Name: Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprende el trasplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos con atrofia geográfica. Este método evalúa la integración celular mediante tomografía de coherencia óptica para avanzar en medicina regenerativa.

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Este estudio fue apoyado por becas del Instituto Karolinska, Fundación del Crown Princess Margareta para invidentes, la Fundación de investigación oftalmológica, el rey Gustav V Foundation, la Fundación sueca de ojo, el ARMEC Edwin Jordan Fundación de Lindeberg y la Fundación Cronqvist.

El siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de Karolinska Instituet. Los experimentos en animales utilizando conejos albinos de Nueva Zelanda (Tabla de materiales) han sido aprobados por el Comité de ética animal regional (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permiso: dnr 56/15). El uso de hESCs (dnr 2011/745-31/3) y la transferencia y manipulación de células-RPE (dnr 2013/813-31/2) es también conforme a la legislación sueca y las regulaciones del Karolinska Institutet y ha sido aprobado por el (Comité de ética humana regional Regionala Etikprövningsnämnden i Stockholm).
1. subretinal inyección de cloruro de sodio (NaIO3) en un modelo Animal grande-eyed
<ol><li>Anestesiar animales por administración intramuscular en el muslo con una mezcla de 35 mg/kg ketamina y xilacina de 5 mg/kg en solución salina utilizando una jeringa de 30 G, y dilatar las pupilas con gotas tópico usando una mezcla de 0,75% ciclopentolato y 2.5% fenilefrina. Anestesia adecuada se confirma si el animal no reacciona ante una pizca dura de su pata trasera.</li>
	<li>Coloque el conejo en el microscopio quirúrgico con la cabeza hacia al cirujano (figura 1A). Utilice un retractor de la tapa para retirar membrana párpados y nictitans con un paño estéril para reducir al mínimo el riesgo de contaminación. Utilización equilibrada solución de sal (BSS) para evitar la sequedad bajo anestesia en ambos ojos.</li>
	<li>
Para microcirugía, uso un puerto 2 (o 3-puerto opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica con trócares sin válvula para la inserción de instrumentos de microcirugía (figura 1B). La máquina de múltiples funciones de la vitrectomía tiene puertos para conectar una cánula de infusión, endoillumination, vitrector y endolaser. Para inyección subretinal, sólo el endoillumination es obligatorio, que hace un montaje de 2 puertos suficientes. Inserte el endoillumation a través del trocar izquierdo superior y el uso del trocar derecho superior de la cánula de inyección subretinal.
	<ol>
<li>Para una configuración de 3 puertos, use el trocar temporal inferior de la cánula de infusión BSS. Si son instrumentos opcionales (tales como un vitrector) usado, insertar a través del trocar derecho superior.</li>
		<li>Colocar los 2 trocares superiores 1-2 mm de Limbo con unas pinzas con garras para agarrar y desplazar la conjuntiva que cubre el sitio de inserción.</li>
		<li>Asegúrese de que los trocares son transsclerally insertado en un ángulo paralelo del limbus de 30-45° y proceden a la mitad de la punta del trocar. Girar el trócar 90 º y avanzar en el ojo, con el objetivo en el polo posterior del ojo. Este procedimiento evitar fugas post-quirúrgicas de las sclerotomies y también disminuir el riesgo de endoftalmitis (es decir, una infección bacteriana en el ojo). Vea también figura 2B para posiciones de trocar.</li>
		<li>Poner una lente de contacto plano de ocupacion en la córnea para visualizar la retina, con lágrimas sintético como gel de contacto entre el ojo y la lente de contacto (figura 1A).</li>
		<li>Drenaje 500 μl de NaIO3 en una jeringa de 1 mL conectada a un tubo de extensión (funcionado por el asistente) y una cánula de polytip 38 G (operado por el cirujano).</li>
		<li>Inserte la sonda de endoillumination a través del trocar izquierdo superior y la cánula de inyección a través del trocar derecho superior y avanzar la cánula a través del espacio vítreo hacia la retina, con el objetivo de la zona justo debajo de la cabeza del nervio óptico.</li>
