Name: Colección y extracción de muestras de aire profesional para análisis de ADN fúngico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprende a extraer ADN de muestras de aire profesional para identificar hongos mediante secuenciación de regiones ITS. Este método mejora la evaluación de riesgos ocupacionales al detectar especies fúngicas no visibles con técnicas tradicionales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado en parte por un acuerdo interinstitucional entre NIOSH y de NIEHS (AES12007001-1-0-6).

1. preparación de la muestra de aerosol NIOSH
Nota: La muestra de aerosol NIOSH es un dechado de aerosol de ciclón de dos etapas que recoge bioaerosoles utilizando dos tubos de muestreo y un filtro de politetrafluoroetileno (PTFE).
<ol><li>Antes del montaje, inspeccione con cuidado el muestreador. Compruebe el sampler para asegurarse de que no se daña, todos los tornillos estén colocadas y esté ajustada y el precinto alrededor de la costura formado por las dos mitades está intacta. Inspeccione el dechado junta tórica para que no tengan cualquier mellas, grietas o desgarros y que tiene una muy ligera capa de grasa de silicona. Nota: El sampler incluye un filtro PTFE de 37 mm 3 μm en un casete de filtro tres piezas polipropileno o poliestireno.<ol>
<li>Montar el cartucho de filtro colocando una celulosa o plástico almohadilla de apoyo (incluida con los filtros) en la superficie cuadriculada de la pieza base (ver figura 1). Utilizar filtro pinzas para colocar el filtro sobre la almohadilla de apoyo con la colección hacia arriba.</li>
		<li>Sellar los cartuchos del filtro utilizando una prensa manual o neumática. Cierre de mano permitirá que el aire alrededor del filtro y reducir la eficacia de la colección. Introducir la pieza en forma de anillo (la chimenea de la extensión) y utilice la prensa para empujar hacia abajo firmemente y de manera uniforme. Presione hacia abajo la chimenea de la extensión en el filtro lo suficientemente bien como para no tener fugas de aire alrededor del filtro. Nota: La pieza superior del cassette no se utiliza mientras que muestras pero para cubrir el filtro una vez completada la toma de muestras se debe guardar.</li>
		<li>Montar el casete montado en la parte superior del muestreador y empújela hacia abajo tanto como sea posible. Envolver un trozo de cinta de 19 mm (3/4 pulgada) alrededor del exterior del cartucho de filtro y sampler mantenga el cartucho de filtro en su lugar y actuar como un sello de copia de seguridad para evitar fugas.</li>
		<li>Atornille cada tubo firme y completamente en el sampler hasta y envolver cinta alrededor de cada tubo para actuar como un sello secundario contra fugas. Nota: El primer tubo, un tubo de polipropileno de 15 mL, recoge las partículas no-respirables con un diámetro aerodinámico de > 4 μm. El segundo tubo, un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1.5 mL, recoge las partículas respirables entre 1 y 4 μm. Las partículas más pequeñas restantes, < 1 μm, se recogen en el PTFE filtro (ver figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrar el flujo de aire a través del sampler NIOSH con un tarro de calibración antes de cada uso ya que el flujo de aire variar las diferencias en los filtros y los samplers.<ol>
<li>Para utilizar un recipiente de calibración, insertar conexión de Luer de la jarra en la parte superior del cartucho de filtro, colocar el muestreador en la jarra y sellar la jarra.</li>
		<li>Conecte el recipiente de calibración de un medidor de flujo de calibración y la bomba de muestreo. Encienda el medidor de flujo y deje que se caliente por unos minutos. Tenga en cuenta que el medidor de flujo debe tener siempre un filtro conectado a su entrada para evitar contaminar el medidor de flujo y el sampler.</li>
		<li>Encienda la bomba de muestreo y déjelo funcionar durante unos minutos calentar y estabilizar.</li>
		<li>Ajustar la bomba para fijar el caudal correcto a 3,5 L/min. Nota: El caudal para el sampler de aerosol NIOSH se establece generalmente a 3,5 L/min. En este flujo, el muestreador se ajusta a los criterios de la ACGIH/ISO para muestreo de partículas respirables16. Otras tasas de flujo pueden utilizarse si el corte diferentes tamaños se desean o para reducir el nivel de ruido, pero ten en cuenta que si se utiliza un caudal diferente, entonces el sampler ya no cumplirá los criterios de muestreo respirable.</li>
		<li>Cuando la calibración haya terminado, apague la bomba y el medidor de flujo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. muestreo de aerosoles estática y personal
<ol><li>Configurar el dechado de aerosol NIOSH para cada muestreo de área personal o estático. Nota: Muestreo estático se refiere al uso de la muestra de aerosol mientras está conectado a un trípode u otro dispositivo de retención (ver figura 3), como contra el personal de muestreo cuando el sampler y la bomba están montados sobre la persona estudiada (ver figura 4).<ol>
<li>Para el muestreo de área estática, seguirán estudiando los samplers tan cerca como sea posible para el área específica. Mantenga los muestreadores de entradas de aire, entradas de habitación y lugares que podrían estar en la ruta del flujo de aire. Nota: Las concentraciones de Aerosol pueden variar considerablemente incluso en distancias cortas, especialmente si la fuente de aerosoles está en la sala17.</li>
