Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

El objetivo general de esta preparación para la propagación de la cromatina es visualizar cronológicamente los patrones dinámicos de localización de las proteínas unidas a la cromatina y la morfología cromosómica de los ovocitos a lo largo de la ovogénesis de los mamíferos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología reproductiva femenina, como el emparejamiento de cromosomas homólogos, la sinapsis, la reparación del ADN y la segregación cromosómica meiótica. La principal ventaja de esta técnica es que permite un inmunomarcaje y visualización claros de las proteínas asociadas a los cromosomas y la evaluación de la ploidía de los ovocitos.

La ovogénesis es propensa a errores, y la segregación errónea de los cromosomas a menudo resulta en enfermedades genéticas. Este método se puede utilizar para mejorar nuestra comprensión de las causas maternas de la aneuploidía y la infertilidad. Después de sacrificar a un ratón hembra de 14 a 19 días después del coito, haga una abertura en forma de V en la cavidad abdominopélvica.

A continuación, retire el cuerno uterino materno. A continuación, separe los embriones de la placenta y sacrifique los embriones por decapitación. Luego transfiéralos a una placa de Petri de 35 milímetros que contiene tres mililitros de PBS a 37 grados centígrados.

Luego, mueva un cachorro a un plato separado también cargado con PBS caliente. Después de sacrificar al feto, haga un corte a lo largo de la línea media ventral de la mitad posterior, a lo largo de la mitad anterior debajo de las extremidades anteriores y directamente encima de las extremidades posteriores y la cola. A continuación, abra el abdomen del embrión con unas tijeras de 3,5 pulgadas.

Con pinzas de punta fina, desplace o extirpe el hígado y las asas del intestino, exponiendo las gónadas. Ahora determina si las gónadas son masculinas o femeninas. Los ovarios se encuentran inmediatamente debajo y detrás del riñón, hacia la pared posterior de la cavidad peritoneal.

Extirpe ambos ovarios con un par de pinzas de punta fina y transfiérelos a un recipiente pequeño que contenga PBS que se mantenga a 37 grados centígrados. Proceda rápidamente a recoger los ovarios de todos los fetos. A continuación, en un nuevo recipiente pequeño, sumerja completamente cada conjunto de ovarios por separado en medio mililitro de tampón de hipoextracción recién hecho.

Déjalos incubar a 25 grados centígrados durante al menos 15 minutos, pero no más de 30 minutos. Durante la incubación, use un bolígrafo PAP de barrera hidrofóbica para dibujar dos cuadrados de 22 por 22 milímetros en un portaobjetos de vidrio limpio. Prepare un portaobjetos para cada conjunto de ovarios.

Cuando se complete la incubación, agregue una gota de 50 microlitros de sacarosa de 100 milimolares a un portaobjetos limpio y transfiera un par de ovarios a la gota. Ahora use dos agujas de calibre 27 para cardar los ovarios y liberar las células que contienen. Con unas pinzas, retire y deseche los trozos grandes de ovario.

A continuación, pipetee con cuidado la solución de sacarosa para dispersar las células liberadas. A continuación, cargue cada cuadrado en un portaobjetos con 40 microlitros de 1%PFA con 0.2%Triton X-100. Extienda la solución por el cuadrado con la punta de una pipeta o balanceando el portaobjetos hacia adelante y hacia atrás.

Luego, para cada piscina de solución de sacarosa con celdas, cargue dos charcos fijadores con 20 microlitros de celdas suspendidas de modo que cada portaobjetos tenga celdas de un conjunto de ovarios. En el caso de las colecciones de ovocitos MI o MII, primero se debe preparar y sacrificar al ratón donante. A continuación, haga una gran abertura en forma de V en la cavidad abdominopélvica y utilice fórceps para desplazar los intestinos y localizar cada cuerno uterino.

Encuentra los ovarios proximales a la caja torácica. Sujete el oviducto con pinzas finas y corte la grasa superior al ovario con unas tijeras de disección. Mientras aún sostiene el oviducto, use pinzas finas para liberar el ovario de la bolsa y transfiera los ovarios a un plato de recolección que contenga medio mantenido a 37 grados centígrados.

Para recolectar ovocitos en etapa GV, use una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 27 para liberar los complejos cúmulo-ovocito mediante la punción manual de los folículos antrales grandes. Para recolectar los ovocitos en etapa MII, haga un orificio en la ampolla del oviducto para liberarlos en lugar de simplemente hacer una punción. A continuación, recoja los ovocitos con una pipeta de vidrio o capilar que se accione por la boca, o utilice una jeringa micrmétrica manual.

