Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares

El objetivo general de los siguientes tres métodos es estudiar el impacto de la obesidad y los trastornos metabólicos en la estructura y función pulmonar. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación respiratoria sobre el impacto de los trastornos metabólicos en la estructura pulmonar y la función pulmonar. La ventaja de estas técnicas es que pueden combinarse para evaluar el papel funcional del metabolismo en la patogénesis de las enfermedades pulmonares crónicas y para probar diferentes enfoques terapéuticos.

Las implicaciones de estas técnicas se extienden más allá del fenotipado hasta lo que está dilucidando el papel funcional específico de las dianas metabólicas en la patogénesis de las enfermedades pulmonares. Estos métodos también se pueden aplicar al estudio de la estructura y la función tanto en animales sanos con modificaciones genéticas como en modelos animales de EPOC y asma. Generalmente, las personas nuevas en estos métodos tendrán dificultades como la inserción del tubo traqueal, la insuflación del pulmón y la administración de la anestesia profunda, todos requieren experiencia y entrenamiento.

La primera vez que tuvimos la idea de estos métodos fue cuando descubrimos que la obesidad de inicio temprano en ratones, pero también en humanos, estaba íntimamente relacionada con el metabolismo de impacto y con enfermedades pulmonares crónicas más allá de la infancia. Para medir la tolerancia a la glucosa intraperitoneal, sujete suavemente a un ratón adulto en ayunas durante 12 horas por la cola y use tijeras estériles para incidir la punta de la cola. Aplique inmediatamente una gota de sangre que fluya libremente a la tira reactiva del medidor de glucosa en sangre para medir el nivel de glucosa en sangre en ayunas.

El resultado de la prueba aparecerá en la pantalla del glucómetro después de cuatro segundos. Después de medir la glucosa de cada animal, etiquételos individualmente con marcadores de colores y pese a los animales. A continuación, utilice una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro para administrar 100 microlitros de glucosa por tonelada de gramos de peso corporal a cada animal mediante inyección intraperitoneal y mida los niveles de glucosa en sangre 15, 30, 60 y 120 minutos después con nuevas tiras reactivas como se acaba de demostrar.

Para evaluar la función pulmonar, coloque un ratón adulto en posición supina sobre una almohadilla y aplique ungüento en los ojos del animal. Después de confirmar una falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, humedecer el pelaje en la región tiroidea con etanol al 70% y usar fórceps para levantar la piel en la línea media entre la muesca yugular en el esternón y la sínfisis del tubérculo del mentón. Con unas tijeras romas, haga con cuidado una incisión cutánea de un centímetro en la piel para visualizar el tejido adiposo subcutáneo subyacente y la glándula tiroides y exponga la tráquea con una separación roma cuidadosa de ambos lóbulos tiroideos en el istmo y la disección de los músculos esternotiroideo y esternotiroideo.

Con pinzas afiladas, pase una sutura quirúrgica trenzada 4-0 entre la tráquea y el esófago y haga una incisión cuidadosa en la tráquea cerca de la laringe entre los cartílagos traqueales con microtijeras. Intuble con un tubo traqueal asegurando el tubo con una sutura quirúrgica y traslade al animal al lecho caliente de una cámara corporal. Conecte el tubo traqueal a la placa frontal y encienda el ventilador.

Confirme el movimiento del tórax simultáneamente con la frecuencia de ventilación para confirmar la colocación correcta del tubo traqueal y observe la señal de presión en la pantalla de la computadora. Para controlar los cambios en la presión transpulmonar durante la ventilación, inserte un tubo esofágico a la altura de los pulmones observando la pantalla para facilitar la colocación del tubo donde se pueda observar la deflexión máxima de la presión y los artefactos cardíacos mínimos. Comience la adquisición de datos de acuerdo con las instrucciones del fabricante y aplique 10 microlitros de PBS en el nebulizador.

Iniciar la nebulización después de cinco minutos de aclamación, seguida de una fase de respuesta de tres minutos durante la cual se miden la resistencia de las vías respiratorias y la distensibilidad del sistema respiratorio. Deje que el animal se recupere durante tres minutos antes de comenzar la siguiente nebulización y siga las instrucciones del software para la aplicación gradual de concentraciones crecientes de 10 microlitros de metacolina en el ventilador. Para el análisis histomorfométrico cuantitativo del tejido pulmonar, use tijeras romas para hacer una pequeña incisión en el diafragma de un ratón adulto y use tijeras romas curvas para hacer una incisión periesternal, a lo largo de toda la caja torácica para abrir suavemente el tórax.

Levante la caja torácica para exponer la cavidad pleural y extraer el timo. Después de extraer el corazón, use pinzas afiladas para preparar y exponer la tráquea con el fin de pasar una sutura quirúrgica trenzada 4-0 entre la tráquea y el esófago, seguida de una incisión cuidadosa de la tráquea cerca de la laringe entre los cartílagos traqueales. Intuble con una cánula intravenosa de calibre 26 y use un agente fijador para inflar los pulmones mediante la fijación de presión a una presión constante de 20 centímetros de agua.

Después de 30 minutos a temperatura ambiente, ligar la tráquea y retirar la cánula al mismo tiempo. A continuación, extirpe cuidadosamente los pulmones sin dañar el tejido y almacene los pulmones en un agente fijador fresco a cuatro grados centígrados durante la noche. Los ratones obesos muestran un aumento en los niveles de glucosa sérica 15 y 30 minutos después de la inyección de glucosa intraperitoneal, lo que indica una absorción de glucosa celular alterada en comparación con los ratones alimentados con dieta estándar.

El análisis invasivo de la función pulmonar muestra un aumento de hasta 1,5 veces la resistencia de las vías respiratorias en ratones obesos alimentados con una dieta alta en grasas después de la estimulación con metacolina en comparación con los animales de control. La tinción con hematoxilina y eosina de las secciones del parénquima pulmonar después de la instalación intratraqueal revela múltiples áreas no infladas, tabiques alveolares gruesos y alvéolos de forma poligonal en los pulmones instilados con muy poca presión. Por el contrario, demasiada presión de instilación conduce a áreas sobreinfladas con tabiques alveolares destruidos.

Sin embargo, la aplicación de la cantidad adecuada de presión durante la fijación pulmonar conduce a un pulmón completamente inflado con alvéolos de forma redonda. Una vez dominadas, las pruebas de tolerancia a la glucosa intraperitoneal se pueden completar en dos horas y media. Las pruebas de función pulmonar se pueden completar en una hora y la insuflación pulmonar se puede completar en menos de una hora.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se recomienda adaptar a los ratones, entrenar al investigador y trabajar en un entorno tranquilo y con menos estrés para una adquisición óptima de datos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos del metabolismo y las enfermedades respiratorias exploraran los mecanismos implicados y la potencia de las estrategias de tratamiento de la enfermedad pulmonar crónica utilizando modelos animales pequeños. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar el impacto de la obesidad y los trastornos metabólicos en la estructura y función pulmonar.

No olvide que trabajar con animales o instrumentos quirúrgicos puede causar lesiones o reacciones en la piel y que siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado, mientras se realizan estos procedimientos.