		<li>Permitir que la punta de la cánula a tocar poco a poco la retina hasta un blanqueamiento focal es visible. La inyección se penetrará a la retina, lo que permite entrega subretinal. No deje la cánula penetra la retina, ya que esto puede causar hemorragia.</li>
		<li>Inyectar 50 μl de NaIO3 subretinally durante un período de s 5. Ya que existe un plano de la hendidura natural entre la retina y la coroides subyacente, una ampolla visible semitransparente forman gradualmente durante la inyección.</li>
		<li>Lentamente durante la inyección, retraer la aguja, pero asegúrese de que la punta se mantiene dentro de la ampolla para minimizar el reflujo.</li>
		<li>Después del retiro de la cánula de inyección y endoillumation, quitar los trocares con garras pinzas y aplique presión ligera de 30 s para el cierre automático sclerotomies de sutura menos utilizando la punta o el extremo despuntado de las pinzas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Y dar 10 mL de solución salina por vía subcutánea para evitar la deshidratación. No dan post-surgical esteroides tópicos o antibióticos. Para analgésicos dar 0.5 mL de cirugía por vía subcutánea después de buprenorfina 0.3 mg/ml, así como el día después de la cirugía.</li>
	<li>Después del uso, lave todos los instrumentos por inmersión les hace un par de segundos en primer lugar en etanol al 70%, en segundo lugar en 45% de etanol y por último en agua destilada. Secarlos bien con una toalla de papel.</li>
	<li>Asistir a los animales hasta que recupere la suficiente conciencia y colocan todas solo hacinados. Si es necesario (por ejemplo, para propósitos de inmunohistoquímica), eutanasia de animales por la inyección intravenosa de pentobarbital de 100 mg/kg (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Espere 7 días para proceder con el trasplante de las células hESCs RPE.</li>
</ol>2. subretinal trasplante de las células hESCs RPE en animales tratados con
<ol><li>Administrar 2 mg (100 μL) de la triamcinolona de intravitreal en animales anestesiados con una aguja 30 g insertada 1-2 mm del limbo en el cuadrante temporal inferior 1 semana antes del trasplante de células RPE y volver a administrar cada 3 meses. Asegúrese de apuntar la punta hacia el polo posterior del ojo para evitar que un toque de lente.</li>
	<li>La cultura una monocapa de células RPE como se describió anteriormente1.</li>
	<li>Eliminar medios de la diferenciación de la célula (véase Tabla de materiales) de una monocapa confluente de 24 pocillos hESC-RPE y lave cada uno con 500 μl de PBS sin Ca2 + y Mg2 +. Repetir esta acción una vez más, para un total de 2 lavados.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante, agregar 500 μl de tripsina por bien e incube durante 12 min a 37 ° C.</li>
	<li>Inclinación de la placa y retire con cuidado la tripsina (células deberían permanecer pegadas a la placa). Recoger células en 800 μl de fresco 37 º C precalentado diferenciación medios mediante pipeteo suave, o incluso raspado si fuera necesario, para obtener una suspensión unicelular. Nota: Utilice un tamiz de 40 μm células si se observan grupos de células.</li>
	<li>Recuento de células en una cámara del hemocitómetro con 0.2% Trypan azul, según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Añadir 5 mL de diferenciación células medios y centrifugar a temperatura ambiente, 300 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en recién esterilizado por filtro de PBS (pasado a través de un filtro de jeringa de 25 mm) a una concentración final de 1.000 células/μl.</li>
	<li>Parte alícuota de la suspensión anterior en 600 alícuotas μl y mantenga en hielo hasta y durante la cirugía.</li>
	<li>Anestesiar animales por administración intramuscular en el muslo con una mezcla de 35 mg/kg ketamina y 5 mg/kg xilacina en salina utilizando una jeringa de 30 G. Dilatar a las pupilas con colirio tópico usando amix de fenilefrina cyclopentolate y 2.5% 0,75%. Anestesia adecuada se confirma si el animal no reacciona ante una pizca dura en su pata trasera.</li>
