Construcción de una plataforma de proyección de alto rendimiento para evaluar la heterogeneidad de la amplificación del gen HER2 en cáncer de mama
5 de diciembre de 2017
Distribución heterogénea de células HER-2 positivo se puede observar en un subgrupo de cánceres de mama y genera dilemas clínicos. Aquí, presentamos un protocolo fiable y rentable para definir, cuantificar y comparar la heterogeneidad genética de la intra-tumor HER2 en una serie grande de los cánceres de mama heterogéneo procesados.
El objetivo general de este procedimiento de laboratorio es definir, cuantificar y comparar simultáneamente la heterogeneidad genética intratumoral de HER2 en una gran serie de cánceres de mama procesados heterogéneamente mediante hibridación in situ de plata de alto rendimiento. Este método puede ayudar a abordar la elección clave de la traducción y la investigación del cáncer de mama, como el estudio de la heterogeneidad de la amplificación del gen HER2, una gran cohorte de casos recuperados de archivos de patología. La principal ventaja de esta técnica es que permite realizar un esquizoanálisis de HER2 de alto rendimiento en diferentes áreas topográficas de cánceres de mama múltiples y heterogéneos procesados.
Por lo general, las personas nuevas en la hibridación in situ tendrán dificultades porque los estudios retrospectivos suelen requerir el análisis de muestras de archivo que se sometieron a diferentes procedimientos de fijación, procesamiento y almacenamiento. La idea de este método fue cuando decidimos reclasificar todos los cánceres de mama de nuestra base de datos institucional desde el año 2003. La demostración de este procedimiento correrá a cargo de Giulia Ercoli, técnica de nuestro laboratorio.
Comience este protocolo con la selección de pacientes y muestras de tejido como se describe en el protocolo de texto. Cree y abra un nuevo archivo de hoja de cálculo, incorporando los registros de las distintas áreas de cada caso. Incluya columnas separadas para la identificación de caso, la identificación de bloque, la identificación de área, el tipo de tejido, la topografía, la morfología, el estado del biomarcador y todas las demás características inmunohistoquímicas disponibles.
Cree un proyecto de TMA. Defina los bloques de destinatarios de PMA navegando a archivo, nuevo, bloque. Haga clic en el primer campo para rellenar y escriba las dimensiones del bloque de parafina.
A continuación, cree un proyecto de matriz de tejidos navegando hasta archivo, nuevo, matriz de tejidos. Haga clic en el icono de importación y, a continuación, elija el archivo de plantilla del bloque destinatario creado anteriormente. Haga clic en Siguiente.
A continuación, elija un milímetro como tamaño de punto haciendo clic en el botón redondo. Elija 500 micras como espaciado de puntos, que es el espacio entre dos centros de puntos vecinos. A continuación, haz clic en el icono de la calculadora para calcular el número total de plazas creadas, que debe ser 231.
A continuación, haga clic en el botón definir para crear cuadrículas y subcuadrículas. Elimine las columnas ocho y 15 y la línea central. Mantenga tres puntos de la línea uno para orientarse.
El mapa final debería abarcar un número total de 183 lugares. Defina la lista de tipos de tejido navegando a archivo, nuevo, lista de tipos de tejido. A continuación, defina el proyecto navegando a archivo, nuevo, proyecto de refuerzo.
A continuación, prepare los bloques aceptores. Llene los moldes de metal limpios con parafina elástica a 65 grados centígrados. Deje que los bloques de parafina se enfríen a la temperatura de la película durante la noche dentro de los moldes de metal.
Al día siguiente, extraiga los bloques de parafina de los moldes metálicos. Construya el TMA utilizando un arreglo automatizado o semiautomatizado encendiendo primero el arreglo y luego insertando los bloques de aceptación en el carrusel del arreglador. Defina la posición inicial en cada bloque receptor utilizando las teclas de flecha para mover la luz láser y alinearla con el borde superior izquierdo de la parafina del bloque receptor.
