Name: Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a evaluar la actividad antiapoptótica de proteínas foráneas mediante un sistema de expresión inducido por choque térmico en células Sf9 de insecto. Este método controlado permite estudiar funciones proteicas en biotecnología.

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Agradecemos a Dr. Jian Horng Leu del Instituto de Biología Marina, Universidad Nacional de mar de Taiwán para proporcionar 3 construcciones de plásmido. Esta investigación fue apoyada por Grant 106-2311-B-197-001 - desde el Ministerio de ciencia y tecnología (MOST).

1. preparaciones
<ol><li>Cultivo de células de insecto<ol>
<li>Preparar 50 mL de medio de cultivo celular. Para ello, Añadir 500 μl de antibióticos (anfotericina B = 0,25 μg/mL, penicilina = 100 unidades/mL, estreptomicina 100 μg/ml) y 5 mL de suero bovino fetal inactivado con calor en medio de cultivo celular sin suero (sin FBS o antibióticos). Nota: Calentar el suero fetal bovino a 65 ° C por 30 min en un baño de agua antes de su uso.</li>
		<li>Mantener Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), células de insecto sf9. Separar aprox. 80% de las células del frasco de 25 cm2 de la célula cultura agitando el frasco y comprobar bajo microscopia ligera. Luego, transferir el 50% de la suspensión de células a un nuevo frasco de cultura 25 cm2 de la célula y permitir a las células a conectar durante 15 min a temperatura ambiente. Reemplazar el medio con 5 mL medio de cultivo de células frescas y crecer en una incubadora a 28 ° C. Células de paso cada 2 a 3 días dependiendo del crecimiento de la célula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de plásmidos para la transfección de la célula<ol>
<li>Insertar los fragmentos de la DNA de la blanco (e.g., Monacha xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gene y sus construcciones de eliminación) en pDHsp/V5-su polimerización en cadena-basado clonación método11. Comprobar el crecimiento de colonias transformadas por Colonia PCR usando PCR Master Mix (2 X) y la cartilla de pDhsp-F2/Op-IE2R preparada. Servicio de secuenciación comercial para confirmar las secuencias del plásmido. Nota: La tabla 1 enumera los cebadores para PCR y las construcciones correspondientes.</li>
		<li>Cultura única secuenciadas colonias bacterianas, que contienen construcciones citado plásmido (paso 1.2) en 200 mL LB que contiene medio seleccionan antibióticos (50 μg/mL), respectivamente.</li>
		<li>Extraiga la plásmidos de la culta e. coli mediante Midi Plasmid Kit según instrucciones12 del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar medio de placas mediante la mezcla de 1,5 mL de medio de cultivo celular y 8,5 mL de medio de cultivo celular sin suero.</li>
	<li>Preparar medio de cultivo celular de actinomicina D (ActD) agregando 1.5 μl de caldo ActD (1 mg/mL) en 10 mL de medio de cultivo celular (concentración final = 150 ng/mL). Almacenar a 4 ° C.</li>
</ol>2. expresión transitoria de proteínas
<ol><li>Siembra de células<ol>
<li>Recoger las células sf9 por agitación matraz cultura derrocar y bajar la suspensión de células a tubo de 50 mL y transferir 10 μl a hemocitómetro una pipeta P10. Contar el número de células bajo un microscopio de luz.</li>
		<li>Placa de 3 × 105 sf9 células en cada pozo de una placa de 24 pozos durante 15 min a temperatura ambiente. Reemplazar el medio con 0,5 mL de medio de la galjanoplastia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfección de plásmidos<ol>
<li>Reactivo de transfección celular diluida: diluir 8 μl de reactivo de transfección de células en 100 μl medio de cultivo celular sin suero y mezclar con un vórtex durante 1 s.</li>
		<li>Añadir 2 μg de plásmido ADN (pDHsp70-Ac-P35/V5-su o pDHsp70-Ly-IAP3/V5-su o pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-su o pDHsp70-Ly-IAP3-anillo/V5-su) en 100 μl de medio de cultivo celular sin suero y mezclar con un vórtex durante 1 s (figura 2).</li>
		<li>Combinan la DNA del plasmid diluido y el reactivo de transfección de células diluidas (210 μL) y mezclar con un vórtex para 1 s. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Agregar 210 μl de mezcla de reactivo de transfección de DNA gota a gota en las células mediante una pipeta P1000. Incubar a 28 ° C durante 5 h.</li>
		<li>Reemplazar el medio forro con 0,5 mL de medio de cultivo celular con una pipeta P1000. Sellar la placa de 24 pozos con cinta e incubar las células a 28 ° C durante 16 horas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Choque de calor las células transfected: poner la placa en un baño de agua de 42 ° C (flotando en la superficie del agua). Calentar durante 30 min y devolver la placa de 24 pocillos a la incubadora de 28 ° C.</li>
	<li>Detección de expresión de la proteína<ol>
<li>Después de 1 h o de shock térmico de 5 h, lavar las células con 0,5 mL de 1 x PBS tampón brevemente tres veces. Nota: Diluir 10 x tampón PBS 1 x buffer PBS mediante la adición de 1 mL de tampón de PBS 10 x 9 mL esterilizado ddH2O</li>
		<li>Lyse las células con 40 μl de 1 x tinte de carga SDS transfiriendo hacia arriba y hacia abajo. Nota: Diluir 4 x SDS carga tinte mezclando 30 μl de 1 x de tampón PBS y 10 μl de 4 x SDS tampón.</li>