	<li>Colocar el conejo con la cabeza hacia al cirujano. Utilice un retractor de la tapa para retirar membrana párpados y nictitans con un paño estéril para reducir al mínimo el riesgo de contaminación. Utilizar BSS para evitar la sequedad bajo anestesia en ambos ojos.</li>
	<li>
Para microcirugía, uso un puerto 2 (o 3-puerto opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica con trócares colocados en la misma posición como se describe en el paso 1.3 y figura 2. Si el sclerotomies anteriores son visibles, realizar inserción de trocar a adyacentes, pero no a través de estos, para minimizar el riesgo de fugas postoperatorias.
	<ol>
<li>Poner una lente de contacto plano de ocupacion en la córnea para visualizar la retina, con lágrimas sintético como el gel de contacto entre el ojo y la lente de contacto (figura 1A).</li>
		<li>Después de punta adecuado posicionamiento (ver pasos 1.3.5 y 1.3.6), inyectar 50 μl de una suspensión de RPE de hESCs mezclado suavemente (50.000 células) subretinally. Objetivo para el centro de la zona de NaIO3 pretratados distinguido por un reflejo característico "metálico" endo-iluminación. La retina neurosensorial debe separar fácilmente creando una ampolla visible. Ras la aguja estéril de H2O entre conejos y después utilizar para evitar obstrucción debido a la célula la aguja produce. Cambiar la aguja cuando la obstrucción se nota.</li>
		<li>Durante la inyección lentamente retraer la aguja pero asegúrese de que la punta se mantiene dentro de la ampolla para minimizar el reflujo.</li>
		<li>Después del retiro de la cánula de inyección y endoillumation, quitar los trocares con garras pinzas y aplique presión ligera de 30 s para el cierre automático sclerotomies de sutura menos utilizando la punta o el extremo despuntado de las pinzas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Y dar 10 mL de solución salina por vía subcutánea para evitar la deshidratación. No dan post-surgical esteroides tópicos o antibióticos. Para analgésicos dar 0.5 mL de cirugía por vía subcutánea después de buprenorfina 0.3 mg/ml, así como el día después de la cirugía.</li>
	<li>Después del uso, lave todos los instrumentos por inmersión les hace un par de segundos, en primer lugar en etanol al 70%, en segundo lugar en 45% de etanol y por último en agua destilada. Secarlos bien con una toalla de papel.</li>
	<li>Asistir a los animales hasta que recupere la suficiente conciencia y colocan todas solo hacinados. Si es necesario (por ejemplo, para propósitos de inmunohistoquímica), eutanasia de animales por la inyección intravenosa de pentobarbital de 100 mg/kg.</li>
</ol>3. retina en Vivo y proyección de imagen Subretinal
<ol><li>
Utilice un dispositivo de (SD-OCT) la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral con el software que lo acompaña (véase tabla de materiales) para obtener la sección transversal b-Scan de los animales tratados, según las instrucciones del fabricante. Para evitar el desenfoque de la imagen, asegúrese de mantener la córnea húmeda mediante lavado con solución salina tópica cada 30-60 s.
	<ol>
<li>Colocar los animales anestesiados y dilata la pupila (véase los pasos 1.1 y 2.10) en una montura ajustable para obtener una trayectoria sin obstáculo de la fuente de luz del instrumento a la retina de conejo.</li>
		<li>Obtener al menos 3 OCT exploraciones con oftalmoscopia de láser escaneado confocal infrarroja simultánea imágenes de referencia de reflectancia (IR-cSLO) que representa la parte superior, central e inferior de la zona inyectada.</li>
		<li>Obtener imágenes de fondo en cara con cSLO azul, verde, infrarrojo y multicolor láser reflectancia (es decir, múltiples colores láser simultánea), respectivamente.</li>
		<li>Capturar imágenes de Autofluorescencia de luz azul (BAF) utilizando la capacidad del láser de luz azul del dispositivo SD-OCT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li>
<li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li>
<li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li>
<li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22603978">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tienen intereses en competencia o conflicto de intereses.