Haga clic en siguiente y repita el proceso para la alineación vertical. Haga clic de nuevo en siguiente para crear automáticamente un agujero en la coordenada previamente definida del bloque receptor. Vacía el punzón.
Coloque el bloque donante para la toma de muestras y extraiga un núcleo de tejido del área de interés previamente anotada. Inserte el núcleo de tejido del donante en el orificio del bloque receptor. A continuación, retire el bloque donante del matriz.
Repita estos pasos hasta que se complete el TMA. Coloque el lado del tejido del bloque de TMA recién generado en un portaobjetos estéril en blanco y colóquelos en el horno de laboratorio a 45 grados centígrados durante cinco minutos. Presione suavemente el bloque en el portaobjetos durante cinco segundos para aplanar los núcleos de tejido.
Repita una vez para un total de dos veces. A continuación, cubra la superficie del tejido TMA con una fina capa de parafina elastizada a 65 grados centígrados. Deje el bloque TMA a temperatura ambiente durante dos horas.
Finalmente, transfiera el bloque TMA a cuatro grados centígrados durante 24 horas antes de realizar análisis histoquímicos e inmunohistoquímicos como se describe en el protocolo de texto. Coloque las láminas de TMA para analizar a 60 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, inicie el instrumento y el software de inmunostainer.
En la vista de inicio, haga clic en el botón protocolos y, a continuación, haga clic en crear/editar protocolos. Seleccione el procedimiento de cóctel ISH dual para modificar la plantilla básica. Marque la horneación en la lista de cajas y ajuste la temperatura a 63 grados centígrados durante 20 minutos.
A continuación, marque la desparafinación. A continuación, marque el acondicionamiento de la celda en la lista de cuadros. A continuación, marque el acondicionamiento de la célula CC2 y ajuste la temperatura a 86 grados centígrados y el tiempo de incubación a cuatro minutos.
Marque CC2 leve durante ocho minutos, estándar durante 12 minutos y extendido durante ocho minutos. Marque ISH-Protease tres en la lista de cajas y establezca el tiempo de incubación en 16 minutos. Seleccione el dinitrofenilo HER2 de la sonda y la digoxigenina del cromosoma 17.
Incubar durante 16 minutos y luego establecer la desnaturalización durante 20 minutos a 80 grados centígrados. Establezca el tiempo de incubación de la sonda en seis horas. A continuación, ajuste el tiempo de incubación del multímero SISH a 32 minutos.
Establezca el cromato de plata y el tiempo de incubación en cuatro minutos. A continuación, establezca el tiempo de incubación del multímero rojo en 24 minutos. Establezca el cromato rojo y el tiempo de incubación en ocho minutos.
A continuación, marque la contratinción en la lista de cajas, seleccione hematoxilina dos y establezca el tiempo de incubación en ocho minutos. Marque la contratinción posterior en la lista de cuadros, seleccione el reactivo azulado y establezca el tiempo de incubación en cuatro minutos. Por último, realizar el esquizoanálisis para HER2.
Evalúe la amplificación del gen HER2 como positiva si la proporción de la sonda de enumeración de cromosomas HER2 17 es mayor o igual a 2.0 con un número promedio de copias de HER2 mayor o igual a 4.0 señales por célula. Evalúe como negativo si la proporción de la sonda de enumeración del cromosoma HER2 17 es inferior a 2,0 con un número medio de copias de HER2 inferior a 4,0 señales por célula. Aquí se muestran micrografías representativas que muestran el análisis de hibridación in situ de plata de un cáncer de mama heterogéneo HER2.
