y corte la piel en una inspección visual con unas tijeras embotadas (figura 1A).</li>
	<li>Visualizar el tejido adiposo subcutáneo subyacente y la glándula tiroides.</li>
	<li>Exponer la tráquea separando con cuidado embotado ambos lóbulos de la tiroides en el Istmo y la disección de los sternothyroid y sternothyroid músculos (figura 1B). Tenga cuidado de no dañar cualquier vasos y causar sangrado, ya que esto puede causar efectos adversos sobre el sistema cardiovascular y en última instancia en las medidas.</li>
	<li>Posteriormente, pasar una sutura quirúrgica trenzada 4-0 entre la tráquea y del esófago usando fórceps romos. Con cuidado haga una incisión en la tráquea cerca de la laringe entre los cartílagos traqueales con micro tijeras.</li>
	<li>Intubar con un tubo traqueal (0,04 pulgadas/1,02 mm de diámetro) bajo control visual (figura 1). Fijar el tubo a través de la ligadura con sutura quirúrgica para evitar cualquier fuga en el sistema.</li>
	<li>A continuación, mueva al animal a la cama caliente de la cámara de cuerpo y conectar el tubo traqueal a la placa frontal (figura 1) y encender la ventilación pulsando la tecla de ventilación en el panel frontal del controlador (Figura 1E).</li>
	<li>Estudio de la ventilación mediante la observación del movimiento del tórax al mismo tiempo con la tasa de ventilación. Para confirmar la colocación correcta del tubo traqueal, asegúrese de que ambos lados del tórax se mueven simultáneamente.</li>
	<li>Vigilar la presión de señal en la pantalla del ordenador (Figura 1F). Que sean las curvas de ventilación uniforme. Si este no es el caso, separar el animal y comprobar el lado de la cirugía. Cuidado con sangre o moco que bloquea el tubo traqueal. Nota: Para animales adultos con un peso de 20-25 g, los ajustes del ventilador como se muestra en la figura 2 se proponen según las recomendaciones del fabricante.</li>
	<li>Para control de cambios en la presión trans pulmonar durante la ventilación, inserte un tubo del esófago (0,04 pulgadas/1,02 mm de diámetro) en el esófago a la profundidad que se aproxima a los niveles de los pulmones. Miren la pantalla colocando el tubo. Coloque el tubo donde se aprecia desviación de la presión máxima y mínima corazón artefactos en la pantalla.</li>
	<li>Después de la cirugía, preparar al animal para la medición. Re anestesia mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) utilizando una aguja de 27 G y jeringa de 1 cc. Asegúrese de que el volumen de inyección es de 0,1 mL/10 g por peso corporal. Nota: Para evaluar la hyperreagibility bronquial, nebulizar metacolina, un agonista no selectivo de los receptores muscarínicos del sistema nervioso parasimpático, que induce broncoconstricción. Adquisición de datos se realiza en cuatro fases (figura 3).</li>
	<li>Iniciar la adquisición de datos según el protocolo de manufacturer´s. Nota: El software de guía automáticamente a los usuarios a través del proceso de adquisición.</li>
	<li>Aplicar 10 μl de PBS (vehículo) en el nebulizador y comenzar la nebulización después de 5 minutos de aclimatación. A continuación, sigue una fase de respuesta de 3 minutos, donde se miden Res (cmH2O/mL/s) y cDyn (mL/cmH2O). Al final, dar una fase de recuperación de 3 minutos al animal antes de la próxima nebulización.</li>
	<li>Siga el software de aplicación paso a paso de 10 μl de aumentar las concentraciones de metacolina (2,5 μg/10 μl, 6,25 μg/10 μl y 12,5 μg/10 μl) en el ventilador.</li>
	<li>Una vez que todas las mediciones se han realizado y registrado, sacrifican los animales por dislocación cervical.</li>
</ol>3. pulmón aislamiento cuantitativo análisis histomorfométrico de ratones adultos
<ol><li>Profundamente anestesiar el animal mediante inyección intraperitoneal de xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y ketamina (100 mg/kg de peso corporal) (aguja de 27 G y jeringa de 1 cc). El volumen de inyección debe ser de 0,1 mL/10 g por peso corporal. Nota: Después de alcanzar el estado de tolerancia quirúrgica, la preparación lleva unos 5 min seguido de perfusión de órganos y 30 min para la fijación.</li>
	<li>Una vez que el animal ha alcanzado el estado de tolerancia quirúrgica (toe negativo pizca-respuesta), desinfectar el animal con etanol al 70% y para fijar el animal en una plataforma con cinta quirúrgica.</li>
	<li>Sacrificar el animal por punción cardíaca y hemorragias. Brevemente, abrir el abdomen con una incisión medial a través de la piel y el peritoneo con tijeras embotadas.</li>
	<li>Ubicar las salas jefe del diafragma del hígado y separar cuidadosamente el hígado del diafragma.</li>
	<li>Hacer una pequeña incisión en el diafragma usando tijeras embotadas, y punteado el ventrículo izquierdo del corazón con una aguja de 20 G conectada a una jeringa de 2 mL. Poco a poco exsanguinate el animal. Nota: Exsanguination lento y cuidadoso es importante para evitar que los ventrículos que se derrumban debido a la presión negativa, inhibiendo un flujo de sangre.</li>
	<li>Diseccionar el pulmón abriendo el tórax suavemente a través de una incisión paraesternal a lo largo de toda la longitud de la caja torácica usando tijeras curvas, romos.</li>
	<li>Luego, levantar la caja torácica para exponer la cavidad pleural (figura 3). Quitar el timo para ver el corazón y los pulmones. Nota: Opcional inyección del ventrículo derecho, seguido de perfusión del sistema vascular pulmonar con PBS helada y luego con una solución fijadora [e.g., paraformaldehído al 4% (masa/volumen) (PFA)] es posible. Tenga en cuenta que existe un mayor riesgo a ruptura de septos alveolares y afectar estructura pulmonar usando este método.</li>
	<li>Disecar cuidadosamente el pulmón primero quitar el corazón.</li>
	<li>Posteriormente, pasar una sutura quirúrgica trenzada 4-0 entre la tráquea y del esófago usando fórceps romos.</li>
	<li>A continuación, con cuidado haga una incisión en la tráquea, cerca de la laringe entre los cartílagos traqueales, intubar con una cánula intravenosa (26 G) e inflar el pulmón por la fijación de la presión a una presión constante de 20 cm H2O mediante agente fijador [p. ej., 4% (masa /Volume) de PFA].</li>
	<li>Para la fijación de la PFA, dejar el fijador durante 30 min a temperatura ambiente. Ligar la tráquea y luego, retirar la cánula. Luego, suprimir el pulmón cuidadosamente sin dañar el tejido y almacenar en agente fijador a 4 ° C durante la noche. Nota: Como alternativa, según la ATS/ETS consenso papel 2.5% GA tamponado con OsO4, solución de uracilo se utiliza para la estabilización de tejido apropiado. Para preparación de tejido adicional, consulte el documento de consenso por Hsia et al. 14
</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este informe proporciona tres protocolos para tres diferentes métodos analizar el impacto de la obesidad sobre el metabolismo de la glucosa y resultados pulmonares. En primer lugar, la prueba de tolerancia a la glucosa ofrece la oportunidad de analizar la captación de glucosa intracelular y puede ser indicativa de resistencia a la insulina. En segundo lugar, pletismografía del cuerpo entero es una técnica para medir la función pulmonar y es así útil para probar la eficacia de nuevos tratamientos. En tercer lugar, un prot...

