Colección y extracción de muestras de aire profesional para análisis de ADN fúngico

El objetivo general de esta metodología de muestreo de aire y extracción de ADN es obtener ADN genómico fúngico que pueda amplificarse, secuenciarse y colocarse taxonómicamente para identificar posibles peligros fúngicos dentro de los entornos ocupacionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la evaluación de la exposición ocupacional, como a qué peligros fúngicos están expuestos los trabajadores que pueden tener efectos negativos para la salud. La principal ventaja de esta técnica es que las especies fúngicas que permanecen sin ser detectadas mediante métodos basados en cultivo o microscopía pueden dilucidarse utilizando enfoques basados en la secuenciación.

Para ensamblar el casete del filtro de muestreo de aire, coloque una almohadilla de soporte del filtro de celulosa en la superficie cuadriculada de la pieza base, luego, con la ayuda de pinzas de filtro, coloque un filtro encima de la almohadilla de soporte del filtro con el lado de recolección hacia arriba. Después del montaje, selle el casete del filtro insertando la cubierta de extensión y presionándola firme y uniformemente con una prensa manual o neumática. Luego, coloque el casete ensamblado en la parte superior del muestreador de aerosoles de NIOSH y empuje hacia abajo tanto como sea posible.

Use un trozo de cinta adhesiva de 19 milímetros para envolver el exterior del casete del filtro y el muestreador, sosteniendo el casete del filtro en su lugar y actuando como un sello de respaldo para evitar fugas. Atornille los tubos de recolección firmemente y completamente en el muestreador hasta que toquen fondo y envuelva la cinta de sellado alrededor de los tubos, actuando como sello secundario contra fugas. Para realizar un muestreo personal de aerosoles, coloque el muestreador dentro de la zona de respiración de la persona.

Conecte el muestreador a la solapa, el hombro o el pecho y luego mantenga la bomba de muestreo a la altura de la cintura o en una mochila. Encienda las bombas y verifique después de un minuto si la bomba está funcionando. Al completar el muestreo de aire, recoja el muestreador de aire del sujeto.

Retire la cinta de sellado, desenrosque los tubos y luego colóqueles una tapa. Coloque la tercera pieza del casete del filtro sobre el filtro. Primero, limpie el casete de muestreo con etanol al 70%, luego use una herramienta de apertura de casete para abrir el casete de muestreo mientras trabaja en un gabinete de seguridad biológica de Clase II.

A continuación, use un elevador de filtro para levantar la almohadilla de soporte y filtrar hacia arriba. Luego, use pinzas de filtro para quitar el filtro y colóquelo en una placa de Petri estéril. Corta el filtro en seis pedazos iguales con un bisturí estéril y luego colócalos en un tubo reforzado de dos mililitros que contenga 300 miligramos de perlas de vidrio de 200 a 500 micrómetros.

Sumerja el tubo que contiene el filtro en nitrógeno líquido durante 30 segundos y luego colóquelo rápidamente en un homogeneizador de molino de bolas a una velocidad de 4,5 metros por segundo durante 30 segundos. Agregue 0,5 mililitros de tampón de lisis a los tubos que contienen las piezas pequeñas restantes de filtro intacto, luego agregue 0,3 mililitros de tampón de lisis a los tubos de recolección del muestreador de aire de 15 y 1,5 mililitros y vórtice los tubos en posición vertical e invertida durante 10 a 15 segundos respectivamente. Transfiera el tampón de lisis de cada tubo de recolección a tubos reforzados de dos mililitros que contengan 300 miligramos de perlas de vidrio.

Procese los tubos en el homogeneizador del molino de bolas durante 30 segundos, luego centrifugue las muestras a 20.000 veces la gravedad durante un minuto a 22 grados Celsius. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y vuelva a centrifugar el sobrenadante a 20.000 veces la gravedad durante un minuto a 22 grados centígrados. Después de agregar 30 microlitros de reactivo de lisis, incubar los tubos a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

A continuación, añada 0,2 mililitros de tampón aglutinante y 100 microgramos por mililitro de proteinasa K al tubo, y luego deje los tubos para su incubación en un calentador de bloque a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Por último, añade 100 microlitros de isopropanol a cada tubo. Luego, coloque tubos de filtro de fibra de vidrio con una capacidad de 700 microlitros en tubos de recolección de dos mililitros y transfiera las soluciones de extracto a ellos.