En este ejemplo paradigmático, dos áreas distintas de cáncer de mama invasivo de alto grado sin ningún tipo especial muestran resultados diferentes en términos de amplificación del gen HER2, visualizados como puntos negros, en comparación con la sonda de enumeración centromérica 17, visualizada como puntos rojos. En particular, un área que pertenecía al núcleo tumoral y que mostraba un patrón de tinción irregular de citoqueratina siete estaba amplificada por HER2, mientras que un solo punto frente al frente invasivo mostraba un patrón de HER2 de tipo salvaje. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un esquizoanálisis legible de matrices marcadas con tejido que incorporan cánceres de mama múltiples y heterogéneamente procesados.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días hábiles desde la selección del caso. Aunque este método está optimizado para el cáncer de mama, se puede trasladar a otros tipos de cáncer en los que la heterogeneidad de HER2 es de vital relevancia, como el cáncer gástrico. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la evaluación simple de HER2 porque está diseñada para el mapeo integral de múltiples áreas topográficas en series más grandes de cánceres de mama.
Mientras asiste a este procedimiento, es importante evitar cualquier grieta en el bloque TMA. Incluso una mínima grieta en la parafina infiere la calidad, la reproducibilidad y la claridad general de la hibridación in situ. Después de este procedimiento, se pueden realizar imágenes de espectrometría de masas MALDI para responder preguntas adicionales sobre la proteómica del cáncer de mama, particularmente en términos de heterogeneidad intra e intertumoral.
No olvide que trabajar con punzones TMA y cera de parafina caliente puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes de nitrilo desechables al realizar este procedimiento.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo fiable y rentable para definir, cuantificar y comparar la heterogeneidad genética intratumoral de HER2 en cánceres de mama. El método utiliza hibridación in situ de plata de alto rendimiento para abordar dilemas clínicos derivados de la distribución heterogénea de células positivas para HER2.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación sobre el cáncer de mama
- Heterogeneidad genética
- Técnicas de hibridación in situ
Antecedentes
- Las células HER2-positivas presentan una distribución heterogénea en algunos cánceres de mama.
- Esta heterogeneidad representa desafíos para la toma de decisiones clínicas.
- Los métodos existentes pueden tener dificultades con muestras archivadas debido al procesamiento variable.
- Las técnicas de alto rendimiento pueden mejorar el análisis en múltiples muestras.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para analizar la heterogeneidad en la amplificación del gen HER2.
- Facilitar la investigación sobre el cáncer de mama mediante una cohorte amplia procedente de archivos de patología.
- Mejorar la fiabilidad del análisis de HER2 en entornos clínicos.
Métodos Utilizados
- Hibridación in situ de plata de alto rendimiento.
- Análisis de una amplia serie de casos de cáncer de mama.
- Comparación de la heterogeneidad genética de HER2 en diferentes áreas tumorales.
- Uso de muestras archivadas con diferentes métodos de fijación y procesamiento.
Resultados Principales
- El método permite una cuantificación eficaz de la heterogeneidad de HER2.
- El análisis de alto rendimiento revela variaciones significativas en la expresión de HER2.
- Los resultados pueden orientar las decisiones terapéuticas en el manejo del cáncer de mama.
- El protocolo es adaptable a diversas condiciones de procesamiento de muestras.
Conclusiones
- Este protocolo mejora la comprensión de la heterogeneidad del HER2 en el cáncer de mama.
- Proporciona una herramienta valiosa tanto para investigadores como para clínicos.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para investigar más a fondo las terapias relacionadas con HER2.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La heterogeneidad de HER2 en el cáncer de mama complica las decisiones terapéuticas y contribuye a resultados clínicos variables, lo que genera la necesidad de métodos de evaluación estandarizados y escalables. Esta plataforma SISH de alto rendimiento permite la cuantificación simultánea de la amplificación del gen HER2 en múltiples topografías tumorales y muestras archivadas, apoyando la validación preclínica de dianas y la estratificación de biomarcadores. Al proporcionar una cartografía cuantitativa y reproducible del estado de HER2, el método mejora la confiabilidad predictiva en los flujos de trabajo de investigación básica y traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los patrones de amplificación de HER2 en diferentes regiones del tumor para aclarar la validez del blanco y su relevancia biológica.
