Medir la expresión génica en capas de aleurona de cebada bombardeado con mayor rendimiento

El objetivo general de este procedimiento es medir la expresión génica de las construcciones reporteras después de introducirlas en las células de aleurona de cebada mediante bombardeo de partículas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la expresión génica regulada por hormonas vegetales, como cómo actúan las moléculas de señalización específicas para regular el ácido abscísico en genes inducidos por la cebada. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un mayor rendimiento que los métodos anteriores, lo que permite probar un gran número de construcciones genéticas y condiciones de incubación.

La demostración del protocolo estará a cargo de Grace, una estudiante de mi laboratorio. Primero, coloque algunos granos sin embriones en la tapa de una placa de Petri de plástico de 90 milímetros que contiene 20 mililitros de solución para beber y 20 microlitros de cloranfenicol. Con pinzas estériles, retire suavemente la capa transparente de la semilla de cada grano.

Pelar las cubiertas de las semillas del grano de cebada es un paso crítico. Si las cubiertas de las semillas no se eliminan por completo, se evitará que los microportadores de oro ingresen a las células de aleurona. Pero si el peeling se hace de forma demasiado brusca, las células de aleurona pueden dañarse.

Después de pelar la cubierta de la semilla de todos los granos, transfiéralos de la placa de Petri a una placa de vermiculita. Luego, coloque los granos pelados sin embriones en una incubadora a 24 grados centígrados durante 16-20 horas. Ahora, etiquete un tubo de un punto cinco mililitros de cada tratamiento que se incluirá en el experimento de bombardeo.

A cada tubo, agregue dos coma cinco microgramos de plásmido de control interno de luciferasa UBI, dos coma cinco microgramos de un plásmido indicador GUS y la cantidad deseada de un plásmido efector. Agregue agua ultrapura a cada tubo para llevar el volumen total a cinco microlitros. Para cada tratamiento, agregue 50 microlitros de microportadores suspendidos en glicerol al 50% en cada tubo de un punto cinco mililitros que contenga ADN plasmídico.

En el paso final del procedimiento de codificación de microportadores, pipetee ocho microlitros de microportadores suspendidos en cada uno de los cinco macroportadores y déjelos secar al aire. Configure el aparato de bombardeo de partículas encendiendo la bomba de vacío, abriendo la válvula de helio y luego encendiendo el sistema de suministro de partículas. Coloque un disco de ruptura de 1550 psi en la tapa de retención y móntelo en el sistema de suministro de partículas.

Coloque un macroportador que contenga la combinación de plásmido deseada con una pantalla de parada en el conjunto de lanzamiento del microportador. Inserte el conjunto en la ranura superior de la cámara de bombardeo. A continuación, coloque ocho granos sin embriones en un patrón radial apretado con los extremos más delgados apuntando hacia adentro en un círculo de papel de filtro que se pega con cinta adhesiva a la tapa de una placa de Petri de 90 mililitros.

Coloque el plato con los granos en la cámara de bombardeo a una distancia de seis centímetros de la pantalla de parada. Cierre la puerta y presione el interruptor de vacío para evacuar la cámara de bombardeo a 95 kilopascales. Gire rápidamente el interruptor de vacío a la posición de retención.

A continuación, mantenga pulsado el interruptor de disparo para bombardear la muestra. Después de liberar el vacío, transfiera los granos bombardeados a una placa de Petri etiquetada de 60 milímetros que contenga cuatro mililitros de solución para beber con un miligramo por mililitro de cloranfenicol. Repita hasta que se hayan completado todos los bombardeos.

Luego, incubar los granos bombardeados en una plataforma de agitación a 100 rpm a 24 grados centígrados durante 24 horas. Con pinzas, retira los ocho granos bombardeados de la placa de Petri de 60 milímetros y sécalos con una toalla de papel. Divida los granos en dos tubos etiquetados de dos mililitros, cada uno con 800 microlitros de tampón de molienda y una cuenta de acero inoxidable de cinco milímetros.