		<li>Para el muestreo personal, configurar el muestreador en la zona de respiración de la persona. Colocar el muestreador a la solapa, hombros o pecho y coloque la bomba de muestreo en la cintura o en una mochila. Nota: La zona de respiración se supone comúnmente que un hemisferio de 30 cm alrededor de la nariz de una persona de que se extrae la mayoría del aire durante la inhalación17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asegúrese de que el muestreador de tubo es bien claro de las tomas de muestras y que nada es obstruir las entradas de o interferir con el flujo de aire en el sampler. El muestreador de tubo no está aplastado o doblado. Cualquier bloqueo hará que la bomba se detenga.</li>
	<li>Activar las bombas. Después de uno o dos minutos, comprobar si las bombas están funcionando todavía. Nota: Conducta aire muestreo por periodos de tiempo que van desde tan sólo 10 minutos a un turno de trabajo completo de 8 h, dependiendo del medio ambiente10,18,19. Los resultados presentados en la figura 6 son representativas de un período de muestreo de 60 min en un ambiente interior.</li>
	<li>Después de completa el muestreo de aire, recoger los tubos de muestra y el filtro. Quitar el precinto, desenroscar los tubos y la tapa les. Poner la tercera pieza de la casete de filtro sobre el filtro. Almacenar las muestras a 4 ° C hasta que esté listo para el proceso.</li>
</ol>3. extracción de DNA genómico de muestras de aire
<ol><li>Extraiga el DNA genómico (gDNA) de cada etapa del NIOSH BC251 sampler. Proceso el tubos de muestreo de aire y filtro por separado para permitir la determinación de aerosoles microbianos respirables y no-respirables en la muestra. Nota: Como alternativa, las tres etapas pueden combinar y extrae si inóculo de la muestra es demasiado pequeña.<ol>
<li>En una clase de gabinete de seguridad biológica II o banco limpio del flujo laminar, asépticamente Retire el filtro. Limpie el cartucho de muestreo utilizando etanol al 70% y palanca el cassette de muestreo utilizando una herramienta de apertura de cassette. Utilice un elevador de filtro para Presione la almohadilla del filtro y hacia arriba. Agarre el filtro con unas pinzas de filtro y colocar en una placa Petri estéril. El filtro de corte en 6 partes iguales y colocarlos en un tubo de 2 mL reforzado que contiene perlas de vidrio de 300 mg (0.2 - 0.5 mm).</li>
		<li>Coloque el tubo que contiene el filtro en nitrógeno líquido durante 30 s y colocar inmediatamente en un homogeneizador de molino de grano a 4,5 m/s a 30 s.</li>
		<li>Repita el paso 3.1.2 una vez o dos veces hasta que el filtro está destrozado. Pueden quedar pequeños trozos de filtro intacto. Agregar 0,5 mL de tampón de lisis (urea de 4 M, 200 mM Tris, 20 mM de NaCl, ácido etilendiaminotetracético de 200 mM (EDTA), pH 7,4).</li>
		<li>Agregar 0,3 mL de tampón de lisis a los 15 mL y tubos de muestras de aire de 1,5 mL. Vórtice el tubo 10-15 s, mientras que en posición vertical y luego otro 10-15 s invertida. Transferir el contenido de cada tubo a los tubos 2 mL reforzado que contiene perlas de vidrio de 300 mg. Nota: la mayor parte del material recogido en cada tubo del muestreador se acumulará en la parte superior del tubo.</li>
		<li>Procesar todos los tubos en el homogenizador de molino de grano a 4,5 m/s de 30 s y centrifugue a 20.000 x g durante 1 min a 22 ° C. Transferencia de sobrenadantes a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril y centrifugar los tubos a 20.000 x g otra vez durante 1 min a 22 ° C. Repita este paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 30 μl de reactivo de lisis (véase Tabla de materiales) a cada tubo e incubar los tubos a 37 ° C durante 15 minutos.</li>
	<li>Añadir 0,2 mL de tampón de unión (10 M urea, guanidina-HCl de 6 M, 10 mM Tris-HCl, 20% Tritón X-100, pH 4.4) y proteinasa K (100 μg/mL) a cada tubo e incubar los tubos a 70 ° C por 10 minutos añadir 100 μl de isopropanol a cada tubo.</li>
	<li>Transferir las soluciones de extracto fibra filtro tubos de vidrio (capacidad de 700 μL) en tubos de 2 mL y centrifugar los tubos de la colección a 20.000 x g durante 30 s a 22 ° C. Deseche los tubos y colocar los tubos de filtro en nuevos tubos de recogida de 2 mL.</li>
	<li>Añadir 0,5 mL de tampón de extracción de inhibidor (5 M guanidina-HCl 20 mM Tris-HCl, pH 6.6, 38% de etanol) a cada tubo y centrifugar los tubos de la colección a 20.000 x g durante 30 s a 22 ° C. Deseche los tubos y colocar los tubos de filtro en nuevos tubos de recogida de 2 mL.</li>
	<li>Añadir 0,5 mL de tampón de lavado (20 mM de NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7,5, etanol al 80%) a cada tubo y centrifugar los tubos de la colección a 20.000 x g durante 30 s a 22 ° C. Deseche los tubos y colocar los tubos de filtro en nuevos tubos de recogida de 2 mL. Repita este proceso.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 20.000 x g durante un 1 minuto adicional a 22 ° C para eliminar cualquier tampón de lavado residual. Deseche los tubos y colocar los tubos de filtro en nuevos tubos de recogida.</li>
