Name: Electroforesis en Gel bidimensional juntada con métodos de espectrometría de masas para el análisis del proteoma de tejido humano Adenoma pituitario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Aprenda electroforesis bidimensional acoplada a espectrometría de masas para analizar el proteoma de adenomas pituitarios humanos. Este método permite identificar proteínas de baja abundancia con alta sensibilidad.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant no. 81572278 y 81272798 a XZ), las subvenciones del proyecto de Plan "863" de China (Grant No. 2014AA020610-1 a XZ), los fondos del Hospital de Xiangya de talento introducción (XZ) y el Hunan Fundación Provincial de Ciencias naturales de China (Grant No. 14JJ7008 a XZ). Los autores también reconocen la contribución científica de Dr. Dominic M. Desiderio en el Health Science Center de la Universidad de Tennessee. X.Z. continuamente desarrollado utiliza métodos 2DE-MS para analizar el proteoma del adenoma pituitario a partir de 2001, concibió el concepto para el presente manuscrito, escribió y revisó el manuscrito, coordinó el trabajo pertinente y fue responsable de la apoyo financiero y trabajo correspondiente. Y.L. participó en la revisión del manuscrito. Y.H participó en la colección de referencias y la revisión del manuscrito. Todos los autores aprobaron el manuscrito final.

<ol><li>Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pituitary+adenoma+proteomics%3A+new+progresses+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives.</a> Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+analysis+of+human+pituitary+adenomas%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives.</a> Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).</li>
<li>Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+profiles+of+a+follicle-stimulating+hormone-positive+human+nonfunctional+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma.</a> Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+microscopic+to+endoscopic+transsphenoidal+surgery+for+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas.</a> World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).</li>
<li>Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproliferative%2C+antiinvasive%2C+and+proapoptotic+activity+of+folate+receptor+%CE%B1-targeted+liposomal+doxorubicin+in+nonfunctional+pituitary+adenoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells.</a> Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenoma+nitroproteomics%3A+current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference+map+of+a+pituitary+adenoma+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A reference map of a pituitary adenoma proteome.</a> Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).</li>
<li>Desiderio, D. M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+human+pituitary+proteome%3A+The+characterization+of+differentially+expressed+proteins+in+an+adenoma+compared+to+a+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control.</a> Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+human+pituitary+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome.</a> Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+tanscriptomics+analyses+of+secretagogin+down-regulation+in+human+non-functional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pituitary%22%5BJournal%5D)">Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas.</a> Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).</li>
<li>Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+molecular+signaling+in+human+clinically+non-functional+pituitary+adenomas+identified+by+gene+expression+profiling+and+proetomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses.</a> Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+proteomes+in+clinically+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas.</a> BMC Med. Genomics. 7, (2014).</li>
<li>Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+growth+hormone+isoforms+in+the+human+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary.</a> Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).</li>
<li>Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+pituitary+growth+hormone+variants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pituitary+nitroproteome%3A+detection+of+nitrotyrosyl-proteins+with+two-dimensional+Western+blotting%2C+and+amino+acid+sequence+determination+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ion-trap+mass+spectrometric+characterization+of+human+pituitary+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins.</a> Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteomic+variations+of+invasive+relative+to+noninvasive+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas.</a> Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+pathway+networks+mined+from+human+pituitary+adenoma+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data.</a> BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).</li>
<li>O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li>
<li>Klose, J., Kobalz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%3A+an+updated+protocol+and+implications+for+a+functional+analysis+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome.</a> Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).</li>
<li>Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+multi-dimensional+liquid+chromatography+as+proteomic+separation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chromatogr.+Sep.+Tech%22%5BJournal%5D)">Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques.</a> Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).</li>
<li>Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+with+gene-product+mapping+of+the+Mollicutes%3A+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.</a> Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+spatial+and+quantitative+reproducibility+between+two+second-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+volume+vs.+amount+of+protein+loaded+onto+a+gel.+A+detailed%2C+statistical+comparison+of+two+gel+electrophoresis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).</li>
<li>Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhan%2C+X+%22Experimental+Protocols+for+Medical+Molecular+Biology+in+Chinese+and+English%22">Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English</a>. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Electrophoresis+in+Practice%3A+A+guide+to+Methods+and+Applications+of+DNA+and+Protein+Separations%22">Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations</a>. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).</li>
<li>Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. , (2018).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses.