Después de la transferencia, centrifugar los tubos de recolección a 20.000 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados centígrados. Después de la centrifugación, inserte la fibra del filtro de vidrio en tubos de recolección nuevos y deseche el tubo de recolección. A cada tubo agregue 0,5 mililitros de tampón de eliminación de inhibidores y realice la centrifugación a 20.000 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados Celsius.

Deseche el tubo de recolección después de la centrifugación y coloque los tubos de filtro en nuevos tubos de recolección. A continuación, añada 0,5 mililitros de tampón de lavado a cada tubo y vuelva a someter a centrifugación a 20.000 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados centígrados. Deseche el tubo de recolección y reemplácelo por uno nuevo después de la centrifugación.

De nuevo, añade 0,5 mililitros de tampón de lavado a cada tubo y centrifuga a 20.000 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados centígrados. Para eliminar cualquier tampón de lavado residual, finalmente centrifugue los tubos de recolección a 20, 000 veces la gravedad durante un minuto a 22 grados Celsius y deseche los tubos de recolección y reemplácelos por otros nuevos. Después de agregar 100 microlitros de tampón de elución caliente, incube los tubos en la mesa de laboratorio a temperatura ambiente durante uno o dos minutos y centrifugue los tubos de recolección a 20.000 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados Celsius.

Coloque los tubos de filtro en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y vuelva a aplicar los eluidos para otra centrifugación redonda. Utilice tubos de PCR de 0,5 mililitros para configurar reacciones de 50 microlitros por triplicado con cinco microlitros de ADN ya extraído para cada reacción, luego programe el termociclador e inicie el ciclo. Mezcle las tres reacciones de PCR en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros.

Agregue 750 microlitros de tampón aglutinante y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Agregue 450 microlitros de la mezcla total a las columnas de centrifugación insertadas en los tubos de recolección y comience a centrifugar a 17, 900 veces la gravedad durante 30 segundos, luego deseche el filtrado y agregue los 450 microlitros restantes de la mezcla para una segunda ronda de centrifugación. Nuevamente, deseche el filtrado y agregue 750 microlitros de tampón de lavado a las columnas de centrifugado y centrifugue a 17, 900 veces la gravedad durante 30 segundos a 22 grados Celsius.

Finalmente, deseche el filtrado y vuelva a girar las columnas vacías a 17.900 veces la gravedad durante un minuto a 22 grados Celsius. Después de transferir las columnas de centrifugación a tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros, pipetee 45 microlitros de tampón de elución e incube los tubos en la mesa de laboratorio a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, centrifuga las columnas a 17.900 veces la gravedad durante un minuto a 22 grados centígrados.

Sumerja un gel de agarosa al 1% en un tampón TAE de un solo pliegue en una cámara de electroforesis, luego mezcle dos microlitros de tampón de carga quíntuple con ocho microlitros de ADN amplificado. Finalmente, cargue los 10 microlitros completos de la muestra en el gel junto con la escalera de ADN. Haga funcionar el gel a 75 voltios durante aproximadamente 90 minutos.

Un gel representativo de agarosa demuestra la amplificación de las regiones espaciadoras internas transcritas del ADN genómico fúngico derivado de muestras de aire ocupacionales. El carril en el extremo izquierdo representa el carril de marcadores de ADN. Las bandas de la derecha representan las regiones espaciadoras internas transcritas amplificadas a partir de diferentes muestras de aire ocupacional con tamaños que oscilan entre 750 y 1.000 pares de bases.

Un gráfico representativo de Krona muestra la presencia de diversas especies taxonómicas de hongos en un ambiente interior. El muestreador de ciclones bioaerosoles de NIOSH se utilizó en los hogares para recolectar bioaerosoles durante una hora para determinar las especies fúngicas presentes. Los datos tabulares representan los índices de diversidad y riqueza de especies fúngicas en ambientes interiores.

Los datos muestran índices de riqueza de Chao-1, índices de diversidad de Shannon y coeficientes de disimilitud de Bray-Curtis más altos en ambientes con aire acondicionado y enfriadores evaporativos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo recolectar muestras de aire interior y ocupacional y extraer ADN genómico para el análisis de poblaciones microbianas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar los mejores métodos asépticos para evitar la contaminación microbiológica de las muestras.