Después de repetir el paso anterior para todos los granos bombardeados, coloque hasta 48 tubos de dos mililitros en dos rejillas de un homogeneizador de cuentas. A continuación, monte las gradillas en el homogeneizador y agite las muestras a 30 hercios durante tres minutos. Cuando termine, retire las rejillas del homogeneizador y colóquelas en hielo durante cinco minutos para volver a enfriar las muestras.

Ahora, monte los bastidores en el homogeneizador en la dirección opuesta. Agite las muestras de nuevo a 30 hercios durante tres minutos. Después de retirar las gradillas del homogeneizador, colóquelas en hielo durante cinco minutos para volver a enfriar las muestras.

A continuación, centrifugar los extractos de grano a 16.000 g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Inmediatamente después de la centrifugación, decantar los sobrenadantes transparentes en un segundo juego de tubos de microcentrífuga. Agite brevemente cada tubo y guárdelo en hielo.

Después de transferir el sobrenadante, recupere las perlas de acero inoxidable de los pellets para que puedan lavarse y reutilizarse. Ahora agregue 200 microlitros de tampón de ensayo GUS a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Coloque 50 microlitros de cada extracto de grano en uno de los pocillos y mezcle con la punta de la pipeta.

Luego, selle la parte superior de la placa con una película de sellado. Coloque la placa de 96 pocillos en una incubadora en la oscuridad a 37 grados centígrados durante 20 horas. Después de la incubación, centrifugar la placa de 96 pocillos a 4.000 g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Cuando termines, coloca el plato sobre hielo. Ahora, agregue 250 microlitros de cero coma dos molares de carbonato de sodio a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos. Añada seis coma dos cinco microlitros de cada mezcla de ensayo GUS centrifugada en cada pocillo de la placa negra y mezcle con la punta de la pipeta.

Incluya pocillos con seis coma dos cinco microlitros de 10-40 a 100 micromolares, cuatro metilumbeliferona como estándares. Coloque la placa negra en un fluorómetro de placa. Lea la fluorescencia de la metilumbeliferona estableciendo la ganancia del instrumento, de modo que un pocillo que contenga seis coma dos cinco microlitros de 40 micromolares, cuatro metilumbeliferona y 250 microlitros de carbonato de sodio de cero coma dos molares dé una lectura de 100 unidades de fluorescencia.

En este experimento, se introdujo una construcción reportera de GUS HVA1 en células de aleurona junto con una construcción efectora de UBI TaABF1. Mientras que una relación TaABF1 HVA1 de solo cero punto cero, uno fue suficiente para causar una inducción triple del gen reportero HVA1 en ausencia de ácido abssyssico exogénico o ABA. Los niveles más altos del constructo TaABF1 dieron lugar a una expresión de HVA1 progresivamente mayor de forma dependiente de la dosis.

Tanto los exógenos ABA como TaABF1 podrían inducir fuertemente la expresión del constructo reportero HVA1 GUS. En cualquier caso, la presencia de un butanol inhibió fuertemente la inducción de HVA1, lo que sugiere que la fosfolipasa D podría desempeñar un papel importante en la activación de la expresión génica de HVA1 por ABA a través de TaABF1. Se demostró que el ABA inhibe fuertemente la expresión inducida por giberelina para el constructo reportero Amy32b GUS.

Mientras que ni el peróxido de hidrógeno ni el nitroprusiato de sodio causaron ninguna reducción significativa. Estos resultados, por lo tanto, no respaldan el papel del óxido nítrico y el peróxido de hidrógeno en las respuestas de ABA de las células de aleurona. Una vez dominada, esta técnica puede permitir medir la expresión génica de muchas muestras diferentes en un tiempo relativamente corto.

Por ejemplo, el bombardeo de 200 muestras de grano diferentes puede ser realizado por dos investigadores en un par de horas. Luego, al día siguiente, un solo investigador puede preparar todos los extractos de proteínas en dos horas. El ensayo GUS modificado llevado a cabo en placas de 96 pocillos también requiere mucha menos mano de obra que otros protocolos que se utilizan en los futuros ensayos de tubos.