		<li>Calentar las muestras de proteína a 98 ° C por 10 min en un bloque de calor, desactivación durante 1 min y poner en hielo para ensayo de Western blot.</li>
		<li>Mancha blanca /negra occidental análisis Siga el procedimiento de ensayo de Western blot de Eslami y Lujan13. Correr de SDS-PAGE gel14: un gel sometido a azul de Coomassie (control de carga para comprobar que la cantidad de muestras de proteína cargadas en cada bien es igual en cantidad) la coloración y la otra sometida a Western blot ensayo, según Eslami y Lujan13 .</li>
		<li>Detectar proteínas de fusión etiquetada V5 con anticuerpos anti-V5 (5 mg/mL) (dilución 1: 5000 en buffer TBST trabajar la concentración de 1 μg/mL) y conjugado de peroxidasa (HRP) cabra anti-conejo IgG-rábano (0,8 mg/mL) (dilución de 1:10000 en buffer TBST a trabajar concentración 0,08 μg/mL). Nota: Ajustar el porcentaje de poliacrilamida 17.5% cuando el peso molecular de la proteína a ser < 17 kDa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. anti-apoptotic análisis de actividad
<ol><li>Apoptosis inducida por el gen celular: Repita el procedimiento anterior de 2.1 a 2.3. Transfectar Co 1 μg de plásmido pDHsp/D-rpr/bandera-su ADN (que contiene gen de inductor de la apoptosis) con 1 μg de ADN plásmido [pDHsp70/V5-su vector (control negativo), pDHsp70-CA-P35/V5-su (control positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-su, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-su o pDHsp70-Ly-IAP3-anillo/V5-su, respectivamente.]. En el tratamiento de shock de calor después de 5 h, realizar el análisis de viabilidad de la célula (figura 2).</li>
	<li>Apoptosis de las células inducidas por químicos: Repita el procedimiento anterior de 2.1 a 2.3. En el paso 2.1.2, placa de 1 x 106 células sf9 en cada pocillo de una placa de 6 pozos. Transfectar 4 μg de plásmido ADN [pDHsp70/V5-su vector (control negativo), pDHsp70-CA-P35/V5-su (control positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-su, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-su o pDHsp70-Ly-IAP3-anillo/V5-su, respectivamente.]. En el choque de calor después de 5 h, tratar células sf9 con 2 mL de medio de cultivo celular ActD para 16 h y realizar el análisis de viabilidad de la célula (figura 2). Nota: Volumen mínimo para cubrir un pozo de placa de 6 pozos es de 1 mL.</li>
	<li>Realizar los experimentos de arriba anti-apoptotic ensayo actividad, incluyendo 3.1 y 3.2 en triplicado.</li>
</ol>4. Análisis de viabilidad de la célula
<ol><li>Lavar las células tratadas mediante la adición de 1 mL de tampón PBS de 1 x 1 min 3 veces. Resuspender las células transfiriendo 1 mL 1 x PBS de tampón que contiene 0,04% trypan azul y manchas durante 3 min a temperatura ambiente. Transferir la suspensión de células en un microtubo de 1.5 mL. Nota: Diluir la solución de azul de tripano 0.4% por 9 mL de 1 x PBS buffer y 1 mL 0.4% azul de tripano solución de mezcla.</li>
	<li>Transferir 10 μl trypan azul manchado suspensión al hemocitómetro con una pipeta P10 y contar las células viables intactas bajo un microscopio de luz.</li>
	<li>Análisis estadístico<ol>
<li>Calcular los datos registrados y se presentan como los medios ± S.D. para todos los cargos.</li>
		<li>Analizar los datos con el de dos colas prueba t de Student de Microsoft Excel. Definir datos estadísticamente significativos como P-valor < 0.05.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+gene+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li>
<li>Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheilmann%2C+DA+%22Virus+Taxonomy%3A+Eighth+Report+of+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses%22">Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses</a>. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).</li>
<li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNai%2C+YS+%22Biological+Control+of+Pest+and+Vector+Insects%22">Biological Control of Pest and Vector Insects</a>. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).</li>
<li>Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriesen%2C+PD+%22The+Baculoviruses%22">The Baculoviruses</a>. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).</li>
<li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li>
<li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt0188-47">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li>
<li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li>
<li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li>
<li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+%28IAP%29+from+the+tiger+shrimp%2C+Penaeus+monodon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li>
<li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li>
<li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13355-016-0403-x">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li>
<li>Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf">http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf</a> (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017).</li>
<li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+%28IAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