	<li>Añadir 100 μl tampón de elución (≥70 º C) (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) a cada tubo de caliente y ellos incubar a temperatura ambiente durante 1-2 min centrifugar los tubos a 20.000 x g durante 30 s a 22 ° C. Transferir los tubos de vacío del filtro a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril y vuelva a aplicar eluatos de paso 3.8. Incubar a temperatura ambiente durante 1-2 min centrífuga a 20.000 x g durante 30 s a 22 ° C. Nota: Eluidos pueden utilizarse inmediatamente para el paso 4 o almacenado a-20 ° C hasta que esté listo para usar. ADN genómico puede conservarse hasta un año a-20 ° C. Se recomienda almacenar ADN a-80 ° C, si se requiere el almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>4. amplificación de ADN ribosomal de hongos
<ol><li>Utilizar cebadores universales hongos para amplificar las regiones 1 y 2 del gDNA extraído. Nota: Para este protocolo, el primer par Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') se utilizan para proporcionar la mayor cobertura de sus regiones4,5. Otros conjuntos de la cartilla, como los que amplifican las regiones ITS1 o ITS2 solas, se pueden utilizar.<ol>
<li>Crear reacciones en cadena de polimerasa (PCR) para cada muestra por triplicado 50 μl las reacciones en tubos PCR de 0,5 mL estéril o placas de PCR de 96 pocillos como sigue: 5 μl de plantilla extraído ADN (del paso 3), 33,3 μl de agua de grado PCR, 5 μl de buffer de x PCR 10 , 1.5 μl de MgCl2de 50 mM, 1 μl de 10 mM deoxynucleoside de 2'-5'-trifosfatos, 0,5 μl de cebador forward de 20 μm Fun18Sf, 0,5 μl de cebador inverso de 20 μm ITS4R y 0,2 μl de Taq ADN polimerasa.</li>
		<li>Realizar reacciones en un termociclador: desnaturalización a 95 ° C por 3 min; 6 ciclos de desnaturalización (96 ° C, 30 s) recocido (50 ° C, 45 s) y extensión de la cartilla (72 ° C, 3 min); 20 ciclos de desnaturalización (96 ° C, 30 s), recocido (50 ° C, 45 s) y la extensión de la cartilla (72 ° C, 1 min); y extensión de la cartilla a 72 ° C durante 10 minutos la mezcla de reacción a 4 ° C hasta el siguiente paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se combinan que las reacciones de PCR por triplicado purifican mediante un kit de purificación con membranas de sílice. Nota: Este procedimiento permite la eliminación de los componentes de la PCR (cartillas, dNTPs, enzimas, sales, etcetera) y otros contaminantes de las preparaciones de ADN amplificadas.<ol>
<li>Combinan las tres reacciones para cada muestra (total 150 μL) en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril. Añadir el tampón de unión (guanidina-HCl de 5 M, 30% isopropanol) en un volumen de 5 x (750 μL) y mezclar la solución mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces.</li>
		<li>Añadir 450 μl de la mezcla a girar columnas en tubos y centrifugar los tubos a 17.900 x g durante 30 s. descarte los filtrados. Añadir el resto 450 μl a las columnas y centrifugue a 17.900 x g durante 30 s a 22 ° C. Nota: Las columnas spin contienen una membrana de silicona que permite la adsorción del DNA a las columnas.</li>
		<li>Deseche los filtrados y añadir 750 μl de tampón de lavado (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80% de etanol) a las columnas de la vuelta. Centrifugue las columnas a 17.900 x g durante 30 s a 22 ° C. Nota: Este proceso elimina los contaminantes de la reacción de PCR antes mencionados.</li>
		<li>Descarte el filtrado y centrifugar las columnas vacías a 17.900 x g durante 1 min a 22 ° C. Nota: Este paso es eliminar cualquier residuo de lavado tampón que puede interferir con aplicaciones posteriores.</li>
		<li>Transferir las columnas de la vuelta a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril. Añadir 45 μl de tampón de elución (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) e incubar los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos centrífuga las columnas de la vuelta a 17.900 x g durante 1 min a 22 ° C.</li>
		<li>Utilizar el ADN eluído inmediatamente para los pasos 4 y 5 o almacenar a-20 ° C hasta que esté listo para su uso. Nota: Los amplicones pueden conservarse hasta un año a-20 ° C. Se recomienda almacenar ADN a-80 ° C, si se requiere el almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. verificación de hongos ITS la amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa
<ol><li>Molde una agarosa 1% gel con bromuro de etidio 1 μg/mL. Disolver la agarosa en ebullición 1 x de tampón Tris-acetato-EDTA (TAE). Una vez que la solución se ha enfriado a aproximadamente 50 ° C, añadir el bromuro de etidio y vierta en molde de gel.</li>
	<li>Después de que el gel de agarosa ha solidificado, sumergir el gel en 1 x TAE y preparar los amplicones para cargar en el gel. A 8 μl de ADN amplificado, añadir 2 μl de 5 x buffer de carga. Nota: Estos volúmenes se pueden ajustar dependiendo de la concentración del buffer de carga deseada.</li>
	<li>Las muestras, todas de 10 μl, en el gel junto con una escalera de DNA para referencia del tamaño de la carga. Correr el gel a 75 V (6 V/cm) durante aproximadamente 90 minutos y visualizar bandas, vistos normalmente entre 750 y 1.000 pares de bases, utilizando radiación ultravioleta luz (ver figura 5).</li>
</ol>6. secuenciación y análisis de regiones de sus hongos
<ol><li>Secuencia del gDNA extraído o amplificado hongos ITS regiones y analizar secuencias usando métodos actuales y adecuados.</li>
</ol>