2de, juntada con MS métodos incluyendo 2DE MS PMF y 2DE-MS/MS, se ha utilizado con éxito en nuestro programa a largo plazo - el uso de la proteómica al estudio humano NFPA proteómicos variaciones y las variaciones de la red molecular para la elucidación de mecanismos moleculares y descubrimiento de biomarcadores eficaces para NFPAs. Proteómica comparativa basada en 2de con buena reproducibilidad desempeña un papel importante en la identificación de NFPA proteómicos variaciones9,<sup cla...

PA es un tumor común que se produce en la glándula pituitaria humana en los sistemas de eje hipotálamo-pituitaria-dirigido del órgano, que desempeñan un papel importante en el sistema endocrino humano. PA incluye clínicamente funcionales y no funcionales PAs (FPA y NFPA)1,2. NFPA es difícil en terapia y diagnóstico temprano de la etapa debido a niveles de la hormona sólo ligeramente elevada (p. ej., LH y FSH) en sangre en comparación con el FPA, que se ha incrementado significativamente los niveles de hormonas correspondientes en sangre3,4 ,5. La clarificación de los mecanismos moleculares y el descubrimiento de biomarcadores eficaces tienen importante significado clínico en el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la NFPA. Nuestro objetivo a largo plazo es desarrollar y utilizar métodos de proteómica para el estudio de NFPA para el descubrimiento de biomarcadores fiables para aclarar sus mecanismos moleculares y reconocer dianas terapéuticas eficaces así como marcadores diagnósticos y pronósticos. 2-DE junto con métodos de MS se han utilizado en nuestro programa de investigación a largo plazo humano PA proteoma1,2,6,7, incluido el establecimiento de referencia de proteoma los mapas3,8, análisis de proteínas expresadas diferencialmente los perfiles9,10,11,12,13, variantes de hormona14 ,15, modificaciones post-traduccionales como fosforilación14 y tirosina nitración16,17,18, la variación de Proteómica del invasor relativos al no invasiva NFPAs19y la heterogeneidad de Proteómica de NFPA subtipos13, que condujo al descubrimiento de múltiples redes de camino importante (disfunción mitocondrial, disregulación del ciclo celular, estrés oxidativo y señalización MAPK anormalidad del sistema) que se alteran en NFPA13,19,20.
2de separa las proteínas según su punto isoeléctrico (pI) (isoeléctrica, IEF) y peso molecular (a través de sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. se trata de una técnica de separación común y clásica en el campo de la proteómica, desde la introducción de los conceptos del proteoma y proteómica en 199524. MS es la técnica fundamental para la búsqueda de la identidad de proteínas separadas por 2DE, incluyendo estrategias de PMF y MS/MS. El muy rápido desarrollo de los instrumentos MS, especialmente en los aspectos de la sensibilidad de la detección y resolución en combinación con la mejora del sistema de LC, mejora en gran medida la identidad de las proteínas de baja o muy baja abundancia en un proteoma para maximizar la cobertura de un proteoma. También desafía los conceptos tradicionales que sólo uno o dos proteínas están presentes en un punto en el análisis del proteoma de tejido humano complejo de gel 2D y ofrece una oportunidad para identificar múltiples proteínas en un gel 2D en un análisis de tejido humano complejo proteoma y maximizar la cobertura de proteoma NFPA.
Aquí describimos protocolos detallados de 2DE MALDI MS PMF, 2DE MALDI MS/MS y 2DE-LC-MS/MS que se han utilizado con éxito en el análisis del proteoma humano de NFPA. Los protocolos incluyen la preparación de muestras, la primera dimensión (isoeléctrica, IEF), segunda dimensión (SDS-PAGE), visualización de las proteínas (plata y tinción azul de Coomassie), análisis de gel 2D, digestión de la tripsina en gel, de imagen purificación de péptidos trípticos, PMF, MS/MS y abrasador3,8,25,26la base de datos. Por otra parte, este protocolo se traduce fácilmente para el análisis de otros proteomas de tejidos humanos.