En este protocolo, se describe la generación de un modelo de grandes ojos de AG y su uso preclínico para evaluar la integración de células RPE en vivo .
Para la traducción de terapias regenerativas para GA y enfermedades relacionadas en la clínica7, es importante desarrollar y optimizar métodos que reflejan fielmente los métodos clínicos para el trasplante y la proyección de imagen. El conejo es en este aspecto atractivo: tiene un ojo relativamente grande que p...

Este protocolo describe la generación de un modelo preclínico de grandes ojos de atrofia geográfica (GA) que permite la evaluación de la integración de células transplantada-RPE en el espacio subretinal. Se han utilizado los métodos descritos en detalle aquí en 3 publicaciones recientes que demuestran la producción de una población enriquecida, pura y funcional de las células RPE de hESCs1, así como la creación de daño retiniano externo y un GA-como fenotipo inducida por la inyección subretinal de soluciones salinas fisiológicas (es decir, BSS y PBS) o NaIO3 en el conejo ojo2,3. Hemos demostrado además que trasplantes de sub-retinal de la suspensión de células RPE forman monocapas funcionales extensa con fotorreceptor rescate capacidad2.
Varias ventajas acompañarán el uso del ojo del conejo para la generación de un modelo de GA de la enfermedad. En primer lugar, el tamaño del ojo del conejo, que es el 70% del volumen de un ojo humano adulto, permite trasplante clínicamente significativo con una densidad celular que es mucho más baja que utiliza habitualmente en ojos pequeños roedores (1.000 células/μl frente a 50.000 células/μl)4 , 5. en segundo lugar, la cirugía en roedores suele transscleral a través de la coroides, que compromete la barrera retiniana y potencialmente desencadena una respuesta inflamatoria y un posible rechazo6. Ambos factores juntos pueden conducir a multilayering y aglutinación de las células trasplantadas y una integración general deficiente de las células trasplantadas en un tejido retiniano nativa interrumpido. Sin embargo, el modelo de conejo grande-eyed permite la realización de una técnica quirúrgica con instrumentación idéntica a un ajuste clínico. En tercer lugar, un modelo de grandes ojos también permite alta resolución en vivo la proyección de imagen y control de las células trasplantadas y la retina suprayacente al tiempo1,2,3. Así, describimos un modelo preclínico clínico relevante y rentable que debe ser una alternativa atractiva a los roedores para cualquier persona con un interés en la investigación de la retina normal y enferma y el espacio sub-retinal.

