Name: Medir la expresión génica en capas de aleurona de cebada bombardeado con mayor rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprende a medir la expresión génica en células de aleurona de cebada mediante bombardeo de partículas con mayor rendimiento. Este protocolo automatizado permite analizar múltiples construcciones genéticas simultáneamente.

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Los autores agradecen a Greyson Butler y Margaret Barrett para ayuda en la realización de los experimentos, Judy Stone para asesoramiento sobre homogeneización de grano y Lynn Hannum para asesoramiento en análisis de fluorescencia. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (IOB 0443676), por una concesión de desarrollo institucional (IDeA) desde el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud, bajo la concesión número P20GM0103423 y por las subvenciones de la división del Colby College de Ciencias naturales.

1. preparación del efector y gen reportero construye
<ol><li>Construir estructuras efectoras que emplean a un promotor constitutivo (e.g. ubiquitina de maíz, UBI) a la expresión de la unidad desde un marco de lectura abierto deseada. Por ejemplo, la construcción de un plásmido que contiene UBI::TaABF1 de fuerte expresión constitutiva unidad de TaABF15.</li>
	<li>Construir construcciones reportero que incluyen el promotor cuya actividad es la que se medirá, situado aguas arriba de un marco abierto de lectura, como GUS. Por ejemplo, la construcción de un plásmido que contiene HVA1::GUS para medir la expresión de la HVA1 promotor2,5.</li>
	<li>Construir un concepto de control interno (por ejemplo, UBI::luciferasa).</li>
	<li>Usando una columna de sílice enlace protocolo (véase Tabla de materiales), preparación de plásmido de alta calidad para cada una de las construcciones de genes requeridos. Usando la Espectroscopia ultravioleta (véase Tabla de materiales), cuidadosamente Mida la concentración de cada preparación de plásmido.</li>
</ol>2. preparación de granos de cebada para el bombardeo
<ol><li>Configurar una hoja de cálculo (ver figura 1 para un ejemplo) indicando la plásmidos que será bombardeada, los tratamientos adecuados de la hormona y otra información pertinente para cada tratamiento que será parte del experimento.</li>
	<li>Usando una tabla de cortar y una hoja de afeitar estéril, cortar los embriones de granos de cebada de Himalaya (40 para cada tratamiento en el experimento). Excluir los granos que están decolorados o substancialmente más pequeño que el promedio.</li>
	<li>Coloque los granos de embryoless en un tubo de 50 mL. Añadir 40 mL de agua y roca durante 10 minutos.</li>
	<li>Vierta el agua con cuidado (para evitar la pérdida de granos) y añadir 40 mL de lejía del 10%. Roca durante 20 minutos.</li>
	<li>Verter la lejía y añadir 40 mL de agua estéril. Roca durante 5 minutos. Repita este lavado con agua estéril cuatro veces más.</li>
	<li>Añadir 40 mL de solución bebiendo (succinato de sodio 20 mM, cloruro de calcio 20 mM, pH 5,0) y 40 μL de la solución madre de cloranfenicol (10 mg/mL).</li>
	<li>Transferir la mayor parte de la solución bebiendo (con cloranfenicol) del tubo a una placa de vermiculita (véase Tabla de materiales). Luego se transfieren los granos sobre la superficie de papel de filtro húmedo en la placa de vermiculita. Se extienden los granos uniformemente. Vierta suficiente bebida solución para guardar los granos parcialmente (pero no totalmente) sumergido. Coloque la tapa encima de la placa de vermiculita.</li>
	<li>Incubar los granos embryoless a 24 ° C por cerca de 48 horas con iluminación fluorescente. Añadir solución bebiendo adicional según sea necesario.</li>
	<li>Arriba de un plato de petri plástico 90 mm y vierta 20 mL de solución de ingerir en el plato sí mismo y 20 mL en la tapa invertida. Añadir 20 μL del cloranfenicol (10 mg/mL) a cada uno. Esterilizar de dos pares de pinzas de punta fina por inmersión en alcohol.</li>
	<li>Coloque algunos de los granos de embryoless en la tapa de la caja Petri. Usando las pinzas, suavemente Retire la capa de semilla (transparente) de cada grano. Mientras se retira la capa de semilla desde el lado liso del grano, no dañe las células subyacentes (aleurona). Transferir el grano pelado a la placa de Petri que contenga solución de bebiendo.</li>
	<li>Después de pelar la capa de la semilla de todos los granos, devolverlos a la placa de vermiculita. Incubar los granos pelados embryoless a 24 ° C durante 16-20 horas.</li>
