Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas
22 de febrero de 2018
Este protocolo describe un calor proteína inducida por choque expresión sistema (pDHsp/V5-su/sf9 de la célula), que puede utilizarse para evaluar la actividad anti-apoptótica de posibles proteínas extrañas y su truncado amino o expresando proteínas extrañas ácidos en las células de los insectos.
El objetivo general de este sistema de expresión de proteínas inducido por choque térmico es evaluar la actividad antiapoptótica de dos proteínas potencialmente antagónicas funcionalmente en células de insectos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las funciones y actividades de las proteínas candidatas en biotecnología y proteómica, como sus actividades antiapoptóticas y las interacciones proteicas. La principal ventaja de esta técnica es que el momento de la expresión génica está controlado por la inducción de choque térmico.
Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el estado funcional de las proteínas. También se puede aplicar a otros sistemas, como la expresión de proteínas en mamíferos. Las células de insecto Spodoptera frugiperda, o Sf9, utilizadas en este protocolo se cultivan en medio de cultivo celular en matraces de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados a 28 grados centígrados.
Agite el matraz de cultivo celular para separar las células del matraz. A continuación, compruebe con un microscopio óptico que aproximadamente el 80% de las células están desprendidas. Transfiera el 50% de la suspensión celular a un nuevo matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados y deje que las células se adhieran a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Después de 15 minutos, reemplace el medio con cinco mililitros de medio de cultivo fresco y crezca en una incubadora a 28 grados centígrados. Dependiendo del crecimiento celular, pase las células cada dos o tres días. Antes de recolectar las células Sf9, es importante revisar las células bajo el microscopio óptico para asegurarse de que no haya contaminación por bacterias u otros microorganismos.
Para recolectar las células Sf9, agite el matraz de cultivo para separar las células y luego transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Con una pipeta P10, transfiera 10 microlitros de la suspensión celular a un hematocitómetro y cuente el número de células bajo el microscopio óptico. Coloque tres veces 10 hasta la quinta celda en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y déjelo a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Después de 15 minutos, reemplace el medio con 0,5 mililitros de medio de recubrimiento. Prepare el regente de transfección celular. Para cada transfección, diluya ocho microlitros de reactivo de transfección celular con 100 microlitros de medio de cultivo celular libre de suero y vórtice durante un segundo para mezclar.
En este estudio, se expresarán tres truncamientos diferentes del gen baculoviral, inhibidor de la apoptosis 3, o IAP3, bajo el control del promotor del choque térmico 70 de Drosophila, el IAP3 de longitud completa, un truncamiento que carece del dominio RING y un truncamiento que carece del dominio BIR. Agregue dos microgramos de cada ADN plasmídico en 100 microlitros de medio de cultivo celular libre de suero y mezcle mediante vórtice durante un segundo. Prepare también un control positivo.
Combine el ADN plasmídico diluido y el reactivo de transfección celular diluido y mezcle mediante vórtice. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Con una pipeta P1000, agregue 210 microlitros de cada mezcla de reactivos de transfección de ADN gota a gota sobre las células.
Incubar a 28 grados centígrados durante cinco horas. Después de cinco horas, reemplace el medio de siembra con 0,5 mililitros de medio de cultivo celular y luego selle la placa de 24 pocillos con cinta adhesiva. Incubar a 28 grados.
Al día siguiente, choque térmico para inducir la expresión de proteínas haciendo flotar la placa en un baño de agua a 42 grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos, regrese la placa de 24 pocillos a la incubadora a 28 grados centígrados. La expresión de la proteína se confirma posteriormente mediante Western blot, tal y como se describe en el protocolo de texto.
Para examinar la apoptosis celular inducida por genes, primero prepare células Sf9 como se demostró anteriormente. A continuación, transfecte las células de la misma manera que antes, pero incluya un microgramo de un plásmido que contenga un gen inductor de apoptosis en cada reacción de transfección. Incubar a 28 grados centígrados durante cinco horas, reemplazar el medio e incubar durante 16 horas.
Electrocutar las células transfectadas a 42 grados centígrados durante 30 minutos. Incubar las células a 28 grados centígrados durante cinco horas antes de realizar el ensayo de viabilidad celular. Para la apoptosis celular inducida químicamente, coloque una placa de 10 a las seis células Sf9 en cada pocillo de una placa de seis pocillos.