Según la Salud Organización Mundial (OMS) en 2008, más de 1,4 billones de adultos, más de 20 años, tenían sobrepeso con índice de masa corporal (IMC) mayor o igual a 25; Además, más 200 millones de hombres y casi 300 millones de mujeres eran obesos (BMI≥30)1. Obesidad y síndrome metabólico son factores de riesgo para una multitud de enfermedades. Obesidad y tejido adiposo blanco aumento concomitante masa ha estado íntimamente vinculado al tipo 2 diabetes2,3, enfermedades cardiovasculares incluyendo la enfermedad cardíaca coronaria (CHD), insuficiencia cardiaca (IC), fibrilación auricular4 y artrosis5, su papel funcional en la patogenesia de desórdenes respiratorios siguen siendo mal entendidos. Sin embargo, estudios epidemiológicos han demostrado que la obesidad está fuertemente asociada con enfermedades respiratorias crónicas, incluyendo disnea del exertional, síndrome de apnea obstructiva del sueño (SAOS), síndrome de obesidad hipoventilación (SOH), crónica enfermedad pulmonar obstructiva (EPOC) y embolia pulmonar, neumonía por aspiración, asma bronquial6,7,8,9. Posibles mecanismos de vinculación de obesidad y metabolismo perturbado, por ejemplo, resistencia a la insulina y tipo diabetes II, a la patogenesia de la enfermedad pulmonar crónica comprenden no sólo las consecuencias mecánicas y físicas de peso aumento en la ventilación sino también inducir un estado inflamatorio subagudo crónico10,11. El aumento de la obesidad y las enfermedades pulmonares durante la última década, juntadas con la falta de estrategias preventivas eficaces y enfoques terapéuticos, destaca la necesidad de investigar los mecanismos moleculares para definir nuevas vías para la gestión de pulmón relacionados con la obesidad enfermedades.
Aquí, Describimos tres pruebas estándares, que son bases importantes para investigar la obesidad y su impacto en la estructura pulmonar y la función en modelos de ratón: (1) intraperitoneal glucosa tolerancia (ipGTT) (2) medición de la resistencia (Res) de la vía aérea y respiratorio cumplimiento del sistema (Cdyn); y (3) preparación y fijación del pulmón para evaluación histológica cuantitativa posterior. La ipGTT es una prueba de detección robusta a la captación de glucosa medida y así el efecto de la obesidad sobre el metabolismo. La simplicidad del método permite buena estandarización y por lo tanto la comparabilidad de resultados entre laboratorios. Métodos más sofisticados, tales como abrazaderas de hyperglycemic o estudios en islotes aislados, pueden utilizarse para un análisis detallado del fenotipo metabólico12. Aquí evaluar tolerancia a la glucosa para definir un estado de obesidad asociados de trastorno metabólico y sistémico como la base para estudios posteriores en un resultado pulmonar. Para evaluar el efecto de la obesidad y desorden metabólico sobre la función pulmonar, se evaluó la resistencia de vía aérea (Res) y cumplimiento del sistema respiratorio (Cdyn). Para caracterizar la enfermedad pulmonar, están disponibles sin restricciones, así como restringidos métodos para la evaluación de la función pulmonar. Pletismografía libre libremente mover animales imita un estado natural, lo que refleja patrones de respiración; en contraste, métodos invasivos, tales como medición de la impedancia de entrada de Res y cDyn en ratones profundamente anestesiados para evaluar la mecánica pulmonar dinámica, son más exactos13. Enfermedades respiratorias crónicas son reflejados por alteraciones histologic del tejido pulmonar, fijación de pulmón adecuada para su posterior análisis es inminente. La elección del método de fijación del tejido y la preparación depende del compartimiento del pulmón que se estudiará, por ejemplo, conducción de las vías respiratorias o de parénquima pulmonar14. Aquí, describimos un método que permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de las vías aéreas conductoras para estudiar el efecto de la obesidad en el desarrollo de asma.