	<li>Antes de usar los granos para el bombardeo, eliminar la humedad superficial por agitación entre papeles de filtro en una placa Petri.</li>
</ol>3. preparación de plásmido ADN para el bombardeo
<ol><li>Etiquetar un tubo de 1,5 mL para cada tratamiento que se incluirán en el experimento de bombardeo. Añadir a cada tubo 2.5 μg de UBI:: plásmido de control interno deluciferasa , 2,5 μg de un plásmido de reportero GUS y la cantidad deseada (generalmente 0.025 μg 2.5 μg) de un plásmido de efector. Añadir agua para hacer el volumen total de 5 μl.</li>
	<li>Preparar 1,6 microcarriers μm oro (véase Tabla de materiales) siguiente publicado protocolos6.</li>
	<li>Para cada tratamiento, añada 50 μl de suspensión microcarriers en tubo de 1,5 mL que contiene el DNA plasmídico. Capa microcarriers con ADN plásmido según protocolos6 fabricante.</li>
	<li>En el paso final, cuando el microcarriers revestido de plásmido se suspenden en 48 μl 100% de etanol, pipeta 8 μL de microcarriers suspendido en cada una de cinco macrocarriers y deje al aire seco.</li>
</ol>4. partícula bombardeo de granos de cebada Embryoless
<ol><li>Configurar el aparato de bombardeo de partículas (véase Tabla de materiales)6.</li>
	<li>Montar en el instrumento y coloque un disco de ruptura de 1550 psi en la tapa de retención.</li>
	<li>Coloque una macrocarrier que contiene la combinación deseada de plásmido (junto con una pantalla de parada) en la Asamblea de lanzamiento de potencia. Inserte el montaje en la ranura superior de la cámara de bombardeo. Ajuste la distancia entre el disco de ruptura conserva la tapa y la tapa de macrocarrier a la distancia estándar (6 mm) y coloque el soporte de la pantalla de parada en la posición media (estándar), lo que permite un recorrido macrocarrier de 11 mm (figura 2A).</li>
	<li>Colocar 8 granos embryoless en un patrón radial apretado (con los extremos más delgados apuntando hacia dentro) en un círculo de papel de filtro que se graba hacia abajo del plano a la tapa de una caja de Petri 90 mm (ver figura 2B).</li>
	<li>Coloque el plato con los granos en la cámara de bombardeo, a una distancia de 6 cm de la pantalla de parada.</li>
	<li>Evacuar la cámara bombardeo a 95 kPa y luego bombardear la muestra.</li>
	<li>Después de lanzar el vacío, transferir los granos bombardeados a un etiquetado 60 mm placa de Petri que contiene 4 mL de solución bebiendo 1 mg/ml de cloranfenicol.</li>
	<li>Repita hasta que todos los bombardeos se han completado. Incubar a 24 ° C 24 horas (en una plataforma de agitación a 100 rpm).</li>
</ol>5. extracción de la proteína Soluble de los granos bombardeados
<ol><li>Con unas pinzas, quitar los 8 granos bombardeados de un plato de petri de 60 mm y borra los seca en una toalla de papel. Dividir los granos en dos tubos etiquetados 2,0 mL (4 granos por tubo), cada una con 800 μL tampón pulir (100 mM Na fosfato pH 7.2, 5 mM DTT, 10 μg/mL leupeptin, 20% de glicerol) y una tira de acero inoxidable de 5 mm. Repita este proceso para todos los granos bombardeados.</li>
	<li>Colocar tubos de 2.0 mL (hasta 48) en las dos parrillas del homogenizador de grano (véase Tabla de materiales). Montar los estantes en el homogenizador.</li>
	<li>Agitar las muestras en 30 Hz durante 3 minutos.</li>
	<li>Retire los soportes de homogeneizador de la homogeneizadora y coloque en hielo (5 min) para volver a enfriar las muestras.</li>
	<li>Instale los estantes en el homogenizador - en la orientación opuesta. Agitar nuevamente las muestras a 30 Hz durante 3 minutos.</li>
	<li>Enfriar las parrillas en el hielo, repita los pasos 5.3 a 5.5. Esto se suman un total de 12 minutos de agitación.</li>
	<li>Centrifugar los extractos de grano a 16.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>
Inmediatamente después de la centrifugación, decantar el sobrenadante claro en un segundo conjunto de tubos de microcentrífuga. Dar cada tubo vortex rápido. Almacenar los tubos en hielo.</li>
	<li>Después de transferir el sobrenadante, recuperar los granos de acero de los pellets para ser lavados y reutilizados.</li>
</ol>6. medición de la actividad de luciferasa de extractos de grano de
<ol><li>Para cada tubo del extracto de grano a ensayar, preparar un tubo de ensayo de vidrio 12 x 75 mm que contiene 200 μL de la mezcla de ensayo de luciferasa (45 mM Tris pH 7.7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1, 5 mM EDTA, luciferin de 1 mM, 1 mM ATP del sulfato).</li>