Deje a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego reemplace el medio con un mililitro de medio de recubrimiento. Transfectar las células con cuatro microgramos de cada ADN plasmídico. Después de cinco horas, reemplace el medio de siembra con un mililitro de medio de cultivo celular e incube las células a 28 grados centígrados durante 16 horas.
A continuación, realice un choque térmico a 42 grados centígrados durante 30 minutos. Incubar las células a 28 grados centígrados durante cinco horas después del choque térmico. A continuación, trate las células transfectadas con actinomicina D para inducir la apoptosis.
Incubar a 28 grados centígrados durante 16 horas antes de realizar el ensayo de viabilidad celular. Comience este procedimiento lavando las células tratadas. Retire el medio de cada pocillo, agregue un mililitro de PBS y déjelo por un minuto.
Lave las celdas tres veces con PBS de esta manera. Vuelva a suspender las células de cada pocillo con un mililitro de PBS que contenga 04% de azul de tripano y tiña a temperatura ambiente durante tres minutos. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros.
Transfiera 10 microlitros de la suspensión celular teñida con azul de tripano a un hemacitómetro y cuente las células intactas viables bajo un microscopio óptico. Por último, realice el análisis estadístico como se describe en el protocolo de texto. La longitud completa y dos truncamientos de IAP3 de Lymantria xylina MNPV se sobreexpresaron en células Sf9, y se realizó Western blot en lisados celulares para confirmar la expresión de la proteína.
La proteína antiapoptótica Ac-P35 se incluyó como control positivo. Todas las proteínas pudieron detectarse en las células transfectadas una o cinco horas después del choque térmico, con una mayor expresión a las cinco horas. Este sistema se puede adaptar para evaluar la actividad antiapoptótica.
Para la apoptosis celular inducida por genes, el inductor de apoptosis Drosophila Reaper se transfectó conjuntamente con construcciones de plásmidos de genes objetivo en células Sf9, que posteriormente se sometieron a un choque térmico para activar la expresión génica. En comparación con el vector Drosophila Reaper, el testigo positivo mostró una alta actividad antiapoptótica, alcanzando hasta el 80% de la tasa de viabilidad. Los otros constructos mostraron diversos efectos sobre la actividad antiapoptótica.
Para la apoptosis celular inducida por químicos, solo se transfectó una construcción en células Sf9, y se agregó actinomicina D cinco horas después del choque térmico. En comparación con el control positivo o el control negativo, los otros constructos mostraron diversos efectos sobre la actividad antiapoptótica. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos o tres días si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar obedecer las reglas de operación del cultivo celular en flujo laminar y verificar el estado de las células diligentemente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la coinmunoprecipitación, para responder preguntas adicionales, como si existe alguna interacción entre las dos proteínas coexpresadas en las células de los insectos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biotecnología exploraran las funciones de las proteínas en animales o microorganismos.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar este sistema para expresar proteínas extrañas o evaluar proteínas potencialmente antagónicas funcionalmente en células de insectos. No olvide que trabajar con algunos productos químicos, como la actinomicina D, puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes, al realizar este procedimiento.
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Resumen
Este protocolo describe un sistema de expresión inducida por choque térmico (sistema pDHsp/V5-His/células sf9) utilizado para evaluar la actividad antiapoptótica de proteínas foráneas en células de insectos. El método permite controlar el momento de la expresión génica mediante la inducción por choque térmico.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biotecnología
- Proteómica
- Biología celular
Antecedentes
- Los sistemas de expresión de proteínas inducidos por choque térmico son valiosos para estudiar las funciones proteicas.
- Las células de insecto, como Sf9, se utilizan comúnmente para la expresión de proteínas.
- Este método también puede adaptarse para la expresión de proteínas en mamíferos.
- Comprender las actividades antiapoptóticas es fundamental para diversas aplicaciones en la investigación.
Objetivo del estudio
- Evaluar la actividad antiapoptótica de proteínas candidatas.
- Investigar las interacciones proteicas en un entorno controlado.
- Proporcionar información sobre el estado funcional de las proteínas.
Métodos Utilizados
- Inducción por choque térmico para el control de la expresión génica.
- Uso de células de insecto Sf9 cultivadas en medio de cultivo celular.