<table><tbody><tr><td>GlucoMen LX</td><td>A.Menarini diagnostics, Firneze, Italia</td><td>38969</td><td>glucemia</td></tr><tr><td>GlucoMen LX Sensor</td><td>A.Menarini diagnostics, Firneze, Italia</td><td>39765</td><td>Tiras reactivas</td></tr><tr><td>Glucosa 20%</td><td>B. Braun, Melsung, Alemania</td><td>2356746</td><td></td></tr><tr><td>FinePointe Software</td><td>DSI, MC s&acute; Hertogenbosch, Países Bajos</td><td>601-1831-002</td><td></td></tr><tr><td>FinePointe RC Mesa de ratón de un solo sitio</td><td>DSI, MC s&acute; Hertogenbosch, Países Bajos</td><td>601-1831-001</td><td></td></tr><tr><td>Controlador FPRC</td><td>DSI, MC S&acute; Hertogenbosch, Países Bajos</td><td>601-1075-001</td><td></td></tr><tr><td>FPRC Aerosol Block</td><td>DSI, MC s&acute; Hertogenbosch, Países Bajos</td><td>601-1106-001</td><td></td></tr><tr><td>Aerogen neb head-5.2-4um</td><td>DSI, MC s&acute; Hertogenbosch, Países Bajos</td><td>601-2306-001</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>FST, Columbia Británica, Canadá</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras romas</td><td>FST, Columbia Británica, Canadá</td><td>14105-12</td><td></td></tr><tr><td>Microtijeras</td><td>FST, Columbia Británica, Canadá</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Hand 4-0</td><td>Ethicon, Puerto Rico, Estados Unidos</td><td>736H</td><td>Sutura quirúrgica</td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4%</td><td>Roth</td><td>P087.1</td><td>4% Paraformaldehído</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Zoetis, Berlín, Alemania</td><td>10013389</td><td>Ketamina</td></tr><tr><td>Rompun 2%</td><td>Bayer, Leverkusen, Alemania</td><td>770081</td><td>Xilacina</td></tr></tbody></table>

prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesidad y trastornos respiratorios son importantes problemas de salud. La obesidad se está convirtiendo en una epidemia emergente con el número esperado de individuos obesos más 1 billón en todo el mundo en 2030, lo que representa una carga socioeconómica creciente. Al mismo tiempo, relacionadas con la obesidad comorbilidades, incluyendo diabetes, así como corazón y enfermedades pulmonares crónicas, están continuamente en aumento. Aunque la obesidad se ha asociado con mayor riesgo de las exacerbaciones del asma, empeoramiento de los síntomas respiratorios y un control deficiente, el papel funcional de la obesidad y el metabolismo perturbado en la patogenesia de la enfermedad pulmonar crónica es a menudo subestimado, y los mecanismos moleculares subyacentes permanecen fuera de alcance. Este artículo pretende presentar métodos para evaluar el efecto de la obesidad sobre el metabolismo, así como la estructura pulmonar y función. Aquí, Describimos tres técnicas para los estudios de ratones: (1) evaluación de la tolerancia a la glucosa intraperitoneal (ipGTT) para analizar el efecto de la obesidad sobre el metabolismo de la glucosa; (2) medición de la resistencia de vía aérea (Res) y cumplimiento del sistema respiratorio (Cdyn) para analizar el efecto de la obesidad sobre la función pulmonar; y (3) preparación y fijación del pulmón para evaluación histológica cuantitativa posterior. Enfermedades pulmonares relacionadas con la obesidad son probablemente multifactoriales, de desregulación inflamatoria y metabólica sistémica que potencialmente negativamente influyen en la función pulmonar y la respuesta al tratamiento. Por lo tanto, una metodología estandarizada para el estudio de mecanismos moleculares y el efecto de nuevos tratamientos es esencial.

Resultados representativos de la prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal (ipGTT) (figura 4), imágenes de prueba (figura 5) y representante de la función de pulmón que ilustran hematoxilina y eosina teñidos pulmones (figura 6).
La ipGTT fue realizado en ratones obesos (azul) después de 7 semanas de dieta alta en grasa (HFD). Ratones a...