<ol><li>Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+and+allergic+health+effects+of+dampness%2C+mold%2C+and+dampness-related+agents%3A+a+review+of+the+epidemiologic+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence.</a> Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).</li>
<li>Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fungal+diversity+in+a+water-damaged+office+building%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Hyg%22%5BJournal%5D)">Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building.</a> J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).</li>
<li>Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fungal+diversity+in+a+water-damaged+office+building%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Hyg%22%5BJournal%5D)">Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building.</a> J Occup Environ Hyg. , (2016).</li>
<li>Pitkaranta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fungal+flora+in+indoor+dust+by+ribosomal+DNA+sequence+analysis%2C+quantitative+PCR%2C+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture.</a> Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).</li>
<li>Rittenour, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+transcribed+spacer+rRNA+gene+sequencing+analysis+of+fungal+diversity+in+Kansas+City+indoor+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Process+Impacts%22%5BJournal%5D)">Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments.</a> Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).</li>
<li>Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal-specific+PCR+primers+developed+for+analysis+of+the+ITS+region+of+environmental+DNA+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts.</a> BMC Microbiol. 5, 28(2005).</li>
<li>Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+ITS1+and+ITS2+to+study+environmental+fungal+diversity+using+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing.</a> FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).</li>
<li>Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+validation+of+some+ITS+primer+pairs+useful+for+fungal+metabarcoding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies.</a> PLoS One. 9 (6), e97629(2014).</li>
<li>Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-coverage+ITS+primers+for+the+DNA-based+identification+of+ascomycetes+and+basidiomycetes+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples.</a> PLoS One. 7 (7), e40863(2012).</li>
<li>Lemons, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+rRNA+sequencing+analysis+of+evaporative+cooler+indoor+environments+located+in+the+Great+Basin+Desert+region+of+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Process+Impacts%22%5BJournal%5D)">Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States.</a> Environ Sci Process Impacts. , (2017).</li>
<li>Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+improved+methodology+to+detect+infectious+airborne+influenza+virus+using+the+NIOSH+bioaerosol+sampler%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Monit%22%5BJournal%5D)">Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler.</a> J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).</li>
<li>Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+in+coal+dust+deposited+on+internal+surface+of+respirable+size+selective+samplers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Hyg%22%5BJournal%5D)">Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers.</a> J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).</li>
<li>Wang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+personal+sampling+methods+for+multiple+bioaerosols%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols.</a> PLoS One. 10 (3), e0120308(2015).</li>
<li>Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-stage+cyclone+using+microcentrifuge+tubes+for+personal+bioaerosol+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Monit%22%5BJournal%5D)">A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling.</a> J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).</li>
<li>Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+extraction+methodologies+used+for+assessing+fungal+diversity+via+ITS+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Monit%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing.</a> J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).</li>
<li>ACGIH. <a target="_blank" href="https://www.acgih.org/forms/store/ProductFormPublic/documentation-of-the-threshold-limit-values-and-biological-exposure-indices-7th-ed">Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter</a>. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).</li>
<li>Rodes, C. E., Thornburg, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodes%2C+CE+%22Aerosols+handbook%3A+measurement%2C+dosimetry%2C+and+health+effects%22">Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects</a>. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).</li>
<li>Broadwater, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+a+persistent+odor+at+an+aircraft+seat+manufacturer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Hyg%22%5BJournal%5D)">Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer.</a> J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).</li>
<li>Couch, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/niosh/nioshtic-2/20049586.html">Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271</a>. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).</li>
<li>Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+bias+associated+with+incomplete+extraction+of+microbial+DNA+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).</li>
<li>Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+interference+to+conventional+and+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+fungi+in+dust%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Monit%22%5BJournal%5D)">Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust.</a> J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).</li>
<li>Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITS+as+an+environmental+DNA+barcode+for+fungi%3A+an+in+silico+approach+reveals+potential+PCR+biases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases.</a> BMC Microbiol. 10, 189(2010).</li>
<li>Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+and+rrn+gene+copy+number+on+PCR+amplification+of+16S+rRNA+genes+from+a+mixture+of+bacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species.</a> Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).</li>
<li>Vesper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Environmental+Relative+Moldiness+index+for+US+homes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Med%22%5BJournal%5D)">Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes.</a> J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).</li>
</ol>

Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no representan necesariamente la posición oficial del Instituto Nacional de salud y seguridad ocupacional, centros de Control y prevención de enfermedades.

Determinar la diversidad fúngica dentro de un entorno de trabajo utilizando enfoques basados en la secuenciación ha mejorado la evaluación de identificación y exposición de peligro de hongos. Con este enfoque ha permitido la detección de muchas otras especies fúngicas que a menudo no se detectan mediante cultivo o métodos de evaluación basados en la microscopía. Aquí se presenta un método para el muestreo de bioaerosoles de ambientes interiores y en el trabajo y la extracción de DNA genómico de muestras de aire para su a...

Exposiciones de hongos en ambientes de interior y trabajo pueden causar morbilidades respiratorias, incluida la sensibilización alérgica y asma1. Identificación de los riesgos de hongos es importante para evaluar el riesgo y prevenir la exposición de los trabajadores. Estos peligros de hongos pueden ser el resultado de contaminación interior, intrusión de aire exterior o perturbaciones ambientales ocurridos en el transporte de materiales fungicidos en áreas donde los trabajadores están presentes2. Métodos para evaluar la exposición de hongos han incluido muestreo de cultura viable así como identificación microscópica de las esporas de hongos. Estos enfoques tienen varias limitaciones y a menudo pasan por alto muchas especies de hongos que podrían contribuir a la carga fúngica total3. Enfoques basados en la cultura sólo pueden distinguir los organismos fúngicos viables que pueden ser cultivados en medios nutritivos. Identificación de esporas de hongos a nivel de especie mediante microscopia puede ser confundido por esporas comparten morfologías similares. Ambos métodos son altamente dependientes de micólogos para analizar e identificar la especie fúngica, con muchos restantes no identificados.
Para mejorar metodologías existentes utilizados en identificación de riesgos laborales y evaluaciones de la exposición, muchos investigadores han recurrido a las tecnologías moleculares. Enfoques basados en la secuencia para evaluar la diversidad microbiana en ambientes de interior y trabajo han revelado un espectro más amplio de especies fúngicas encontradas en comparación con métodos como la microscopía y cultivo viable3,4 ,5. El método presentado aquí describe el muestreo de aire de ambientes laborales y la extracción de ADN genómico para la identificación de riesgos potenciales de hongos. Identificación de riesgos se logra mediante la secuenciación de regiones que son altamente variables entre los hongos y se han utilizado comúnmente para distinguir especies de hongos6,7, el espaciador transcrito interno ribosomal nuclear, o su, 8,9. Muchas especies encuentran en ajustes ocupacionales, tales como algunas especies pertenecientes al phylum Basidiomycota, no son identificables en la cultura viable y son difíciles de diferenciar microscópicamente. Estos hongos se han observado en la alta abundancia relativa dentro de ambientes interiores y ocupacionales determinado por la secuencia hongos ITS regiones3,4,10. SU secuenciación ha proporcionado un mayor conocimiento en la diversidad de hongos encontrados en ambientes de interior y trabajo.
El protocolo descrito aquí detalles de los métodos usados para recolectar, extraer y amplificar regiones de su fungicidas de bioaerosoles para análisis de la secuencia. Este enfoque utiliza el Instituto Nacional de seguridad ocupacional y salud (NIOSH) sampler de aerosol de ciclón de dos etapas recoger las partículas en el aire. Este muestreador se desarrolló para recoger los bioaerosoles y respirable se separa (≤4 μm de diámetro aerodinámico) y no-respirables (> 4 μm de diámetro aerodinámico) las partículas, que permite la identificación de organismos fúngicos dentro de ambientes interiores que son los más probabilidades de ser inhalada por un trabajador11. Otros muestreadores de aire, incluyendo samplers de ciclón, están disponibles en el mercado que tienen la capacidad para recoger las partículas dentro de la gama respirable (< 4 μm) usando filtros de12,13. Por el contrario, el sampler de aerosol del ciclón de dos etapas NIOSH separa especies fúngicas basadas en su diámetro aerodinámico en tubos de polipropileno, desechables que pueden ser procesados inmediatamente para aplicaciones posteriores14.
Los procesos de extracción de DNA genómico y amplificación de las regiones de su fungicidas se detallan en el presente Protocolo. Las metodologías de extracción presentadas han sido desarrolladas específicamente para la extracción de ADN genómico de hongos y bacterias, como muchos kits comerciales dirigidos a células de mamíferos, bacterias o específicamente de levaduras15. Los cebadores utilizados en este estudio se seleccionan según su cobertura global de los hongos ITS 1 y 2 sus regiones4,5. La secuencia de estas regiones permite la comparación de muchas secuencias de sus bancos, los incluidos esa secuencia la región su 1, 2 de su región o regiones el su 1 y 2 su. La diversidad fúngica de muestras de aire recogidas en un ajuste interior utilizando que estos métodos se muestran, revelando un número importante de secuencias a lo phyla Ascomycota y Basidiomycota, así como otras secuencias pertenecientes a los phyla fungicida menos dominante, tales como Zygomycota. La amplia diversidad de hongos secuencias identificados con este enfoque no sería capturar utilizando metodologías de identificación de riesgo tradicionales como cultivo o microscopia. Secuenciación de regiones ITS hongos proporciona un método mejorado para identificar riesgos de hongos y permitir una mejor comprensión de las exposiciones de hongos interiores y trabajo.

<table><tbody><tr><td>Muestreador ciclónico de bioaerosoles NIOSH BC251</td><td>NIOSH</td><td>BC251</td><td>El muestreador de NIOSH aún no está disponible comercialmente. Póngase en contacto con William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) para obtener información sobre cómo obtener el muestreador de NIOSH</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga estériles de Fisherbrand con tapones de rosca</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-373 Tubos de</td><td>microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mL para muestreo de aire; la rosca superior debe coincidir con la rosca del muestreador de NIOSH</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos Falcon de 15 mL</td> Tubos de polipropileno <td>Corning</td><td>352096</td><td>15 mL para muestreo de aire</td></tr><tr><td>Cinta de vinilo para sala limpia, fácil de quitar, 1/4" de ancho</td><td>Cinta de sellado</td><td>McMaster-Carr</td><td>76505A1</td></tr><tr><td>Casete de filtro, estireno transparente, 37 mm</td><td>SKC Inc.</td><td>225-3LF</td><td>Casete de muestreo de 3 piezas (sin filtro). Contiene: base de cassette, cubierta de extensión, tapa de cassette y tapones de entrada/salida filtros de</td></tr><tr><td>membrana de fluoroporo hidrófobo de PTFE, 3.0 y micro; m, 37 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>FSLW03700</td><td>Contiene: 37 mm, 3.0 y micro; m Filtros de PTFE y almohadillas de soporte Pinzas de</td></tr><tr><td>filtro Fisherbrand</td><td>Pinza de filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-50</td></tr><tr><td>Modelo 502 Precision PanaPress</td> La prensa neumática de cassette <td>PanaVise</td><td>502</td><td>está construida a partir de esta prensa de eje de precisión</td></tr><tr><td>Cinta aislante de vinilo Scotch Super 33+ Cinta de 19</td><td></td><td>mm Cinta</td><td></td></tr> de <tr><td>calibración multiusos</td><td> Inc.</td><td>225-112</td><td>tarro de calibración</td></tr><tr><td>Universal PCXR4 Bomba de muestras SKC</td><td>Inc.</td><td>Bomba de muestreo</td> <td>224-PCXR4</td></tr><tr><td>Caudalímetro másico 4140</td><td>TSI Inc.</td><td>Caudalímetro 4140</td><td></td></tr><tr><td>Roche High Pure PCR Template Kit Roche</td><td>Diagnostics</td><td>11796828001</td><td>Kit utilizado para la extracción de ADN genómico. Contiene: Tampón de lisis, tampón de unión, proteinasa K, tampón de eliminación de inhibidores, tampón de lavado, tampón de elución, tubos de filtro de fibra de vidrio y tubos de recolección de 2 ml</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubos de tapón de rosca de polipropileno reforzado de 2 mL con tapas</td><td>Fisher Scientific</td><td>15340162</td><td>Tubos reforzados de 2 mL para la homogeneización de perlas</td></tr><tr><td>de vidrio, lavadas con ácido, 212-300 y micro; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td>perlas de vidrio</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Molino de perlas 24 Homogeneizador</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td>homogeneizador de perlas</td></tr><tr><td>CelLytic Reactivo de lisis de células B, 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8740</td><td>reactivo de lisis</td></tr><tr><td>Platinum Taq polimerasa</td><td>Invitrogen</td><td>10966-018</td><td>Contiene: Platino Taq polimerasa, 10X tampón PCR (sin MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Diluyente</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427-088</td><td>10 mM dNTP mix</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Kit utilizado para purificar amplicones fúngicos. Contiene: Tampón PB (tampón de unión), Tampón PE (tampón de lavado), Tampón EB (tampón de elución), colorante indicador de pH (opcional) y colorante de carga GelPilot</td></tr><tr><td>Owl EasyCast Mini Gel Sistema de electroforesis</td><td>Thermo Fisher</td><td>B1 o B2</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 KB Plus Escalera</td> de <td>ADN</td> <td>Thermo Fisher</td><td>10488-085</td></tr></tbody></table>

