Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

El objetivo general de este procedimiento es crear un modelo animal de atrofia geográfica de ojos grandes para trasplantar células epiteliales pigmentarias derivadas de la retina embrionaria humana en el ojo y evaluar la integración de las células del donante mediante tomografía de coherencia óptica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como el tratamiento basado en células madre para enfermedades degenerativas. La principal ventaja de este entorno quirúrgico es la fuente ilimitada de células sanas y el entorno quirúrgico para la inyección subretiniana, que tiene muchas similitudes con un procedimiento destinado al paciente.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad a través de la ostentación de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre embrionarias humanas. Nuestra técnica de animales, Monica Aronsson, mantiene en posición al conejo para que podamos visualizar e imaginar la retina con tomografía de coherencia óptica. Después de anestesiar a un conejo de acuerdo con el protocolo de texto, coloque al conejo bajo el microscopio quirúrgico con la cabeza hacia el cirujano.

A continuación, utilice un retractor de párpados para retirar los párpados y un paño estéril para retirar la membrana de nictitans. Para la microcirugía, utilice una técnica de pars plana transvítrea de 25 calibres de dos puertos o tres puertos opcional con trócares no valvulados para la inserción de instrumentos microquirúrgicos. La máquina de vitrectomía multifunción tiene puertos para conectar una cánula de infusión, endoiluminación, un vitrector y un endoláser.

Para las inyecciones subretinianas, solo es obligatoria la endoiluminación, lo que hace que una configuración de dos puertos sea suficiente. Usando pinzas de coágulos para agarrar y desplazar la conjuntiva, delinee el sitio de inserción. Inserte transesleralmente uno de los dos trócares superiores, a uno o dos milímetros del limbo, en un ángulo paralelo de treinta a cuarenta y cinco grados en el limbo.

Proceda a insertar el trócar hasta el centro de la punta. Luego, gira el trócar noventa grados y hazlo avanzar hacia el ojo, apuntando al polo posterior. Esto evitará la fuga posquirúrgica de esta esclerotomía y también disminuirá el riesgo de endoftalmitis.

Repita con el segundo trócar superior. Al insertar el trocar, es importante estar a uno o dos milímetros del limbo para tunelizar la inserción y apuntar al polo posterior para minimizar el riesgo de infección, sangrado vítreo, desprendimiento de retina y el tacto de nuestro cristalino. Aplique lágrimas sintéticas como un gel de contratación en la córnea y luego coloque una lente de contacto plana de un solo uso en la córnea para visualizar la retina.

A continuación, deje caer quinientos microlitros de yodato de sodio en una jeringa de un mililitro conectada a un tubo de extensión operado por un asistente y una cánula con punta de polietileno de calibre 38 operada por el cirujano. Inserte la sonda de endoiluminación a través del trócar superior izquierdo. Luego, inserte la cánula de inyección a través del trócar superior derecho y avance la cánula a través del espacio vítreo hacia la retina, apuntando al área justo debajo de la cabeza del nervio óptico.

Permita que la punta de la cánula toque lentamente la retina hasta que se vea un blanqueamiento focal. No permita que la cánula penetre en la retina, ya que esto puede causar hemorragia. Ahora, penetrando en la retina con la aguja, inyecte cincuenta microlitros de yodato de sodio por vía subretiniana durante un período de cinco segundos.

Dado que hay un plano de escisión natural entre la retina y la coroides subyacente, se debe formar gradualmente una ampolla semitransparente claramente visible durante la inyección. Mientras inyecta, retraiga lentamente la aguja, pero asegúrese de que la punta se mantenga dentro de la ampolla para minimizar el reflujo. Después de retirar la endoiluminación y la cánula de inyección, utilice pinzas de coágulo para retirar los trócares.

A continuación, utilice la punta, o el extremo romo de las pinzas, para aplicar una ligera presión durante treinta segundos sobre la esclerotomía sin sutura de sellado suave. Durante la recuperación, atienda al animal de acuerdo con el protocolo de texto y espere siete días para el trasplante. Siete días después de la inyección de yodato de sodio y después de la administración de triamcinolona intravítrea, de acuerdo con el protocolo de texto, retire el medio de diferenciación celular de una monocapa hESC-RPE confluente de veinticuatro pocillos y use quinientos microlitros de PBS sin calcio y magnesio para lavar cada pocillo.