	<li>Añada 100 μL del extracto de grano primera al primer tubo de ensayo. Vórtice rápidamente para mezclar bien. Inmediatamente Coloque el tubo en el soporte del tubo de luminómetro y cierre la puerta. Una vez terminada la medición, retire el tubo del luminómetro, dejando la puerta abierta para la colocación del tubo siguiente.</li>
	<li>Repita este proceso hasta que todas las muestras han sido medidas.</li>
</ol>7. medición de la actividad de GUS de extractos de grano de
<ol><li>Añadir 200 μL de tampón de ensayo de GUS (50 mM Na fosfato, pH 7,2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 μg/mL leupeptin, metanol 20%, 0,02% de azida sódica) a cada pocillo de una placa bien 96.</li>
	<li>Depositar 50 μL de cada extracto de grano en el correspondiente bien. Después de agregar la mezcla con la punta. Selle la parte superior con la película.</li>
	<li>Incube la placa bien 96 a 37 ° C en la oscuridad durante 20 horas.</li>
	<li>Centrifugue la placa bien 96 a 4.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos y coloque en hielo.</li>
	<li>Añadir 250 μL de 0,2 M de Na2CO3 en cada pocillo de una placa bien negro 96.</li>
	<li>Añadir 6,25 μL de cada mezcla de ensayo centrifugado de GUS a los correspondientes (que contiene 0,2 M Na2CO3) pozo del negro 96 bien la placa. Después de agregar la mezcla con la punta. Son pozos con 6,25 μL de 10 μM, 40 μM y 100 μM 4-methylumbelliferone como estándares.</li>
	<li>Coloque la placa negra en un fluorómetro de placa y leer la fluorescencia de methylumbelliferone. Tomar las lecturas a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de la emisión de 460 nm. Establecer la ganancia del instrumento de forma que un bien que contienen 6.25 μL de 40 μM 4-methylumbelliferone y 250 μL de 0,2 M de Na2CO3 dan una lectura de 1000 unidades de fluorescencia.</li>
</ol>8. Análisis de datos
<ol><li>Introduzca los valores de los análisis de GUS y luciferasa en una hoja de cálculo. Excluir de consideración cualquier muestra con una lectura de luciferase de inferior a 20.000 luminiscencia relativa unidades s-1, esto indica que las construcciones de genes no fueron entregadas con éxito a las células de la aleurona.</li>
	<li>Para cada grano bombardeado con éxito extraer (representando a un grupo de cuatro granos embryoless), calcular la expresión de GUS normalizada de los datos brutos de GUS y luciferasa como sigue: normalizado GUS = [(expresión de GUS - GUS en blanco) x (2.000.000)] / (luciferase expresión-luciferasa en blanco). Nota: Esto normaliza la cantidad de actividad de GUS lo hubiera observado en un bombardeo que dio una lectura de luciferase de 2.000.000.</li>
	<li>Informe el nivel relativo de expresión de una construcción particular reportero en presencia de construcciones efectoras o tratamientos hormonales, siendo probados por comparación con el nivel de expresión en la ausencia de efectores o las hormonas.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Integ.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li>
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<li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li>
<li>Hong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-mediated+regulation+of+a+rice+ABA+responsive+element+binding+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor.</a> Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).</li>
<li>Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABI5+acts+downstream+of+ABI3+to+execute+an+ABA-dependent+growth+arrest+during+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination.</a> Plant J. 32, 317-328 (2002).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS2-LIKE+PROTEIN+KINASE5%2C+an+SNF1-RELATED+PROTEIN+KINASE3-Type+protein+kinase%2C+is+important+for+abscisic+acid+responses+in+Arabidopsis+through+phosphorylation+of+ABSCISIC+ACID-INSESENSITIVE5%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5.</a> Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La introducción del gen efector construye mediante bombardeo de partículas, seguida de la expresión transitoria de construcciones de reportero es una estrategia valiosa para el papel de los actores particulares en la señalización de ABA/GA y en el gen de la hormona regulada resultante de la disección expresión. Sin embargo, los protocolos existentes para llevar a cabo tales experimentos en cebada aleurona células2,3,4,</...