El concepto de calor basado en el choque pDHsp/V5-su/sf9 celular sistema primero fue descrito por Clem et en 19948. Comparación del promotor del gen baculovirales (IE1) y hsp70 de Drosophila demostraron que hsp70 tenía una eficacia más alta en células de mosquito10. Además, debido a la inducción del choque de calor, el tiempo de expresión de la proteína podría ser controlado precisamente después del tratamiento de choque de calor. Este si...

Dos sistemas de expresión de proteínas se han utilizado comúnmente para la producción de proteínas: sistemas de expresión de proteínas de célula procariota (sistema de expresión de genes deEscherichia coli ) y sistemas de expresión de proteínas eucariotas. Un sistema de expresión de proteínas eucariotas popular es la expresión del baculovirus vector sistema (BEVS)1. Primero se utilizaron los baculovirus como agentes de control biológico en todo el mundo de la agricultura y las plagas del bosque. En las últimas décadas, baculovirus fueron desarrollados como herramientas biotecnológicas para vectores de la expresión de la proteína así. Los genomas de baculovirus consisten en ADN circular de doble hebra y envuelta nucleocápside2. Hasta la fecha, más de setenta y ocho baculovirus aislados han sido secuenciados3. Basado en la cascada de temporal expresiones baculovirales gene en las células del insecto huésped, la transcripción del gen podría clasificarse en cuatro cascadas temporales, incluyendo inmediata temprana, genes retrasado-temprano, tarde y muy tarde4.
BEVSs fueron señalados para que los promotores de genes muy tarde (es decir, poliedro o p10 promotor) fueron utilizados para conducir los genes de la blanco, mientras que el baculovirus recombinante fue generada por recombinación homóloga. Expresión de proteínas extrañas en las células de los insectos por baculovirus recombinante es similar a la de proteínas de mamíferas en modificaciones post-traduccionales (adecuadas para la producción de glicoproteínas). Así, el baculovirus ha sido ampliamente utilizado5,6,7. Sin embargo, una limitación es la presencia de diferentes vías de N-glicosilación en células de insecto7.
Por lo tanto, se desarrolló un nuevo sistema de expresión de baculovirus, el sistema de expresión transitoria del gen. Este sistema expresa genes extranjeros en la unidad de promotores inmediata temprana baculovirales (promotor deie-1 ) en células de los insectos. Mediante este sistema, la proteína diana puede expresarse inmediatamente bajo el control del promotor es decir-1 mientras modifica el camino de N-glicosilación en células de los insectos, resultando en mejor oligosacáridos N-ligados7. Por otra parte, genes inmediatos tempranos baculovirales están transcritos por la polimerasa II del RNA de la célula huésped y no requieren ningún factor viral para activación4. Por lo tanto, las proteínas extranjeras pueden expresarse en células de los insectos dentro de poco tiempo. Hasta la fecha, el transitorio sistema de expresión del gene es una de las más importantes tecnologías para realizar análisis funcional de la proteína en el sistema de cultivo de baculovirus en vitro de la célula. El sistema se puede aplicar para analizar la función de baculovirus o proteínas extrañas. Uno de los sistemas de expresión génica transitoria disponible comercialmente se basa en los promotores de genes inmediatos tempranos (IE) de Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 y OpIE1 promotores).