<table><tbody><tr><td>Medio de diferenciación NutriStem hESC XF &ndash; bFGF y &ndash; TGFb</td><td>Biological Industries</td><td>06-5100-01-1A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 1x</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Ca2+ y Mg2+</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células 40 &mu; m Nylon</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td></td></tr><tr><td>Aguja 30 G 0.5' &rsquo;; 0,3 mm x 13 mm</td><td>BD Microlance</td><td>304827</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc Filtro de jeringa de 25 mm</td><td>Acrodisc</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>0,4% azul tripán</td><td>ThermoFisher Scientific Corp</td><td>15250061</td><td>Uso al 0,2%</td></tr> <tr><td>NaIO3</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>S4007</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>65079550</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Solveco AB</td><td>1047</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol, 100 mg/mL</td><td>Intervet, Boxmeer</td><td>511519</td><td>Uso 35 mg/kg de ketamina</td></tr><tr><td>Rompun vet, 20 mg/mL</td><td>Bayer Animal Health</td><td>22545</td><td>Uso 5 mg/kg de xilacina</td></tr><tr><td>Triescencia, 40 mg/mL</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td></td><td>412915 2 mg intraviterial</td></tr><tr><td>Cyklopentolat-fenilefrina, 0,75% + 2,5%</td><td>APL</td><td>321968</td><td>Use 1 gota en cada ojo</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Laboratoires Th&eacute; a</td><td>597562</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tópica</td><td>Apotea AB 7053249369080</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allfatal vet. 100 mg/mL</td><td>Omnidea</td><td>77168</td><td>Uso 100 mg/mL de pentobarbital</td></tr><tr><td>Tubo de extensión (martillo)</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3223</td><td></td></tr><tr><td>25 G/38 G cánula subretiniana polytip</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3219</td><td>25 G/38 G</td></tr><tr><td>Lente plana de un solo uso</td><td>Volk</td><td></td><td></td>#VWFD10</tr><tr><td>Retractor de tapa Barraquer Colibri</td><td>AgnTho's AB</td><td>42-020-030</td><td></td></tr><tr><td>Trócares sin válvulas</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751448</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de garra</td><td>Bausch & Lomb Nordic AB</td><td>ET1811</td><td></td></tr><tr><td>Alcon Accurus 400VS Máquina de vitrectomía</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065740238</td><td></td></tr><tr><td>Accurus 25+ Gauge Vitrectomía TotalL Plus Pak</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751493</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo SD-OCT</td><td>Heidelberg</td><td>Engineering Spectralis HRA+OCT</td><td>Utilice Heidelberg Eye Explorer versión 1.9.10.0</td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro Neubauer</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>Conejos albinos de Nueva Zelanda</td><td>Lidk&ouml; pings Granja de conejos, Suecia</td><td></td><td></td></tr><tr>Células <td></td><td></td><td>hESC-RPE</td><td>Ver número de referencia 1</td></tr><tr><td>Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml</td><td>Dechra</td><td>660500</td><td>Utilizar 0,5 mL de buprenorfina por vía subcutánea</td></tr></tbody></table>

transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Atrofia geográfica (GA), la última etapa de degeneración macular seca relacionada con la edad se caracteriza por la pérdida de la capa de (RPE) epitelial del pigmento retiniano, que conduce a la degeneración subsecuente de estructuras vitales de la retinales (e.g., fotorreceptores) causando debilitación severa de la visión. Del mismo modo, RPE-pérdida y disminución de la agudeza visual se ve en el seguimiento a largo plazo a de pacientes con avanzada degeneración macular relacionada con la edad húmeda (DMAE) que reciben tratamiento de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) intravítreos. Por lo tanto, por un lado, es fundamental para derivar eficazmente las células RPE de una fuente ilimitada que podría servir como terapia de reemplazo. Por otro lado, es importante evaluar el comportamiento y la integración de las células derivadas de un modelo de la enfermedad que implique quirúrgicas y métodos de imagen como cerrar como sea posible a las que se aplican en los seres humanos. Presentamos un protocolo detallado basado en nuestras publicaciones anteriores que describe la generación de un modelo preclínico de GA con el ojo de conejo albino, para la evaluación de las células madre embrionarias derivadas de las células epiteliales del pigmento retiniano (hESC-RPE) en un ajuste clínicamente relevante. Células diferenciada-RPE son transplantadas en ojos de ingenuo o con NaIO3-inducida por GA-como la degeneración retiniana con técnica 25 G transvitreal pars plana. Se realiza evaluación de zonas degeneradas y trasplantadas por multimodal proyección en tiempo real de imagen no invasiva alta resolución.

Representante en vivo imágenes de BAF, cSLO IR y SD-OCT de una retina de conejo albino normal se muestran en la figura 2. Tenga en cuenta las diferentes capas retinianas con sus distintivos niveles de reflexión de la luz capturada por el instrumento de la SD-OCT.
En las figuras 1A y 1B de la figura, se ilustra la configuración para...