La capa de aleurona de cebada es un sistema de modelo bien establecido para el estudio de la expresión de genes regulados por hormonas en las plantas1. En particular, un número de genes necesarios para la germinación o el desarrollo temprano de la plántula es activado por giberelinas (GA), mientras que los genes asociados con respuestas de estrés son activados por el ácido abscísico (ABA). El GA y ABA vías de señalización están entrelazados, como la expresión de algunos genes de GA activa es inhibida por ABA y viceversa1.
Una estrategia valiosa para entender que el papel de los actores particulares en la señalización de ABA/GA ha sido la introducción de efector gen construcciones mediante bombardeo de partículas, seguida de la expresión transitoria de construcciones de reportero que permiten el efecto resultante en expresión del gen aguas abajo a determinarse. El uso de genes del reportero luciferasa como GUS (β-glucuronidasa) permite la medida sensible y cuantitativa de la expresión génica específicamente dentro de las células que han recibido la construcción del generador de efectos. Por ejemplo, la introducción de un concepto de efector codifican el factor de transcripción TaABF15,6 estableció que los genes inducidos por ABA como HVA1 son inducidos por TaABF1, mientras que de genes inducida por GA como Amy32b son reprimidos. Bombardeo de partículas como una estrategia experimental se ha utilizado por varios laboratorios para investigar diversos aspectos de la señalización de ABA/GA. Dicho trabajo ha conducido a la identificación de los elementos del promotor importantes de la activación inducida por GA2 y3de genes inducidos por ABA y al descubrimiento de la proteína kinasas4 y factores de transcripción5 que regulan la expresión de estos genes.
Los actuales protocolos2,3,4,5,6 por bombardeo de partículas y medición posterior de la expresión génica transitoria son bastante mano de obra, como cada juego de bombardea apenas granos se homogeneiza con la mano en un mortero y los análisis de enzima se llevan a cabo individualmente. Este manuscrito informa un protocolo mejorado que parcialmente automatiza y simplifica el paso de homogeneización y GUS ensayos para permitir un rendimiento significativamente más, permitiendo un mayor número de tratamientos en el mismo experimento, o la inclusión de más repeticiones para cada tratamiento obtener resultados estadísticamente robustos más. Se muestran resultados representativos para la expresión de construcciones de reportero HVA1 y Amy32b , regulado por el factor de transcripción TaABF1, así como por otras moléculas reguladoras, GA y ABA.