Después de tripsinizar las células, incline la placa y retire con cuidado la tripsina para permitir que las células permanezcan adheridas a la placa. Recoja las células en ochocientos microlitros de medio de diferenciación fresco precalentado a treinta y siete grados centígrados pipeteando suavemente, o incluso raspando si es necesario, para obtener una suspensión de una sola célula. Usando cero coma dos por ciento de azul tripano, cuente las células en una cámara de hemocitómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

A continuación, añada cinco mililitros de medio de diferenciación a la suspensión celular y centrifugar las células a trescientas veces g, a temperatura ambiente durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en PBS esterilizado con filtro recién filtrado a una concentración final de mil células por microlitro. Alicuente la suspensión celular anterior en alícuotas de seiscientos microlitros y manténgalas en hielo hasta y durante la cirugía.

Después de anestesiar al conejo y dilatar las pupilas según el protocolo de texto, coloque el conejo con la cabeza mirando hacia el cirujano. Utilice el retractor de párpados para retirar los párpados y un paño estéril para retirar la membrana de nictitans. Para la microcirugía, utilice una técnica de pars plana transvítrea de dos puertos o de tres puertos opcional de calibre 25 con trócares colocados en las mismas posiciones que se demostró anteriormente en este video.

Si las esclerotomías previas son visibles, realice la inserción del trocar justo adyacente a estos sitios de inserción, pero no a través de ellos, para minimizar el riesgo de fuga postoperatoria. Aplique lágrimas sintéticas en el ojo como antes y coloque una lente de contacto plana de un solo uso sobre la solución en la córnea para visualizar la retina. Después de colocar correctamente la punta y apuntar al centro del área pretratada con yodato de sodio, que se distingue por un reflejo de endoiluminación metálico característico, inyecte subretinialmente cincuenta microlitros de una suspensión hESC-RPE suavemente mezclada.

La retina neurosensorial debe separarse fácilmente, creando una ampolla claramente visible. Durante la inyección, retraiga lentamente la aguja, pero asegúrese de que la punta se mantenga dentro de la ampolla para minimizar el reflujo. Después de retirar la endoiluminación y la cánula de inyección, utilice unas pinzas de coágulo para retirar los trócares y utilice el extremo romo de las pinzas para aplicar una ligera presión durante treinta segundos como antes.

Utilice una tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, o dispositivo SD-OCT, con el software adjunto para obtener exploraciones B transversales de los animales tratados, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Coloque al animal anestesiado y con la pupila dilatada en un soporte ajustable para obtener un camino sin obstrucciones desde la fuente de luz del instrumento hasta la retina del conejo. Para evitar que la imagen se vea borrosa, mantenga la córnea húmeda enjuagándola con solución salina tópica cada treinta a sesenta segundos.

Obtenga al menos tres escaneos OCT con oftalmoscopia láser de escaneo confocal infrarrojo simultáneo o imágenes de referencia de reflectancia confocal SLO que representan la parte superior, central e inferior del área inyectada. Obtenga múltiples colores láser simultáneos de imágenes de fondo de ojo en la cara con reflectancia láser confocal SLO azul, verde, infrarroja y multicolor. Capture imágenes de autofluorescencia de luz azul utilizando la capacidad de láser de luz azul del dispositivo SD-OCT.

Aquí se muestran imágenes representativas in vivo de BAF, IR-cSLO y SD-OCT de una retina de conejo albino normal. Una ampliación de la imagen SD-OCT ilustra las diferentes capas de la retina con sus niveles distintivos de reflexión de la luz capturados por el instrumento SD-OCT. Como se muestra en esta imagen SD-OCT, tomada tres meses después de la inyección de cincuenta microlitros de una solución de yodato de sodio milimolar, se crea una ampolla que resolvió y degeneró progresivamente la retina externa.

Se observa un adelgazamiento de las capas neurorretinianas más externas en las áreas SD-OCT e hipo-BAF, correspondiente a la pérdida de EPR, recreando así un fenotipo similar al GA. Tras la identificación del área dañada, se reinyectaron cincuenta mil células hESC-RPE para el trasplante, creando una segunda ampolla que se resolvió. Las áreas de hiper-BAF de leves a moderadas están presentes con un aumento focal de hiper-BAF en el límite del área de daño, lo que indica estrés crónico del EPR nativo.

A modo de comparación, se muestra la ampolla correspondiente a la inyección de hESC-RPE's en ojos no tratados previamente que muestra parches de células pigmentadas en la imagen MC y estructuras retinianas bien conservadas en la exploración SD-OCT. El dominio de este bonito método clínico para la inyección subretiniana facilitará el trasplante clínico del tratamiento basado en células para afecciones como la degeneración macular relacionada con la edad. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar inyecciones subretinianas en un modelo de tipo natural, cómo preparar células derivadas de células madre embrionarias humanas para inyecciones subretinianas y cómo visualizar la integración de las células del donante mediante tomografía de coherencia óptica.