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un modelo animal de atrofia geográfica de ojos grandes para trasplantar células epiteliales pigmentarias derivadas de la retina embrionaria humana en el ojo y evaluar la integración de las células del donante mediante tomografía de coherencia óptica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como el tratamiento basado en células madre para enfermedades degenerativas. La principal ventaja de este entorno quirúrgico es la fuente ilimitada de células sanas y el entorno quirúrgico para la inyección subretiniana, que tiene muchas similitudes con un procedimiento destinado al paciente.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad a través de la ostentación de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre embrionarias humanas. Nuestra técnica de animales, Monica Aronsson, mantiene en posición al conejo para que podamos visualizar e imaginar la retina con tomografía de coherencia óptica. Después de anestesiar a un conejo de acuerdo con el protocolo de texto, coloque al conejo bajo el micros

subretinal-transplantation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El trasplante de la célula representa una estrategia para el tratamiento de la degeneración retiniana caracterizada por pérdida del fotorreceptor. Aquí describimos un método para el enriquecimiento de fotorreceptores trasplantables y su injerto subretinal en ratones adultos.

Trasplante Subretinal De Macs Purificado Fotorreceptores Precursores De Células En La Retina Del Ratón Adulto

Aquí presentamos un protocolo aceptado por la comunidad en formato multimedia para inyectar subretinialmente un bolo de células EPR en ratas y ratones. Este enfoque se puede utilizar para determinar los potenciales de rescate, los perfiles de seguridad y las capacidades de supervivencia de las células EPR injertadas tras la implantación en modelos animales de degeneración de la retina.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

Epitelio pigmentario de la retina (EPR) y las estrategias de sustitución basado en la terapia génica son considerados por varias condiciones degenerativas de la retina. Para la traducción clínica, se requieren grandes modelos animales para estudiar el ojo técnicas quirúrgicas aplicables en los pacientes. Aquí presentamos un modelo de conejo para la cirugía subretiniana orientado hacia el trasplante de EPR, que es versátil y rentable.

Un Paso a Paso Protocolo para la cirugía subretiniana en conejos

Inyección subretinal se ha aplicado extensamente en estudios preclínicos de terapia de reemplazo de la célula de vástago para la degeneración macular relacionada con la edad. En este artículo visualizado, describimos una técnica de inyección subretinal menos riesgoso, reproducible y exacto modificado vía trans-escleral para entregar las células en los ojos de rata.

Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata

Se describe un método para diseñar un retineano tejido compuesto de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de las células de vástago pluripotent humanas cultivadas sobre las membranas amnióticas humanas y su preparación para injerto en modelos animales.

Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

Aquí se presenta una técnica quirúrgica para trasplantar tejido retiniano derivado de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en el espacio subretiniano de un modelo animal grande.

Trasplante subretiniano de tejido retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo felino de animales grandes

El primate no humano (NHP) es un modelo ideal para estudiar la terapéutica celular de la retina humana debido a las similitudes anatómicas y genéticas. Este manuscrito describe un método para el trasplante submacular de células epiteliales pigmentarias de la retina en el ojo NHP y estrategias para prevenir las complicaciones intraoperatorias asociadas con la manipulación macular.

Trasplante de epitelio pigmentario retiniano en un modelo de primate no humano para enfermedades degenerativas de la retina

Este protocolo presenta un abordaje transescleral transpupilar guiado por visión para administrar de forma segura y precisa injertos celulares subretinianos, con una baja tasa de complicaciones quirúrgicas, en receptores de ratón con o sin degeneración retiniana.

Trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en un modelo de ratón con degeneración retiniana

Describimos un protocolo detallado para la preparación de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC post-criopreservadas y la administración sub-retiniana de estas células en ratones rd10 .

Entrega sub-retiniana de progenitores fotorreceptores derivados de células madre embrionarias humanas en ratones rd10

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Aprende el trasplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos con atrofia geográfica. Este método evalúa la integración celular mediante tomografía de coherencia óptica para avanzar en medicina regenerativa.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica (Video) | JoVE Journal

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

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