<table><tbody><tr><td>Kit Maxiprep de plásmido HP GeneElute</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-vis</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Granos de cebada del Himalaya</td><td>/</td><td>/</td><td>Una variedad de cebada sin cáscara (almacenar en la oscuridad a 4&deg; C)</td></tr><tr><td>succinato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Reactivo para solución de imbebida</td></tr><tr><td>cloruro de calcio (dihidratado)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Reactivo para solución de imbebida</td></tr> solución <tr>de<td>bebe</td><td>casera</td><td>/</td><td>20 mM de succinato de sodio, 20 mM de cloruro de calcio, pH 5.0. Esterilizar en autoclave antes de usar.</td></tr><tr><td>cloranfenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Prepare una solución madre de 10 mg/mL en etanol al 70%.</td></tr><tr><td>vermiculita</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>Se utiliza para placas de vermiculita.</td></tr>círculos <tr><td>de papel de filtro (90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>Se utiliza para la vermiculita y para la preparación de grano antes del bombardeo</td></tr><tr><td>Placas de vermiculita</td><td>caseras</td><td>/</td><td>Añadir 50 mL de vermiculita a una placa de Petri de vidrio. Coloca un círculo de papel de 90 mm encima de la vermiculita. Autoclave.</td></tr><tr><td>pinzas (de punta fina)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>Se utiliza para eliminar la capa de semillas de los granos de cebada.</td></tr><tr><td>pinzas (punta ultrafina)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>Se utiliza para eliminar la capa de semillas de los granos de cebada.</td></tr><tr><td>Microportadores de oro (1.6 &mu; m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>macroportadores</td><td>BioRad 1652335</td><td>cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de calcio (dihidratado)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Prepare una solución madre de 2,5 M y almacene alícuotas de 1 mL a -20 °C.</td></tr><tr><td>espermidina</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>Prepare una solución madre de 100 mM y almacene 500 &mu; L alícuotas a -20&deg; C (usar dentro de los 2 meses).</td></tr><tr><td>discos de ruptura (1550 psi)</td>Cribas de parada <td>de 1652331</td><td></td> <td>BioRad</td></tr><tr><td>Soportes de macroportadores</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic sistema de suministro de partículas BioRad</td><td></td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>fosfato sódico monobásico monohidratado</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Reactivo para fosfato sódico 1M pH 7,2</td></tr><tr><td>fosfato de sodio dibásico</td><td></td><td>Sigma S9763</td><td>Reactivo para fosfato de sodio 1M pH 7.2</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio 1M pH 7.2</td><td>hecho en casa</td><td>/</td><td>Combine 6.9 g de fosfato de sodio monobásico monohidratado con 7.1 g de fosfato de sodio dibásico. Agregue agua a 100 mL. Agregue NaOH para obtener un pH de 7.2.</td></tr><tr><td>ditiothrietol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>Disolver en agua hasta 1 M. Almacenar a -20 grados en alícuotas de 1 mL.</td></tr><tr><td>leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Disolver en agua a 10 mg/mL. Almacene a -20 ° . </td></tr><tr><td>C.glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Prepare una solución al 50% en agua.</td></tr><tr><td>Tampón de molienda</td><td>casero</td><td>/</td><td>Combine 10 mL de fosfato de sodio 1 M pH 7.2, 500 &mu; L de 1 M TDT, 100 &mu; L de 10 mg/mL de leupeptina y 40 mL de glicerol al 50%. Agregue agua a 100 mL.</td></tr><tr><td>perlas de acero inoxidable (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>Este modelo específico de tubo se recomienda para su uso con el homogeneizador.</td></tr><tr><td>homogeneizador de perlas (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>tubos de ensayo de vidrio de 12 mm x 75 mm</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>luciferina</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>Prepare una solución madre de 25 mM y almacene alícuotas de 1 mL a -20 ° C.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>Prepare una solución madre de 100 mM y almacene 250 &mu; L alícuotas a -20&deg; &nbsp;C.</td></tr><tr><td>Reactivo Tris base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>para 1M Tris sulfato pH 7.7.</td></tr><tr>ácido <td>sulfúrico</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>Reactivo para sulfato de tris 1M pH 7.7.</td></tr><tr><td>1M Tris sulfato pH 7,7</td><td>casero</td><td>/</td><td>Disolver 12,1 g Tris base en 100 mL de agua. Ajuste el pH a 7.7 con ácido sulfúrico.</td></tr><tr><td>cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>Disolver en agua hasta 2 M.</td></tr><tr><td>Tampón de ensayo de luciferasa (LAB)</td> <td>hecho en casa</td><td>/</td><td>Combine 3 mL de 1 M de sulfato de tris pH 7.7, 500 &mu; L de 2 M de cloruro de magnesio, 1 mL de 1 M de DTT y 200 &mu; L de 0,5 m de EDTA. Agregue agua a 50 &nbsp; Ml.</td></tr><tr><td>Mezcla de ensayo de luciferasa</td><td>casera</td> <td>/</td> <td>Combine 15 mL de LAB, 800 &mu; L de 25 mM de luciferina, 200 &mu; L de 100 mM de ATP, y 4 mL de agua. Esto hace que la mezcla de ensayo sea suficiente (20&nbsp; mL) para 100 ensayos de luciferasa.</td></tr><tr><td>luminómetro (Sirius)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbelliferil-&beta;-D-glucurónido (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>Se disuelve en DMSO a 100 mM.</td></tr><tr><td>azida sódica</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Prepare una solución madre al 2% en agua y almacene alícuotas de 1 mL a -20 °C.</td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos (estándar)</td><td>Tampón</td><td></td> de ensayo Fisher 12565501 <td></td></tr><tr><td>GUS</td><td>hecho en casa</td><td>/</td><td>Combine 2,5 mL de MUG, 5 mL de fosfato de sodio 1 M pH 7,2, 400 &mu; L de 0,5 M de EDTA, 1 mL de 1 M de TDT, 100 &mu; L de 10 mg/ml de leupeptina, 20 mL de metanol y 1 mL de azida sódica al 2%. Agregue agua a 100 mL.</td></tr><tr><td>Película de sellado TempPlate</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos (negro)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>carbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>Prepare una solución de 200 mM en agua.</td></tr><tr><td>4-metilumbeliferona</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Prepare un 100 &mu; M solución en agua. Congele 1 mL de alícuotas a -20 grados; &nbsp;C.</td></tr><tr><td>lector de fluouresencia de microplacas</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