colección y extracción de muestras de aire profesional para análisis de adn fúngico

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Los métodos tradicionales de identificación de hongos exposición en ambientes laborales, como cultura y enfoques basados en la microscopía, tienen varias limitaciones que han dado lugar a la exclusión de muchas especies. Avances en el campo durante las últimas dos décadas han llevado a los investigadores de salud recurrir a enfoques moleculares para la identificación de riesgos de hongos. Estos métodos han resultado en la detección de muchas especies dentro de ambientes de interiores y profesionales que no han sido detectados usando métodos tradicionales. Los datos de este protocolo muestras un enfoque para determinar la diversidad fúngica en aire a través de la extracción de ADN genómica, amplificación, secuenciación identificación taxonómica de hongos interno transcribieron regiones del espaciador (ITS). LOS resultados de la secuenciación en la detección de muchas especies de hongos que son no detectado o difíciles de identificar a nivel de especie mediante cultivo o microscopia. Mientras que estos métodos no proporcionan medidas cuantitativas de la carga fúngica, ofrecen un nuevo enfoque para la identificación de los peligros y puede utilizarse para determinar la riqueza total de especies y la diversidad dentro de un entorno laboral.

Puede evaluarse la distribución de las especies dentro de un entorno con abundancia relativa en la determinación de la cantidad de clones de cada OTU identificados en las muestras de aire. Figura 6 es un gráfico de la corona que representan las especies taxonómicamente colocadas dentro de un ambiente interior después de 60 min de muestreo de aire. Se puede observar que el entorno contiene una variedad de especies dentro de dos grande phyla fungicida, Ascomyco...

Determinación de la diversidad fúngica dentro de un entorno es un método utilizado en los estudios de salud ocupacional para identificar riesgos para la salud. Este protocolo describe la extracción de ADN de muestras de aire ocupacional para la amplificación y secuenciación de regiones ITS hongos. Este método detecta muchas especies de hongos que pueden ser pasada por alto por los métodos de evaluación tradicionales.

Colección y extracción de muestras de aire profesional para análisis de ADN fúngico