- Evaluación de proteínas foráneas y sus aminoácidos truncados.
- Análisis de interacciones y actividades proteicas.
Resultados principales
- Expresión exitosa de proteínas extranjeras en células de insecto.
- Se demostraron actividades antiapoptóticas de proteínas candidatas.
- Se obtuvieron conocimientos sobre el estado funcional de las proteínas.
- Se destacaron aplicaciones potenciales en biotecnología y proteómica.
Conclusiones
- El sistema de expresión de proteínas inducido por choque térmico es eficaz para estudiar las funciones proteicas.
- Este método proporciona un enfoque controlado para evaluar las actividades proteicas.
- Son posibles aplicaciones adicionales en otros sistemas de expresión.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este sistema de expresión inducible por choque térmico permite la expresión temporal controlada de proteínas extrañas en células de insectos, lo que posibilita ensayos funcionales para evaluar la actividad antiapoptótica. Proporciona una plataforma reproducible para evaluar la función proteica en un sistema relevante para enfermedades, facilitando la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento. La adaptabilidad del sistema a la co-transfección de proteínas antagonistas permite investigar las interacciones proteicas, aumentando la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de proteínas candidatas mediante la expresión controlada de variantes completas y truncadas.
- Valor operativo: Permite evaluar la actividad antiapoptótica utilizando inductores de apoptosis como Reaper de Drosophila o agentes químicos tales como la actinomicina D.
- Valor estratégico: Facilita la comparación de variantes proteicas para aclarar las relaciones estructura-función y priorizar objetivos con perfiles funcionales deseados.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de expresión proteica confirmados mediante blot de Western en puntos temporales definidos tras la inducción.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de transfección y choque térmico en formatos de placas de 24 y 6 pocillos para un rendimiento de ensayo consistente.
- Valor estratégico: Permite la evaluación escalable de variantes proteicas en condiciones idénticas, apoyando el avance de hits a líderes en flujos de trabajo de proteómica.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Utiliza células Sf9 como un sistema relevante para la enfermedad para modelar vías apoptóticas y evaluar la supervivencia celular mediada por proteínas.
- Valor operativo: Genera recuentos de células viables mediante la exclusión de azul de tripano, proporcionando una lectura funcional de la eficacia antiapoptótica.
- Valor estratégico: Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la vinculación de la actividad molecular con el fenotipo celular en un modelo reproductible de células de insecto.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se encaja en la fase inicial del descubrimiento hasta la identificación del candidato, donde la validación funcional de la actividad proteica orienta la selección del blanco y la preparación del ensayo para el cribado posterior.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la expresión de variantes proteicas para evaluar la función antiapoptótica y el potencial de interacción.
- Selección: Ofrece protocolos reproducibles de transfección e inducción compatibles con formatos de placas de múltiples pocillos para ensayos funcionales de mediano rendimiento.
- Análisis: Proporciona confirmación mediante inmunotransferencia (Western blot) de la expresión y ensayos de viabilidad para cuantificar la actividad proteica y los resultados celulares.
- Investigación Traducional: Conecta la función molecular con la respuesta fenotípica en células de insectos, favoreciendo la comprensión mecanicista de la regulación apoptótica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar diversos candidatos proteicos en múltiples proyectos en biotecnología y proteómica.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Permite la reducción de riesgos mecanicistas al vincular dominios proteicos (por ejemplo, RING, BIR) con la actividad antiapoptótica mediante análisis de truncamiento.
- Valor operativo: Ofrece protocolos estandarizados para cultivo celular, transfección, inducción por choque térmico y evaluación de viabilidad.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos funcionales sobre variantes proteicas antes de la validación, que requiere muchos recursos.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización de candidatos con actividad demostrada en un sistema de expresión controlado e inducible.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células de insectos, técnicas de transfección e inducción mediante choque térmico.
- Depende del acceso a incubadoras o baños de agua a 28 °C y 42 °C para la expresión controlada por temperatura.
- Necesita la preparación y mezcla estandarizadas de reactivos para garantizar una eficiencia de transfección consistente entre pozos.
- Requiere adaptar el diseño del plásmido y la selección del promotor según la proteína diana y los objetivos de expresión.
- Limitado por la necesidad de precauciones de bioseguridad al trabajar con agentes peligrosos como la actinomicina D.