medir la expresión génica en capas de aleurona de cebada bombardeado con mayor rendimiento

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

La capa de aleurona de cereales de cebada es un sistema de modelo importante para la expresión de genes regulados por hormonas en las plantas. En las células de la aleurona, genes requieren para la germinación o desarrollo temprano de la plántula son activados por giberelinas (GA), mientras que los genes asociados con respuestas de estrés son activados por el ácido abscísico (ABA). Los mecanismos de señalización de GA y ABA pueden ser interrogados por introducir reportero gene construcciones en las células de aleurona mediante bombardeo de partículas, con la expresión transitoria resultante medida mediante pruebas enzimáticas. Se divulga un protocolo mejorado parcialmente que automatiza y agiliza el paso de homogeneización del grano y el análisis de enzima, lo que permite mucho más rendimiento que los métodos existentes. Homogeneización de las muestras de grano se lleva a cabo utilizando un homogeneizador de tejidos automatizados, y GUS (β-glucuronidasa) los ensayos se llevan a cabo mediante un sistema de placa de 96 pocillos. Resultados representativos usando el protocolo sugieren que la actividad de la fosfolipasa D puede desempeñar un papel importante en la activación de la expresión de genes HVA1 por ABA, a través del factor de transcripción TaABF1.

La técnica descrita aquí puede utilizarse para introducir cualquier prueba gen construcción en células de aleurona de granos de cebada. El nivel de expresión del gen de la prueba puede entonces ser medido convenientemente (figura 2). El protocolo de rendimiento más alto descrito aquí grandemente aumenta la eficiencia de la molienda de la semilla y pasos de análisis de enzima. Este método se ha utilizado para evaluar la capacidad del factor de transcripción Ta...

Se presenta un protocolo mejorado para la medición de la expresión de genes transitorios de construcciones de reportero en las células de aleurona de cebada después de bombardeo de partículas. La combinación de grano automático con placa de 96 pozos análisis de enzima proporciona alto rendimiento para el procedimiento.