La incidencia de la obesidad está aumentando y aumenta el riesgo de enfermedades pulmonares crónicas. Establecer los mecanismos subyacentes y estrategias preventivas, el animal bien definido son necesarios modelos. Presentamos tres métodos (prueba de tolerancia a la glucosa, pletismografía corporal y fijación del pulmón) para estudiar el efecto de la obesidad sobre los resultados de pulmonares en ratones.

Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

El objetivo general de los siguientes tres métodos es estudiar el impacto de la obesidad y los trastornos metabólicos en la estructura y función pulmonar. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación respiratoria sobre el impacto de los trastornos metabólicos en la estructura pulmonar y la función pulmonar. La ventaja de estas técnicas es que pueden combinarse para evaluar el papel funcional del metabolismo en la patogénesis de las enfermedades pulmonares crónicas y para probar diferentes enfoques terapéuticos.Las implicaciones de estas técnicas se extienden más allá del fenotipado hasta lo que está dilucidando el papel funcional específico de las dianas metabólicas en la patogénesis de las enfermedades pulmonares. Estos métodos también se pueden aplicar al estudio de la estructura y la función tanto en animales sanos con modificaciones genéticas como en modelos animales de EPOC y asma. Generalmente, las personas nuevas en estos métodos tendrán dificultades como la inserción del tubo traqueal, la insuflación del pulmón y la administración de la anestesia profunda, todos requieren experiencia y entrenamiento.La primera vez que tuvimos la idea de estos métodos fue cuando descubrimos que la obesidad de inicio temprano en ratones, pero también en humanos, estaba íntimamente relacionada con el metabolismo de impacto y con enfermedades pulmonares crónicas más allá de la infancia. Para medir la tolerancia a la glucosa intraperitoneal, sujete suavemente a un ratón adulto en ayunas durante 12 horas por la cola y use tijeras estériles para incidir la punta de la cola. Aplique inmediatamente una gota de sangre que fluya libremente a la tira reactiva del medidor de glucosa en sangre para medir el nivel de glucosa en sangre en ayunas.El resultado de la prueba aparecerá en la pantalla del glucómetro después de cuatro segundos. Después de medir la glucosa de cada animal, etiquételos individualmente con marcadores de colores y pese a los animales. A continuación, utilice una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro para administrar 100 microlitros de glucosa por tonelada de gramos de peso corporal a cada animal mediante inyección intraperitoneal y mida los niveles de glucosa en sangre 15, 30, 60 y 120 minutos después con nuevas tiras reactivas como se acaba de demostrar.Para evaluar la función pulmonar, coloque un ratón adulto en posición supina sobre una almohadilla y aplique ungüento en los ojos del animal. Después de confirmar una falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, humedecer el pelaje en la región tiroidea con etanol al 70% y usar fórceps para levantar la piel en la línea media entre la muesca yugular en el esternón y la sínfisis del tubérculo del mentón. Con unas tijeras romas, haga con cuidado una incisión cutánea de un centímetro en la piel para visualizar el tejido adiposo subcutáneo subyacente y la glándula tiroides y exponga la tráquea con una separación roma cuidadosa de ambos lóbulos tiroideos en el istmo y la disección de los músculos esternotiroideo y esternotiroideo.Con pinzas afiladas, pase una sutura quirúrgica trenzada 4-0 entre la tráquea y el esófago y haga una incisión cuidadosa en la tráquea cerca de la laringe entre los cartílagos traqueales con microtijeras. Intuble con un tubo traqueal asegurando el tubo con una sutura quirúrgica y traslade al animal al lecho caliente de una cámara corporal. Conecte el tubo traqueal a la placa frontal y encienda el ventilador.Confirme el movimiento del tórax simultáneamente con la frecuencia de ventilación para confirmar la colocación correcta del tubo traqueal y observe la señal de presión en la pantalla de la computadora. Para controlar los cambios en la presión transpulmonar durante la ventilación, inserte un tubo esofágico a la altura de los pulmones observando la pantalla para facilitar la colocación del tubo donde se pueda observar la deflexión máxima de la presión y