Un microcontrolador funciona dispositivo para la generación de extractos líquidos de Aerosol de humo y electrónicos cigarrillo cigarrillo convencional

El objetivo general de este procedimiento es generar extractos líquidos a partir de aerosoles de cigarrillos electrónicos para su uso en ensayos toxicológicos. Este método puede ayudar a responder preguntas importantes sobre los cigarrillos electrónicos, como por ejemplo, ¿cómo afecta el aerosol del cigarrillo electrónico a las células vasculares humanas? La principal ventaja de esta técnica es que permite que el flujo de aire y el protocolo de sincronización de soplado sean personalizados por cualquier laboratorio individual para satisfacer sus necesidades específicas de investigación.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una mejor comprensión de los riesgos potenciales del uso de cigarrillos electrónicos, ya que proporciona una plataforma personalizable que puede generar extractos de aerosoles de cigarrillos electrónicos en su propio laboratorio. Este método puede proporcionar información sobre los riesgos de los cigarrillos electrónicos. También se puede aplicar a otros productos, como los productos de tabaco convencionales o los productos de cannabis.

Para comenzar, asegure un matraz Buchner de 100 mililitros a un soporte de anillo de acero y cree una trampa de vacío llenándola con 50 gramos de cloruro de calcio para que sirva como desecante. A continuación, selle el matraz con un tapón de goma con orificio pasante. Envuelva la unión del tapón con una película de parafina y pase una pipeta por el orificio.

Con un tubo de vinilo, conecte la pipeta que se extiende desde el topper a un conector de manguera de intersección en T. Luego úselo para conectar los dos impingers entre sí y para conectar la salida del segundo impinger al conector de la manguera de intersección en T. A continuación, use el tubo de vinilo para conectar el puerto de entrada del primer impulsor para que sirva como puerto de inhalación.

Conecte también el brazo lateral del matraz Buchner al puerto de entrada de un regulador de flujo de aire. Y conecte el puerto de salida del regulador de flujo de aire a una bomba de vacío. Luego, coloque una base roscada 510 en una abrazadera de soporte de anillo y use un tubo de vinilo para conectar la válvula solenoide al extremo libre del conector de la manguera de intersección en T.

Cuando termine, verifique que todas las juntas estén herméticas y aplique abrazaderas de manguera y grasa para aspiradora según sea necesario. Primero, determine la masa de cada cartomizador o tanque de cigarrillos electrónicos antes de usarlos colocándolos en una balanza analítica. La diferencia de peso entre el pre y el post-uso determinará la dosis adecuada.

Para los cigarrillos comerciales de investigación 3R4F, el contenido de nicotina será de 7 miligramos. Para todos los demás cigarrillos comerciales, el contenido de nicotina debe determinarse mediante métodos analíticos convencionales. Cuando utilice el ensayo de viabilidad de células de captación de rojo neutro para el análisis posterior, llene el depósito del impulsor primario con 4,3 mililitros de medio de cultivo de células endoteliales.

A continuación, prepare el cigarrillo electrónico o el cigarrillo convencional para la extracción. Para preparar un cigarrillo convencional para la extracción, aplique un trozo de cinta adhesiva transparente alrededor del filtro y coloque una marca fácilmente visible donde el papel de fumar se une al filtro. Para preparar un cigarrillo electrónico, asegúrese de que la batería esté bien cargada y que el cartomizador esté bien atornillado a la batería.

Si usa un tanque de cigarrillo electrónico, asegúrese de que haya un volumen adecuado de líquido de cigarrillo electrónico en el tanque y enrosque el tanque en la base roscada 510. Para el cigarrillo convencional, cárguelo en el puerto de inhalación y asegúrelo con una abrazadera de manguera. A continuación, encienda la bomba de vacío.

Ajuste el medidor de flujo para extraer 1,65 litros por minuto para garantizar una bocanada de 55 mililitros en dos segundos. Luego encienda el microcontrolador y úselo para encender el cigarrillo en la primera bocanada. Haga funcionar la bomba hasta que se alcance la concentración deseada proyectada.

En el caso de un cigarrillo electrónico, comience cargándolo en el puerto de inhalación y asegúrelo con una abrazadera de manguera. Al igual que con el cigarrillo convencional, encienda la bomba de vacío y ajuste el medidor de flujo para extraer 1,65 litros por minuto para garantizar una bocanada de 55 mililitros en dos segundos. Haga funcionar la bomba hasta que se haya utilizado el volumen deseado proyectado.

Luego, detenga el vacío y determine la masa posterior al uso de cada cartomizador o tanque de cigarrillos electrónicos utilizando una balanza analítica. Compare esto con la masa previa al uso para determinar la masa total consumida. Si se consumió una masa insuficiente, devuelva el cigarrillo electrónico al dispositivo y ejecute la extracción durante un tiempo adicional.

Después de cada extracción, enjuague los tubos y los depósitos del dispositivo con etanol al 70% y agua desionizada para evitar el arrastre entre muestras. A continuación, haga funcionar brevemente el dispositivo vacío para permitir que el flujo de aire ayude a secar las líneas. Si el extracto se va a utilizar para el cultivo celular, filtre el extracto que contiene medios a través de un filtro de jeringa de polietersulfona de 0,22 micras.

Un día antes de realizar el ensayo, siembre células endoteliales de la vena umbilical humana en placas de 96 pocillos a 10.000 células por pocillo en 100 microlitros de medio de crecimiento de células endoteliales. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5%CO2. Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo anterior con 100 microlitros de medio de cultivo de células endoteliales frescas para servir como control o 100 microlitros de medio de crecimiento de células endoteliales que contengan 500 micromoles de nicotina consumida para servir como grupo de tratamiento.

Selle la placa con un sello de aluminio para mantener los pocillos herméticos y luego vuelva a colocar la placa en la incubadora durante 18 a 24 horas. Muchos de los componentes del humo del cigarrillo y el aerosol de los cigarrillos electrónicos son volátiles, por lo que es importante cubrir los pocillos con un sello de aluminio para que los pocillos sean herméticos. Poco antes de su uso, diluya una solución madre roja neutra 100x 1 a 100 en medio de cultivo celular para crear una solución de tinción roja neutra 1x.

Incubar la solución de tinción de rojo neutro a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos antes de su uso. Es normal que algunos cristales precipiten durante la incubación. Para evitar la aplicación de estos cristales a los pocillos de cultivo celular, pase la solución a través de un filtro de 22 micras.

Retire el medio de cultivo experimental y agregue 100 microlitros de la solución de tinción de rojo neutro a cada pocillo. Utilice el exceso de tinte para crear al menos tres pozos en blanco para una cuantificación adecuada. Incubar la placa durante dos a cuatro horas, luego retire la solución de tinción de rojo neutro y lave las células tres veces por inmersión en PBS.

A continuación, aplique una solución antimanchas de color rojo neutro e incube la placa durante al menos diez minutos a temperatura ambiente mientras agita. Cuando termine, lea la placa con una absorbancia de 540 nanómetros. Dentro de las 24 horas posteriores a la exposición de las células endoteliales de la vena umbilical humana al extracto de humo de cigarrillo convencional o al extracto de aerosol de cigarrillo electrónico, hay una reducción significativa en la viabilidad celular.

Además de los estudios de viabilidad celular, los extractos en sí mismos se pueden analizar mediante cromatografía de gases, espectrometría de masas, si se extraen en acetona. Con este método, se pueden determinar muchos componentes del extracto. No olvide que trabajar con aerosoles o humo puede ser peligroso y que todas las extracciones deben realizarse en una campana de seguridad química.