Medir la expresión génica en capas de aleurona de cebada bombardeado con mayor rendimiento

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la expresión génica de las construcciones reporteras después de introducirlas en las células de aleurona de cebada mediante bombardeo de partículas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la expresión génica regulada por hormonas vegetales, como cómo actúan las moléculas de señalización específicas para regular el ácido abscísico en genes inducidos por la cebada. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un mayor rendimiento que los métodos anteriores, lo que permite probar un gran número de construcciones genéticas y condiciones de incubación.La demostración del protocolo estará a cargo de Grace, una estudiante de mi laboratorio. Primero, coloque algunos granos sin embriones en la tapa de una placa de Petri de plástico de 90 milímetros que contiene 20 mililitros de solución para beber y 20 microlitros de cloranfenicol. Con pinzas estériles, retire suavemente la capa transparente de la semilla de cada grano.Pelar las cubiertas de las semillas del grano de cebada es un paso crítico. Si las cubiertas de las semillas no se eliminan por completo, se evitará que los microportadores de oro ingresen a las células de aleurona. Pero si el peeling se hace de forma demasiado brusca, las células de aleurona pueden dañarse.Después de pelar la cubierta de la semilla de todos los granos, transfiéralos de la placa de Petri a una placa de vermiculita. Luego, coloque los granos pelados sin embriones en una incubadora a 24 grados centígrados durante 16-20 horas. Ahora, etiquete un tubo de un punto cinco mililitros de cada tratamiento que se incluirá en el experimento de bombardeo.A cada tubo, agregue dos coma cinco microgramos de plásmido de control interno de luciferasa UBI, dos coma cinco microgramos de un plásmido indicador GUS y la cantidad deseada de un plásmido efector. Agregue agua ultrapura a cada tubo para llevar el volumen total a cinco microlitros. Para cada tratamiento, agregue 50 microlitros de microportadores suspendidos en glicerol al 50% en cada tubo de un punto cinco mililitros que contenga ADN plasmídico.En el paso final del procedimiento de codificación de microportadores, pipetee ocho microlitros de microportadores suspendidos en cada uno de los cinco macroportadores y déjelos secar al aire. Configure el aparato de bombardeo de partículas encendiendo la bomba de vacío, abriendo la válvula de helio y luego encendiendo el sistema de suministro de partículas. Coloque un disco de ruptura de 1550 psi en la tapa de retención y móntelo en el sistema de suministro de partículas.Coloque un macroportador que contenga la combinación de plásmido deseada con una pantalla de parada en el conjunto de lanzamiento del microportador. Inserte el conjunto en la ranura superior de la cámara de bombardeo. A continuación, coloque ocho granos sin embriones en un patrón radial apretado con los extremos más delgados apuntando hacia adentro en un círculo de papel de filtro que se pega con cinta adhesiva a la tapa de una placa de Petri de 90 mililitros.Coloque el plato con los granos en la cámara de bombardeo a una distancia de seis centímetros de la pantalla de parada. Cierre la puerta y presione el interruptor de vacío para evacuar la cámara de bombardeo a 95 kilopascales. Gire rápidamente el interruptor de vacío a la posición de retención.A continuación, mantenga pulsado el interruptor de disparo para bombardear la muestra. Después de liberar el vacío, transfiera los granos bombardeados a una placa de Petri etiquetada de 60 milímetros que contenga cuatro mililitros de solución para beber con un miligramo por mililitro de cloranfenicol. Repita hasta que se hayan completado todos los bombardeos.Luego, incubar los granos bombardeados en una plataforma de agitación a 100 rpm a 24 grados centígrados durante 24 horas. Con pinzas, retira los ocho granos bombardeados de la placa de Petri de 60 milímetros y sécalos con una toalla de papel. Divida los granos en dos tubos etiquetados de dos mililitros, cada uno con 800 microlitros de tampón de molienda y una cuenta de acero inoxidable de cinco milímetros.Después de repetir el paso anterior para todos los granos bombardeados, coloque hasta 48 tubos de dos mililitros en dos rejillas de un homogeneizador de cuentas. A continuación, monte las gradillas en el homogeneizador y agite las muestras a 30 hercios durante tres