los artefactos cardíacos mínimos. Comience la adquisición de datos de acuerdo con las instrucciones del fabricante y aplique 10 microlitros de PBS en el nebulizador.Iniciar la nebulización después de cinco minutos de aclamación, seguida de una fase de respuesta de tres minutos durante la cual se miden la resistencia de las vías respiratorias y la distensibilidad del sistema respiratorio. Deje que el animal se recupere durante tres minutos antes de comenzar la siguiente nebulización y siga las instrucciones del software para la aplicación gradual de concentraciones crecientes de 10 microlitros de metacolina en el ventilador. Para el análisis histomorfométrico cuantitativo del tejido pulmonar, use tijeras romas para hacer una pequeña incisión en el diafragma de un ratón adulto y use tijeras romas curvas para hacer una incisión periesternal, a lo largo de toda la caja torácica para abrir suavemente el tórax.Levante la caja torácica para exponer la cavidad pleural y extraer el timo. Después de extraer el corazón, use pinzas afiladas para preparar y exponer la tráquea con el fin de pasar una sutura quirúrgica trenzada 4-0 entre la tráquea y el esófago, seguida de una incisión cuidadosa de la tráquea cerca de la laringe entre los cartílagos traqueales. Intuble con una cánula intravenosa de calibre 26 y use un agente fijador para inflar los pulmones mediante la fijación de presión a una presión constante de 20 centímetros de agua.Después de 30 minutos a temperatura ambiente, ligar la tráquea y retirar la cánula al mismo tiempo. A continuación, extirpe cuidadosamente los pulmones sin dañar el tejido y almacene los pulmones en un agente fijador fresco a cuatro grados centígrados durante la noche. Los ratones obesos muestran un aumento en los niveles de glucosa sérica 15 y 30 minutos después de la inyección de glucosa intraperitoneal, lo que indica una absorción de glucosa celular alterada en comparación con los ratones alimentados con dieta estándar.El análisis invasivo de la función pulmonar muestra un aumento de hasta 1,5 veces la resistencia de las vías respiratorias en ratones obesos alimentados con una dieta alta en grasas después de la estimulación con metacolina en comparación con los animales de control. La tinción con hematoxilina y eosina de las secciones del parénquima pulmonar después de la instalación intratraqueal revela múltiples áreas no infladas, tabiques alveolares gruesos y alvéolos de forma poligonal en los pulmones instilados con muy poca presión. Por el contrario, demasiada presión de instilación conduce a áreas sobreinfladas con tabiques alveolares destruidos.Sin embargo, la aplicación de la cantidad adecuada de presión durante la fijación pulmonar conduce a un pulmón completamente inflado con alvéolos de forma redonda. Una vez dominadas, las pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal se pueden completar en dos horas y media. Las pruebas de función pulmonar se pueden completar en una hora y la insuflación pulmonar se puede completar en menos de una hora.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se recomienda adaptar a los ratones, entrenar al investigador y trabajar en un entorno tranquilo y con menos estrés para una adquisición óptima de datos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos del metabolismo y las enfermedades respiratorias exploraran los mecanismos implicados y la potencia de las estrategias de tratamiento de la enfermedad pulmonar crónica utilizando modelos animales pequeños. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar el impacto de la obesidad y los trastornos metabólicos en la estructura y función pulmonar.No olvide que trabajar con animales o instrumentos quirúrgicos puede causar lesiones o reacciones en la piel y que siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado, mientras se realizan estos procedimientos.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video presenta cómo realizar una prueba de tolerancia oral a la glucosa en un ratón de laboratorio.

Prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT): medición del metabolismo de la glucosa en ratones

El objetivo de este protocolo es presentar un método estándar para realizar pruebas de tolerancia a la glucosa por vía intravenosa (IVGTTs) para evaluar el control glucémico en los primates no humanos y evaluar su estado metabólico de ser saludables para dismetabólico.