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

El objetivo general de esta metodología de muestreo de aire y extracción de ADN es obtener ADN genómico fúngico que pueda amplificarse, secuenciarse y colocarse taxonómicamente para identificar posibles peligros fúngicos dentro de los entornos ocupacionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la evaluación de la exposición ocupacional, como a qué peligros fúngicos están expuestos los trabajadores que pueden tener efectos negativos para la salud. La principal ventaja de esta técnica es que las especies fúngicas que permanecen sin ser detectadas mediante métodos basados en cultivo o microscopía pueden dilucidarse utilizando enfoques basados en la secuenciación.Para ensamblar el casete del filtro de muestreo de aire, coloque una almohadilla de soporte del filtro de celulosa en la superficie cuadriculada de la pieza base, luego, con la ayuda de pinzas de filtro, coloque un filtro encima de la almohadilla de soporte del filtro con el lado de recolección hacia arriba. Después del montaje, selle el casete del filtro insertando la cubierta de extensión y presionándola firme y uniformemente con una prensa manual o neumática. Luego, coloque el casete ensamblado en la parte superior del muestreador de aerosoles de NIOSH y empuje hacia abajo tanto como sea posible.Use un trozo de cinta adhesiva de 19 milímetros para envolver el exterior del casete del filtro y el muestreador, sosteniendo el casete del filtro en su lugar y actuando como un sello de respaldo para evitar fugas. Atornille los tubos de recolección firmemente y completamente en el muestreador hasta que toquen fondo y envuelva la cinta de sellado alrededor de los tubos, actuando como sello secundario contra fugas. Para realizar un muestreo personal de aerosoles, coloque el muestreador dentro de la zona de respiración de la persona.Conecte el muestreador a la solapa, el hombro o el pecho y luego mantenga la bomba de muestreo a la altura de la cintura o en una mochila. Encienda las bombas y verifique después de un minuto si la bomba está funcionando. Al completar el muestreo de aire, recoja el muestreador de aire del sujeto.Retire la cinta de sellado, desenrosque los tubos y luego colóqueles una tapa. Coloque la tercera pieza del casete del filtro sobre el filtro. Primero, limpie el casete de muestreo con etanol al 70%, luego use una herramienta de apertura de casete para abrir el casete de muestreo mientras trabaja en un gabinete de seguridad biológica de Clase II.A continuación, use un elevador de filtro para levantar la almohadilla de soporte y filtrar hacia arriba. Luego, use pinzas de filtro para quitar el filtro y colóquelo en una placa de Petri estéril. Corta el filtro en seis pedazos iguales con un bisturí estéril y luego colócalos en un tubo reforzado de dos mililitros que contenga 300 miligramos de perlas de vidrio de 200 a 500 micrómetros.Sumerja el tubo que contiene el filtro en nitrógeno líquido durante 30 segundos y luego colóquelo rápidamente en un homogeneizador de molino de bolas a una velocidad de 4,5 metros por segundo durante 30 segundos. Agregue 0,5 mililitros de tampón de lisis a los tubos que contienen las piezas pequeñas restantes de filtro intacto, luego agregue 0,3 mililitros de tampón de lisis a los tubos de recolección del muestreador de aire de 15 y 1,5 mililitros y vórtice los tubos en posición vertical e invertida durante 10 a 15 segundos respectivamente. Transfiera el tampón de lisis de cada tubo de recolección a tubos reforzados de dos mililitros que contengan 300 miligramos de perlas de vidrio.Procese los tubos en el homogeneizador del molino de bolas durante 30 segundos, luego centrifugue las muestras a 20.000 veces la gravedad durante un minuto a 22 grados Celsius. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y vuelva a centrifugar el sobrenadante a 20.000 veces la gravedad durante un minuto a 22 grados centígrados. Después de agregar 30 microlitros de reactivo de lisis, incubar los tubos a 37 grados centígrados durante 15 minutos.A continuación, añada 0,2 mililitros de tampón aglutinante y 100 microgramos por mililitro de proteinasa K al tubo, y luego deje los tubos para su incubación en un calentador de bloque a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Por último, añade 100 microlitros de isopropanol a cada tubo. Luego, coloque tubos de filtro de fibra de vidrio con una capacidad de 700 microlitros en tubos de recolección de dos mililitros y transfiera las soluciones de extracto a ellos.Después de la transferencia, centrifugar los tubos de recolección a 20.000 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados centígrados. Después de la centrifugación, inserte la fibra del filtro de vidrio en tubos de recolección nuevos y deseche el tubo de recolección. A cada tubo agregue 0,5 mililitros de tampón de eliminación de inhibidores y realice la centrifugación a 20.000 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados Celsius.Deseche el tubo de recolección después de la centrifugación y coloque los tubos de filtro en nuevos tubos de recolección. A continuación, añada 0,5 mililitros de tampón de lavado a cada tubo y vuelva a someter a centrifugación a 20.000 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados centígrados. Deseche el tubo de recolección y reemplácelo por uno nuevo después de la centrifugación.De nuevo, añade 0,5 mililitros de tampón de lavado a cada tubo y centrifuga a 20.000 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados centígrados. Para eliminar cualquier tampón de lavado residual, finalmente centrifugue los tubos de recolección a 20, 000 veces la gravedad durante un minuto a 22 grados Celsius y deseche los tubos de recolección y reemplácelos por otros nuevos. Después de agregar 100 microlitros de tampón de elución caliente, incube los tubos en la mesa de laboratorio a temperatura ambiente durante uno o dos minutos y centrifugue los tubos de recolección a 20.000 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados Celsius.Coloque los tubos de filtro en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y vuelva a aplicar los eluidos para otra centrifugación redonda. Utilice tubos de PCR de 0,5 mililitros para configurar reacciones de 50 microlitros por triplicado con cinco microlitros de ADN ya extraído para cada reacción, luego programe el termociclador e inicie el ciclo. Mezcle las tres reacciones de PCR en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros.Agregue 750 microlitros de tampón aglutinante y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Agregue 450 microlitros de la mezcla total a las columnas de centrifugación insertadas en los tubos de recolección y comience a centrifugar a 17, 900 veces la gravedad durante 30 segundos, luego deseche el filtrado y agregue los 450 microlitros restantes de la mezcla para una segunda ronda de centrifugación. Nuevamente, deseche el filtrado y agregue 750 microlitros de tampón de lavado a las columnas de centrifugado y centrifugue a 17, 900 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados Celsius.Finalmente, deseche el filtrado y vuelva a girar las columnas vacías a 17.900 veces la gravedad durante un minuto a 22 grados Celsius. Después de transferir las columnas de centrifugación a tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros, pipetee 45 microlitros de tampón de elución e incube los tubos en la mesa de laboratorio a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, centrifuga las columnas a 17.900 veces la gravedad durante un minuto a 22 grados centígrados.Sumerja un gel de agarosa al 1% en un tampón TAE de un solo pliegue en una cámara de electroforesis, luego mezcle dos microlitros de tampón de carga quíntuple con ocho microlitros de ADN amplificado. Finalmente, cargue los 10 microlitros completos de la muestra en el gel junto con la escalera de ADN. Haga funcionar el gel a 75 voltios durante aproximadamente 90 minutos.Un gel representativo de agarosa demuestra la amplificación de las regiones espaciadoras internas transcritas del ADN genómico fúngico derivado de muestras de aire ocupacionales. El carril en el extremo izquierdo representa el carril de marcadores de ADN. Las bandas de la derecha representan las regiones espaciadoras internas transcritas amplificadas a partir de diferentes muestras de aire ocupacional con tamaños que oscilan entre 750 y 1.000 pares de bases.Un gráfico representativo de Krona muestra la presencia de diversas especies taxonómicas de hongos en un ambiente interior. El muestreador de ciclones bioaerosoles de NIOSH se utilizó en los hogares para recolectar bioaerosoles durante una hora para determinar las especies fúngicas presentes. Los datos tabulares representan los índices de diversidad y riqueza de especies fúngicas en ambientes interiores.Los datos muestran índices de riqueza de Chao-1, índices de diversidad de Shannon y coeficientes de disimilitud de Bray-Curtis más altos en ambientes con aire acondicionado y enfriadores evaporativos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo recolectar muestras de aire interior y ocupacional y extraer ADN genómico para el análisis de poblaciones microbianas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar los mejores métodos asépticos para evitar la contaminación microbiológica de las muestras.