Sin embargo, el menor nivel de expresión de genes foráneos en células de los insectos es todavía un problema cuando el sistema de expresión de gen transitoria basada en promotor de OpIE fue usado8,9,10. Por lo tanto, otro sistema de expresión transitoria del gen fue construido basado en el promotor de la Drosophila calor choque proteína 70 (hsp70) gen8,9. El promotor de la hsp70 funciona más eficientemente que el promotor baculovirales IE cuando inducida por choque del calor en células de los insectos10. En este sistema, los genes de la blanco se expresaron bajo la impulsión de 70 (Dhsp70) promotor de Drosophila calor choque. Genes foráneos pueden clonarse fácilmente en el plásmido de expresión génica transitoria por métodos de clonación basados en PCR. Además, el control de la sincronización para expresión génica puede realizarse por la inducción del choque de calor.
En este informe, seguir el enfoque y expresar tres diferentes truncamientos del gen baculovirales (inhibidor de la apoptosis 3, iap3 de Monacha xylina MNPV) mediante el sistema de expresión de proteína de choque transitorio de calor y más se aplican estas proteínas expresadas en el análisis de la actividad anti-apoptótica. Este sistema tampoco puede expresar las proteínas extranjeras rápidamente o ser más aplicado a la evaluación de la actividad de la proteína anti-apoptótica en las células sf9, teniendo también la posibilidad de ser aplicado a otros ensayos de actividad de la proteína.

<table><tbody><tr><td>Antibiótico-Antimicótico, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>para cultivo de células de insectos</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino certificado</td><td>Bioind</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td>medio de cultivo celular sin suero</td></tr><tr><td>Células Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular de 25cm2</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía de luz invertida</td><td>WHITED</td><td>WHITED WI-400</td><td></td></tr><tr><td>RBC HIT Célula competente</td><td>Bioman</td><td>RH618-J80</td><td>Escherichia coli (DH5&alpha;)</td></tr><tr><td>L.B. Caldo (Miller)</td><td>Bioman</td><td>LBL407</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Grado Bacteriológico</td><td>Bioman</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-zn-1</td><td>selección antibiótico</td></tr><tr><td>PCR Master Mix (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Geneaid Midi Plasmid Kit (Libre de Endotoxinas)</td><td>Geneaid</td><td>PIE25</td><td></td></tr><tr><td>Actinomicina D</td><td>SIGMA</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Corning de 50 mL</td><td>SIGMA</td><td>CLS430829-500EA</td><td>Tubos de 50 mL</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Gizmo Supply Co</td><td>B-CNT-SLDE-V2</td><td></td></tr><tr>Nunc<td>multiplato de 24 pocillos</td><td>, Thermo Fisher</td><td>142475</td><td>placa de 24 pocillos</td></tr><tr><td>Reactivo de celfectina II Reactivo</td> de <td>transfectina de células</td><td>10362100</td><td>Thermo Fisher</td></tr><tr><td>PBS-Fosfato-Tamponado Solución salina (10X) pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>4&times; SDS Colorante de carga</td><td>Bioman</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (membranas de transferencia de PVDF)</td><td>Membranas de PVDF</td> <td>IPVH00010 Merck Sistema</td><td></td></tr><tr><td>de células Mini Trans-Blot</td><td>BIO-RED</td><td>1703930</td><td>Dispositivo de transferencia</td></tr><tr><td>Solución Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-V5</td><td>SIGMA</td><td>V8137</td><td>anticuerpo</td></tr> <tr><td>anti-V5 de conejoCabra anti-conejo IgG-rábano picante peroxidasa (HRP)</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>817072</td><td></td></tr><tr><td>6-Pocillos Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>145380</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % solución de azul de tripano</td><td>AMRESCO</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>P10 pipetman</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>F123602</tr><tr><td>Cinta</td><td>Symbio</td><td>PPS7</td> cinta de <td>24 pocillos ( 19 mm&times; 36 M)</td></tr></tbody></table>