- Valor operativo: Apoya la desestimación funcional de blancos al cuantificar la variabilidad genética intratumoral en cohortes archivadas de cáncer de mama.
- Valor predictivo: Genera ratios de señales de HER2/cromosoma 17 y umbrales de número de copias para orientar decisiones de avance o interrupción en la selección de blancos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Produce formatos estandarizados de AMA optimizados para SISH, lo que permite la detección escalable del estado de HER2 en muestras heterogéneas.
- Resultado cuantitativo: Proporciona la relación HER2/cromosoma 17 y el número promedio de copias de HER2 por célula como puntos finales medibles para la validación del ensayo.
- Reutilización de plataforma: Adaptable a otros tipos de cáncer (por ejemplo, gástrico) donde la heterogeneidad de HER2 afecta la respuesta terapéutica, lo que favorece la portabilidad del ensayo entre diferentes indicaciones.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Correlaciona el estado de HER2 desde el descubrimiento hasta los modelos preclínicos, preservando la heterogeneidad espacial en tejidos incluidos en parafina (FFPE).
- Alineamiento de Biomarcadores: Se integra con la inmunohistoquímica (IHC) para ER, PR, Ki67 y HER2, permitiendo un perfilado multimodal de biomarcadores en cohortes archivados.
- Avance Ajustado al Riesgo: Identifica subpoblaciones HER2-negativas dentro de tumores aparentemente HER2-positivos, aportando información para estrategias de terapia combinada y mecanismos de resistencia.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad de descubrimiento a traslación, permitiendo la evaluación de la heterogeneidad de HER2 tras la identificación del objetivo y antes de las pruebas de eficacia preclínica, particularmente en la estratificación guiada por biomarcadores.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre patrones de amplificación de HER2 y heterogeneidad de vías en muestras de tumores primarios.
- Tamizaje: Asegura la reproducibilidad del ensayo mediante la construcción estandarizada de matrices de tejidos (TMA) y la ejecución estandarizada del protocolo SISH en especímenes procesados de forma variable.
- Análisis: Proporciona ratios cuantitativos de HER2/cromosoma 17 y umbrales de número de copias para permitir la comparación objetiva de la heterogeneidad genética.
- Investigación Traducional: Apoya la continuidad hacia trabajos preclínicos al vincular los patrones espaciales de HER2 con resultados funcionales en sistemas modelo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable y estandarizada para la evaluación de HER2 aplicable a múltiples indicaciones oncológicas y conjuntos de muestras archivadas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las vías impulsadas por HER2 al resolver la heterogeneidad genética intra-tumoral.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante la disposición automatizada de matrices TMA y condiciones SISH optimizadas.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción al proporcionar umbrales cuantitativos de HER2 para la estratificación de pacientes en estudios preclínicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos dirigidos a HER2 mediante la identificación de tumores con perfiles heterogéneos de amplificación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la construcción de matrices de microtejidos, hibridación in situ y análisis de patología digital.
- Depende de tintadores automatizados, dispositivos de matrizado TMA y sistemas de imagen capaces de detectar señales SISH.
- Necesita una estandarización entre equipos multidisciplinarios de patología, biología molecular y bioinformática para una interpretación consistente de los datos.
- Debe tener en cuenta las variaciones en la fijación, el procesamiento y el almacenamiento al comparar las señales de HER2 en muestras archivadas.
- Se limita a la evaluación de la amplificación de HER2 a nivel de ADN; no captura la expresión proteica ni la actividad de señalización sin ensayos complementarios de IHC o ensayos funcionales.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Design and Construct Tissue Microarrays (TMAs) Based on the Kononen Technique
6:20
Silver In Situ Hybridization (SISH) Analysis of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2)
9:11
Results: Analysis of Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers
10:00
Conclusion
