Utilizando CRISPR/Cas9 Gene edición para investigar la actividad oncogénica del mutante calreticulina en dependiente de citoquinas de células hematopoyéticas

El objetivo general de este experimento es utilizar la edición genética CRISPR/Cas9 para modelar las mutaciones de la calreticulina en células hematopoyéticas dependientes de citocinas con el fin de estudiar su actividad oncogénica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las neoplasias malignas hematológicas, como la función biológica de las mutaciones conductoras cuando se expresan a niveles fisiológicos. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza el sistema de edición genética CRISPR/Cas9 para modelar y estudiar la función biológica de los genes implicados en el cáncer.

Para recocer y fosforilar los oligonucleótidos, se añadan los reactivos hasta un total de 10 microlitros en un tubo de PCR mantenido en hielo. Configure el programa en el termociclador. Use agua para diluir la reacción después de que se complete el ciclo.

Para digerir el vector lentiGuide-Puro, prepare 50 microlitros de reacción del digestor. Luego, inicie la reacción de digestión a 55 grados centígrados en un bloque de calor. Después de una hora, agregue un microlitro adicional de la enzima de restricción BsmB1 y continúe la reacción durante otra hora.

Para desfosforilar el hueso cortado, agregue siete microlitros de tampón de reacción de fosfatasa y dos microlitros de enzima fosfatasa al vector digestivo. Luego, incuba la mezcla a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Purifique la columna vertebral ya cortada y desfosfolada con un kit comercial.

Para preparar la mezcla de ligadura, agregue 15 nanogramos de hueso dorsal digerido y otros reactivos a un tubo de PCR mantenido en hielo y ajuste el volumen a 10 microlitros con agua. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, transforme las células compatibles con STBL3 con dos microlitros de la mezcla de ligadura.

Y luego coloque en la placa de agar caldo de lisogén que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Después de esto, incube la placa durante la noche a 37 grados centígrados. Elige tres colonias e inóculas.

Realice una mini preparación para cada cultivo y secuencie el sitio de inserción de oligonucleótidos con un cebador de región promotor U6. Siembre las células hek293t en un plato de 10 centímetros. Y déjalo incubar durante la noche.

Para preparar la mezcla de ADN para la transfección, pipetee 45 microlitros del reactivo de transfección en el ADN. Utilice una pipeta para mezclar cuidadosamente el ADN y el reactivo de transfección y déjelo reposar durante 20 minutos. Después de esto, agregue la mezcla de transfección de ADN gota a gota en las células sembradas.

Agite suavemente los platos. E incubar al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados durante un día. Recoja el sobrenadante que contiene el virus después de 24 y 48 horas pasándolo a través de un filtro de micromitre de 0,22.

Y alícuota de 1,6 mililitros de sobrenadante en cada vial criogénico. A continuación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células Ba/F3 en el medio pipeteando las células hacia arriba y hacia abajo varias veces. Agregue 500 microlitros de las células resuspendidas, 1,5 mililitros de sobrenadante viral, cuatro microlitros de polibreno y 10 nanogramos por mililitro de interleucina murina 3 en una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos.

Centrifugar la placa a 440 G durante 120 minutos a 37 grados centígrados. Después de la centrifugación, transfiera la placa a una incubadora para la incubación nocturna a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Después de esto, gire las células a 440 g durante tres minutos.

Y vuelva a suspender en cinco mililitros de medio caliente fresco en una placa de seis pocillos. Para seleccionar las células infectadas Cas9, primero gire hacia abajo la celda. Y luego resuspender en medios frescos y tibios suplementados con cinco microgramos por mililitro de blasticidina después de 48 horas de desinfección.

Continúe seleccionando células durante nueve días con blasticidina hasta que todas las células no infectadas estén muertas. Luego, transfiera las células resistentes a un medio con un microgramo por mililitro de blasticidina. Transducir las células parentales y las células que expresan Cas9 de manera estable con la construcción reportera pXPR-011 a través de la infección lentiviral.

Continúe seleccionando células con dos microgramos por mililitro de puromicina durante tres días, 48 horas después de la desinfección. Infectar las células que expresan Cas9 con ácido ribonucleico guía simple utilizando lentivirus. Luego, use dos microgramos por mililitro de puromicina para seleccionar las células durante tres días, 48 horas después de la infección.

Bin las células Ba/F3 de crecimiento exponencial que expresan Cas9 ectópico y el ácido ribonucleico guía único de interés. Aspirar el sobrenadante y lavar las células con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Gire las células hacia abajo y lave con solución salina tamponada con fosfato tres veces.

A continuación, cuente el número de células con un analizador de viabilidad de células. Después de esto, las células de semilla se triplicaron en dos mililitros de medio fresco sin interleucina 3 en placas de cultivo de seis pocillos. Comience a monitorear y contar las células cada dos días durante ocho días.

Aquí se muestran datos psicométricos de flujo representativos que demuestran la actividad de Cas9 en la célula Ba/F3 parental y en las células Cas9 que sobreexpresan Ba/F3. La señal de la proteína fluorescente verde se reduce en un 76% en las células Ba/F3 que sobreexpresan Cas9, lo que indica una actividad robusta de Cas9, mientras que en las células Ba/F3 parentales, la señal de la proteína fluorescente verde permanece al 100%Aquí se muestran las curvas de crecimiento representativas de las células que demuestran actividad oncogénica de la calreticulina. Se introdujo una mutación de cambio de marco mediada por CRISPR/Cas9 más un par de bases en el locus del exón nueve de la calreticulina utilizando RNasa de guía única m1 y m2.

Las curvas de crecimiento para las células Cas9 del receptor de trombopoyetina Ba/F3 dirigidas a la calreticulina muestran un crecimiento independiente de la interleucina 3 murina. Sin embargo, las curvas de crecimiento de los otros tipos de células no muestran ningún crecimiento independiente de las citocinas. Los resultados de la secuenciación confirman la edición en el objetivo del exón nueve de calreticulina endógina en células Cas9 del receptor de trombopoyetina Ba/F3 dirigidas a calreticulina utilizando la RNasa guía simple m1 y m2.

Las mutaciones de cambio de marco del par de bases más uno se indican en negro. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos semanas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante comprender qué tipo de mutaciones en el gen de interés pueden ser responsables del fenotipo deseado.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para caracterizar aún más la mutación, como su papel en la señalización celular o en las interacciones proteína-proteína, con el fin de comprender mejor el mecanismo por el cual causa la enfermedad. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la hematología exploraran el efecto de las mutaciones de ganancia de función a niveles fisiológicos en la transformación celular en células hematopoyéticas Ba/F3. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la metodología de edición de genes CRISPR/Cas9 para investigar la actividad oncogénica de las mutaciones de ganancia de función en células hematopoyéticas dependientes de citocinas.

No olvide que trabajar con lentivirus puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como trabajar en una instalación BL2 plus mientras se realiza este procedimiento.