Caracterización del estado metabólico en primates no humanos con la prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa

Este estudio describe un protocolo que utiliza 18F-FDG e imágenes de tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT), junto con modelos cinéticos, para cuantificar la absorción in vivo y en tiempo real de 18F-FDG en los tejidos.

La determinación de metabolismo de la glucosa Kinetics Uso<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Micro-PET / CT

El área de superficie pulmonar interna (ISA) es un criterio crítico para evaluar la morfología pulmonar y la fisiología en las enfermedades pulmonares y la regeneración alveolar inducida por lesiones. Describimos aquí un método estandarizado que puede minimizar el sesgo de medición para ISA tanto en neumonectomía pulmonar como en modelos de ratón de implantación de prótesis.

Un método estandarizado para medir el área de la superficie pulmonar interna mediante neumonectomía y prótesis de ratón

El actual artículo describe la generación y caracterización metabólica de ratones alimentados con dieta alta en grasas como un modelo de resistencia a la insulina inducida por la dieta y la obesidad. Además cuenta con protocolos detallados para realizar la prueba de tolerancia oral a la glucosa y la prueba de tolerancia a insulina, monitoreo de todo el cuerpo alteraciones del metabolismo de la glucosa en vivo.

Estudio In Vivo del metabolismo de glucosa en ratones alimentados con dieta alta en grasas mediante prueba de tolerancia a la glucosa Oral (OGTT) y prueba de tolerancia a insulina (ITT)

Este protocolo describe el uso de un analizador de composición corporal y el sistema metabólico de control animal para caracterizar la composición corporal y parámetros metabólicos en ratones. Un modelo de obesidad inducido por la alimentación alta en grasas se utiliza como un ejemplo para la aplicación de estas técnicas.

Composición corporal y análisis jaulas metabólico en ratones de reserva grasa alta

El agotamiento extracelular de la glucosa marcada fluorescentemente se correlaciona con la absorción de glucosa y podría usarse para la detección de alto rendimiento de la absorción de glucosa en órganos extirpados y cultivos celulares.

El agotamiento extracelular de glucosa como medida indirecta de la absorción de glucosa en células y tejidos ex vivo

Este protocolo presenta un método para evaluar la reserva alveolar-capilar pulmonar medida mediante la medición combinada de una sola respiración de la capacidad de difusión de monóxido de carbono (DL,CO) y óxido nítrico (DL,NO) durante el ejercicio. Los supuestos y recomendaciones para el uso de la técnica durante el ejercicio constituyen la base de este artículo.

Medición de la capacidad de difusión pulmonar de gas de prueba dual durante el ejercicio en humanos utilizando el método de respiración única

La tomografía de impedancia eléctrica es una herramienta de monitorización de la ventilación pulmonar en tiempo real, no invasiva, libre de radiación. Al medir los cambios de impedancia en el tórax, puede visualizar la distribución del aire respiración por respiración. Inicialmente destinada a la monitorización de la ventilación, la tomografía de impedancia eléctrica también puede medir la perfusión mediante la inyección intravenosa de una solución salina.

Monitorización de la función pulmonar con tomografía de impedancia eléctrica en la unidad de cuidados intensivos

Las pruebas de diagnóstico actual sensibilidad a los antimicrobianos se basa en el crecimiento de plancton de las cepas en condiciones de nutrientes ricos y aeróbicas. En este caso, contamos con un medio alternativo de esputo artificiales para estudiar la susceptibilidad antimicrobiana de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa, tanto en condiciones aeróbicas y microaerófilos más representativos de la fibrosis quística pulmonar.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

Aprenda a realizar pruebas de tolerancia a glucosa intraperitoneal, pletismografía y fijación pulmonar para estudiar el impacto de la obesidad y los trastornos metabólicos en la función respiratoria.

Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares (Video) | JoVE Journal

Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares

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