Algunos ovocitos pueden estar rodeados de células cúmulos, otros no. Para los ovocitos IM, prepare hialuronidasa fresca en MEM-alfa/BSA para desnudar los ovocitos de las células del cúmulo circundante. Para cada colección de ovocitos, trátelos en una incubadora con 2,5 mililitros de hialuronidasa preparada durante tres minutos.

A continuación, transfiera los ovocitos MI a un medio MEM-alfa/BSA tibio recién hecho. Allí, utilice una pipeta de vidrio accionada por la boca para proporcionar la fuerza de cizallamiento necesaria para separar completamente las células del cúmulo. En general, el éxito de este procedimiento requiere el dominio de la recolección y manipulación de ovocitos mediante pipetas de vidrio o capilares accionados por la boca.

Permita que los ovocitos se recuperen en la incubadora. Mientras tanto, en una placa de vidrio calentada de nueve pocillos, cargue 300 microlitros de solución tibia de Tyrode. Cargue dos pocillos con 300 microlitros de MEM-alfa/BSA caliente, y cargue un pocillo con 300 microlitros de medio caliente de Waymouth.

Para extirpar la zona pelúcida, transfiera de cinco a 10 ovocitos en etapa MI o MII al baño de la solución de Tyrode durante solo 30 a 45 segundos mientras los observa bajo un microscopio de disección. Cuando la zona pelúcida esté visiblemente disuelta, transfiera inmediatamente los ovocitos al medio utilizando una pipeta prehumedecida con medio MEM-alpha/BSA. A continuación, transfiera los ovocitos a un segundo baño de medio caliente.

Después del segundo baño, transfiera los ovocitos al medio tibio de Waymouth y déjelos recuperarse en una incubadora durante 30 minutos. Para prepararse para una propagación de cromatina, use un bolígrafo PAP para dibujar un rectángulo de 11 por 44 milímetros en un portaobjetos de vidrio. A continuación, cubra el portaobjetos con una capa fina de 1 % de PFA con 0,2 % de Triton X-100 en agua, y luego balancee el portaobjetos hacia adelante y hacia atrás para esparcir la solución.

A continuación, golpee la corredera para eliminar el exceso. Ahora sifón entre cinco y 10 ovocitos con una cantidad mínima de medio. A continuación, transfiera los ovocitos al portaobjetos preparado arrastrando simultáneamente la punta de una pipeta a través de la solución fijadora y dejando caer los ovocitos sobre el portaobjetos desde aproximadamente un centímetro por encima.

Los ovocitos deben reventar inmediatamente, esparciendo la cromatina en el portaobjetos. Ahora incube los portaobjetos a temperatura ambiente en una cámara humidificada cerrada. Deje que se asienten durante la noche para que la cromatina se adhiera al portaobjetos.

La colección embrionaria de cromatina descrita se utilizó para analizar cuantitativamente la formación de cruzes en ovocitos recolectados de embriones C57 negro/6J. Las preparaciones de cromatina en profase se marcaron inmunológicamente para detectar SYCP3, SYCP1 y MLH1, y se tiñeron con DAPI. Los cromosomas en estadio paquiteno tenían 27 focos MLH1 distribuidos a lo largo de 20 estructuras SC completamente ensambladas.

Cuando la preparación de la dispersión no era óptima y los cromosomas individuales eran indistinguibles, la preparación no se incluyó en la evaluación. En buenas preparaciones, SMC6 se enriqueció en la región de heterocromatina pericentromérica y a lo largo de los brazos cromosómicos, y los focos MLH1 se distribuyeron a lo largo del SC en la etapa de paquiteno. El número de cruzamientos positivos para MLH1 de 15 buenas preparaciones de tipo salvaje fue de aproximadamente 24.

El método de recolección de ovocitos se utilizó para evaluar la morfología de la cromatina en los ovocitos después de la reanudación meiótica. La localización de proteínas, así como la ploidía, se evaluaron fácilmente, exponiendo las posibles causas de los errores de segregación cromosómica. La topoisomerasa II-alfa se pudo observar a lo largo de los brazos cromosómicos y la heterocromatina pericentromérica.

En los ovocitos MII, las cromátidas hermanas pareadas pudieron distinguirse por la morfología cromosómica y del centrómero. Una vez dominadas, estas técnicas sin o después del cultivo se pueden completar en una o dos horas por ratón. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos complementarios, como el inmunomarcaje de ovocitos de células enteras y la obtención de imágenes de células vivas para evaluar los cromosomas homólogos y las cromátidas hermanas dentro del contexto de la célula.

En conjunto, los métodos de propagación de la cromatina descritos aquí se pueden aplicar fácilmente para evaluar la ovogénesis de los mamíferos y las características sexualmente dimórficas de la dinámica de los cromosomas y las proteínas durante la meiosis.