collection-extraction-occupational-air-samples-for-analysis-fungal

Research

Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

La devastación de los cultivos de cereales de semillas por los hongos que infectan ha llevado a los numerosos esfuerzos de investigación para comprender mejor las interacciones planta-patógeno. Para estudiar las interacciones entre las semillas de hongos en un entorno de laboratorio, hemos desarrollado un método robusto para la cuantificación de reproducción de los hongos, la biomasa y la contaminación por micotoxinas mediante bioensayos del kernel.

La cuantificación de la colonización por hongos, esporogenesis y producción de micotoxinas mediante bioensayos del núcleo

En este trabajo se describen dos análisis complementarios de partículas biológicas atmosféricas a partir de filtros muestreados en aire: la extracción y detección de endotoxinas y de ADN.

Análisis del filtro de aire en la muestra de endotoxinas y contenido de ADN

Consorcios microbianos en las colmenas de la abeja bumble enriquecen y conservan el polen para las larvas de abeja. Utilizando la siguiente secuencia de generación, junto con laboratorio y experimentos en el campo, este manuscrito describe protocolos utilizados para probar la hipótesis de que residuos del fungicida alteran el microbioma del polen y datos demográficos de la Colonia, en última instancia conduce a la Colonia pérdida.

Empírico, metagenómica y técnicas computacionales iluminarán los mecanismos por los cuales fungicidas compromiso Pathología Apícola

Aquí se describe un protocolo para determinar la carga micótica pulmonar en ratones con aspergilosis invasiva por cuantificación de la coloración en cortes histológicos de plata de methanamine modificado de Gomori. Uso de este método dio lugar a resultados comparables con menos animales en comparación con evaluación de la carga de hongos por PCR cuantitativa de ADN fúngico de pulmón.

Cuantificación histológica para determinar la carga micótica pulmonar en aspergilosis Experimental

Entender la composición biológica del material particulado ambiental es importante para el estudio de sus impactos significativos en la salud y la diseminación de la enfermedad. Aquí, utilizamos tres tipos de métodos de muestreo de bioaerosol y un análisis biológico de microbios aéreos para explorar mejor las comunidades microbianas aerotransportadas bajo diferentes condiciones ambientales.

Composición y análisis de la distribución de bioaerosoles bajo diferentes condiciones ambientales

Aquí describimos un protocolo simple para generar perfiles de huellas dactilares de ADN mediante la amplificación del locus VNTR D1S80 de ADN de células epiteliales.

Aplicación de huellas dactilares de ADN utilizando el locus D1S80 en clases de laboratorio

Este protocolo describe la extracción de compuestos orgánicos volátiles de una muestra biológica con el método de extracción de sorbente asistido por vacío, cromatografía de gases junto con espectrometría de masas utilizando el riel de preparación de muestras Entech y análisis de datos. También describe el cultivo de muestras biológicas y el sondeo de isótopos estables.

Captura de compuestos orgánicos volátiles microbianos producidos activamente a partir de muestras asociadas con humanos con extracción de sorbente asistida por vacío

Este protocolo es un método eficaz y rápido de cultivo de levaduras y el moho Aspergillus fumigatus a partir de grandes conjuntos de muestras de suelo en tan solo 7 días. Los métodos se pueden modificar fácilmente para acomodar una variedad de medios de incubación y temperaturas según sea necesario para los experimentos.

Aislamiento de levaduras y mohos cultivables de los suelos para investigar la estructura de la población de hongos

El presente artículo tiene como objetivo proporcionar protocolos detallados y adecuados para el aislamiento de hongos endófitos asociados a plantas, la preservación a largo plazo de aislados, la caracterización morfológica y la extracción de ADN total para su posterior identificación molecular y análisis metagenómicos.

Aislamiento, caracterización y extracción de ADN total para identificar hongos endófitos en plantas micoheterótrofas

Formas fiables y precisas de análisis de ADN desplegable en el campo son cruciales para muchas industrias. Este artículo ofrece dos métodos para el análisis microbiano ambiental en campo: 1) el aislamiento de ADN microbiano de muestras ambientales utilizando un kit de extracción biológica de campo, y 2) el análisis del ADN mediante la unidad qPCR de campo.

Análisis de ADN microbiano en el campo utilizando un kit de extracción biológica de campo y una unidad qPCR de campo

Aprende a extraer ADN de muestras de aire profesional para identificar hongos mediante secuenciación de regiones ITS. Este método mejora la evaluación de riesgos ocupacionales al detectar especies fúngicas no visibles con técnicas tradicionales.

Colección y extracción de muestras de aire profesional para análisis de ADN fúngico

Explorar más videos