minutos. Cuando termine, retire las rejillas del homogeneizador y colóquelas en hielo durante cinco minutos para volver a enfriar las muestras.Ahora, monte los bastidores en el homogeneizador en la dirección opuesta. Agite las muestras de nuevo a 30 hercios durante tres minutos. Después de retirar las gradillas del homogeneizador, colóquelas en hielo durante cinco minutos para volver a enfriar las muestras.A continuación, centrifugar los extractos de grano a 16.000 g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Inmediatamente después de la centrifugación, decantar los sobrenadantes transparentes en un segundo juego de tubos de microcentrífuga. Agite brevemente cada tubo y guárdelo en hielo.Después de transferir el sobrenadante, recupere las perlas de acero inoxidable de los pellets para que puedan lavarse y reutilizarse. Ahora agregue 200 microlitros de tampón de ensayo GUS a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Coloque 50 microlitros de cada extracto de grano en uno de los pocillos y mezcle con la punta de la pipeta.Luego, selle la parte superior de la placa con una película de sellado. Coloque la placa de 96 pocillos en una incubadora en la oscuridad a 37 grados centígrados durante 20 horas. Después de la incubación, centrifugar la placa de 96 pocillos a 4.000 g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Cuando termines, coloca el plato sobre hielo. Ahora, agregue 250 microlitros de cero coma dos molares de carbonato de sodio a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos. Añada seis coma dos cinco microlitros de cada mezcla de ensayo GUS centrifugada en cada pocillo de la placa negra y mezcle con la punta de la pipeta.Incluya pocillos con seis coma dos cinco microlitros de 10-40 a 100 micromolares, cuatro metilumbeliferona como estándares. Coloque la placa negra en un fluorómetro de placa. Lea la fluorescencia de la metilumbeliferona estableciendo la ganancia del instrumento, de modo que un pocillo que contenga seis coma dos cinco microlitros de 40 micromolares, cuatro metilumbeliferona y 250 microlitros de carbonato de sodio de cero coma dos molares dé una lectura de 100 unidades de fluorescencia.En este experimento, se introdujo una construcción reportera de GUS HVA1 en células de aleurona junto con una construcción efectora de UBI TaABF1. Mientras que una relación TaABF1 HVA1 de solo cero punto cero, uno fue suficiente para causar una inducción triple del gen reportero HVA1 en ausencia de ácido abssyssico exogénico o ABA. Los niveles más altos del constructo TaABF1 dieron lugar a una expresión de HVA1 progresivamente mayor de forma dependiente de la dosis.Tanto los exógenos ABA como TaABF1 podrían inducir fuertemente la expresión del constructo reportero HVA1 GUS. En cualquier caso, la presencia de un butanol inhibió fuertemente la inducción de HVA1, lo que sugiere que la fosfolipasa D podría desempeñar un papel importante en la activación de la expresión génica de HVA1 por ABA a través de TaABF1. Se demostró que el ABA inhibe fuertemente la expresión inducida por giberelina para el constructo reportero Amy32b GUS.Mientras que ni el peróxido de hidrógeno ni el nitroprusiato de sodio causaron ninguna reducción significativa. Estos resultados, por lo tanto, no respaldan el papel del óxido nítrico y el peróxido de hidrógeno en las respuestas de ABA de las células de aleurona. Una vez dominada, esta técnica puede permitir medir la expresión génica de muchas muestras diferentes en un tiempo relativamente corto.Por ejemplo, el bombardeo de 200 muestras de grano diferentes puede ser realizado por dos investigadores en un par de horas. Luego, al día siguiente, un solo investigador puede preparar todos los extractos de proteínas en dos horas. El ensayo GUS modificado llevado a cabo en placas de 96 pocillos también requiere mucha menos mano de obra que otros protocolos que se utilizan en los futuros ensayos de tubos.

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Research

Investigación

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Secuenciación de ARN-Secuenciación de ARN-Captura láser para Análisis de Expresión Genética Espacial y Temporal Específica de Tejidos en Plantas

Aprende a medir la expresión génica en células de aleurona de cebada mediante bombardeo de partículas con mayor rendimiento. Este protocolo automatizado permite analizar múltiples construcciones genéticas simultáneamente.

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