expresión transitoria de genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

El sistema de expresión transitoria del gen es una de las tecnologías más importantes para la realización de análisis funcionales de la proteína en el sistema de cultivo de baculovirus en vitro de la célula. Este sistema fue desarrollado para extranjeros expresan genes bajo el control del promotor baculovirales en plásmidos de expresión transitoria. Además, este sistema puede aplicarse a un análisis funcional de proteínas extrañas o baculovirus sí mismo. El sistema de expresión transitoria del gen más ampliamente y comercialmente disponible se desarrolla basado en el promotor de genes inmediatos tempranos (IE) de Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Sin embargo, se observó un nivel de baja expresión de genes foráneos en células de los insectos. Por lo tanto, un sistema de expresión transitoria del gen fue construido para mejorar la expresión de la proteína. En este sistema, plásmidos recombinantes fueron construidos para contener la secuencia de destino bajo el control del Drosophila calor choque 70 (Dhsp70) promotor. Este protocolo presenta la aplicación de este calor basado en el choque pDHsp/V5-su (epitope V5 con 6 histidina)Spodoptera frugiperda Handy sistema (células sf9); Este sistema está disponible no sólo para la expresión de genes sino también para la evaluación de la actividad de anti-apoptotic de candidato proteínas en células de los insectos. Además, este sistema puede ser bien transfectado con un plásmido recombinante o transfected Co dos plásmidos recombinantes potencialmente funcionalmente antagónicos en células de los insectos. El protocolo demuestra la eficacia de este sistema y proporciona un caso práctico de esta técnica.

Toda la longitud y otros dos truncamientos (dominios BIR y anillo) de Ly-IAP3 de LyxyMNPV se sobreexpresa en las células sf9, basado en el calor basado en el choque pDHsp/V5-suSpodoptera frugiperda Handy sistema (células sf9). PDHsp/V5-su contenido Drosophila calor choque proteína promotora, que impulsa la expresión del gen aguas abajo a una temperatura de 42 ° C condición mediante el uso de factores transcripcionales celulares y la traducción del sistema (<strong class=...

Este protocolo describe un calor proteína inducida por choque expresión sistema (pDHsp/V5-su/sf9 de la célula), que puede utilizarse para evaluar la actividad anti-apoptótica de posibles proteínas extrañas y su truncado amino o expresando proteínas extrañas ácidos en las células de los insectos.

Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

El objetivo general de este sistema de expresión de proteínas inducido por choque térmico es evaluar la actividad antiapoptótica de dos proteínas potencialmente antagónicas funcionalmente en células de insectos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las funciones y actividades de las proteínas candidatas en biotecnología y proteómica, como sus actividades antiapoptóticas y las interacciones proteicas. La principal ventaja de esta técnica es que el momento de la expresión génica está controlado por la inducción de choque térmico.Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el estado funcional de las proteínas. También se puede aplicar a otros sistemas, como la expresión de proteínas en mamíferos. Las células de insecto Spodoptera frugiperda, o Sf9, utilizadas en este protocolo se cultivan en medio de cultivo celular en matraces de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados a 28 grados centígrados.Agite el matraz de cultivo celular para separar las células del matraz. A continuación, compruebe con un microscopio óptico que aproximadamente el 80% de las células están desprendidas. Transfiera el 50% de la suspensión celular a un nuevo matraz de c

transient-expression-foreign-genes-insect-cells-sf9-for-protein

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Métodos para utilizar los sistemas de transducción de alfavirus para expresar a los periodistas fluorescente in vitro y en los mosquitos adultos se describen. Esta técnica puede ser adaptada a expresar la proteína de interés en lugar de o además de un periodista.

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Aquí se describe una forma de expresar antígenos de superficie del virus de la influenza correctamente plegadas y funcionales derivadas del nuevo virus H7N9 chino en células de insecto. La técnica se puede adaptar para expresar ectodominios de cualquiera de las proteínas de superficie virales o celulares.

Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus

La expresión de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos se está convirtiendo en un método atractivo para producir complejos de proteínas para biología estructural. Aquí presentamos un sistema de expresión simple pero altamente eficiente utilizando células de mamíferos cultivadas en suspensión para purificar complejos de proteínas para estudios estructurales.

Expresión de proteínas recombinantes para la Biología Estructural en HEK 293F Suspensión Células: Un enfoque novedoso y accesible

En este estudio se comparó la expresión de una proteína recombinante humana diana en diferentes plataformas de producción. Nos centramos en los cultivos tradicionales basados en fermentadores y en las plantas, describiendo la configuración de cada sistema y destacando, sobre la base de los resultados informados, los límites y ventajas inherentes a cada plataforma.

Un Análisis Comparativo de Expresión recombinante de proteínas en diferentes Biofactorías: Las bacterias, células de insecto y Plant Systems

La producción a escala de laboratorio de proteínas eucariotas con la modificación postraduccional adecuada representa una barrera significativa. Este es un protocolo robusto con un rápido establecimiento y respuesta para la expresión de proteínas utilizando un sistema de expresión de mamíferos. Este sistema admite aminoácidos selectivos, marcaje selectivo de proteínas y moduladores de moléculas pequeñas de la composición de glicanos.

High Yield La expresión de proteínas recombinantes humanos con la transfección transitoria de células HEK293 en Suspensión

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Nonlytic sistemas de expresión de células de insectos están infrautilizados para la producción, celular tráfico / localización, y el análisis funcional de proteínas recombinantes. A continuación, describimos métodos para generar vectores de expresión y la expresión de proteína transitoria posterior en líneas celulares de lepidópteros disponibles comercialmente. También se presenta la co-localización de las acuaporinas de Bemisia tabaci con proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares.

Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

Aquí, presentamos un protocolo para producir casa mosca carboxilesterasa proteínas en vitro con un sistema de expresión de baculovirus mediada por células de insectos y caracterizar funcionalmente más adelante su papel en la metabolización de permetrina, de tal modo, que confieren piretroides resistencia mediante la realización de celular MTT análisis y en vitro estudios metabólicos.

Caracterización funcional de carboxilesterasas en casa resistente al insecticida moscas, Musca Domestica

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) es una plataforma robusta para la detección de expresión y la producción de proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs) que se utilizarán para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales. Cantidades de miligramo de material se pueden producir para la mayoría de prmts y otras proteínas de interés que requieren una plataforma de expresión eucariota.

Producción De Proteínas Prmt Recombinantes Utilizando El Sistema De Vectores De Expresión De Baculovirus

La transformación exitosa de la línea germinal en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda,se logró utilizando ARNm de la transposasa hiperactiva piggyBac.

PiggyActivoBac Transformación de la línea germinal mediada por transposasa en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda

Aprende a evaluar la actividad antiapoptótica de proteínas foráneas mediante un sistema de expresión inducido por choque térmico en células Sf9 de insecto. Este método controlado permite estudiar funciones proteicas en biotecnología.

Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

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