<table><tbody><tr><td>Ettan IPGphor 3&nbsp;</td><td>Sistema de enfoque isoeléctrico</td> <td>de GE Healthcare</td><td></td>.</tr><tr><td>Rueda multigel Ettan DALTsix</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Ettan DALT II</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE. UU.</td><td></td><td>El sistema de electroforesis vertical</td></tr><tr><td>Ettan Soporte de tiras IPGphor</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rueda multigel Ettan DALTsix</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE. UU.</td><td></td><td>Rueda multigel</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI-TOF MS&nbsp;</td><td>ABI, Foster City,CA</td><td></td><td>MALDI-MS PMF</td></tr><tr><td>MALDI-TOF-TOF</td><td>Autoflex III, Bruker</td><td></td><td>Espectrómetro de masas MALDI-MS/MS</td></tr><tr><td>LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td><td></td>. <td>Espectrómetro de masas ESI-MS/MS Sistema</td></tr><tr><td>EASY-nano LC&nbsp;</td><td>Proxeon Biosystems, Odense, Dinamarca</td><td></td><td>Sistema de cromatografía líquida de alta resolución</td></tr><tr><td>PepMap C18 columna trampa&nbsp;</td><td>300 &mu; M I.D. y Times; 5 mm de longitud; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18 columna</td><td>75 &mu; m i.d., 15 cm de longitud; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>Kimvipe&nbsp;</td><td></td><td>Toalla de papel insoluble</td></tr><tr><td>Watter</td><td>Made by PURELAB flex instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron Modelo P710/35 homogeneizador</td><td>Brinkmann Instruments, Westbury, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDQuest</td><td>Bio-Rad,&nbsp; Hercules, CA</td><td></td><td>software de análisis de imágenes en gel 2D</td></tr><tr><td>SEQUEST&nbsp;</td><td>Thermo Proteome Discoverer 1.3 (versión n.º 1.3.0.339)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> DataExplore (ver. 4.0.0.0) <td>Software de procesamiento de espectro MS</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> Mascot <td>Software de búsqueda de proteínas basado en PMF&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> de mascotas <td>Software de búsqueda de proteínas basado en MS/MS</td></tr><tr><td>Software Proteome Discoverer v.1.3 beta</td><td>Software Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur v.2.1</td><td></td><td></td><td>Software de gestión de adquisición de datos MS/MS&nbsp;</td></tr><tr><td>Uniprot versión 201410.1_HUMAN.fasta</td><td></td><td></td><td>Base de datos de proteínas humanas</td></tr><tr><td>SEQUEST (versión Nº 1.3.0.339)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Software de búsqueda de proteínas basado en MS/MS I</td></tr><tr><td>MASCOT (versión 2.3.02)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Software de búsqueda de proteínas basado en MS/MS II</td></tr><tr><td>C18 Microcolumna ZipTip</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PeptideMass Kit estándar&nbsp;</td>Kit de ensayo de proteínas BCA Pierce de <td>Perspective Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Termo&nbsp; Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quant Kit</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>BIS-ACRILAMIDA</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>ACRYLAMIDA</td><td>AMRESCO</td><td>0341</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>VETEC</td><td>V900119</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>AMRESCO</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>AMRESCO</td><td>0465</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>M146</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>AMRESCO</td><td>M133</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega, Madison, WI, USA</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tampón IPG pH 3-10, NL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6000-87</td><td></td></tr><tr><td>Tira seca Immobiline pH 3-10NL,18cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1235-01</td><td></td></tr></tbody></table>

electroforesis en gel bidimensional juntada con métodos de espectrometría de masas para el análisis del proteoma de tejido humano adenoma pituitario

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Adenoma pituitario humano (PA) es un tumor común que se produce en la glándula pituitaria humana en los sistemas de eje hipotálamo-pituitaria-dirigido del órgano y puede ser clasificado como PA clínica funcional o no funcional (FPA y NFPA). NFPA es difícil para diagnóstico temprano de la etapa y la terapia debido a la elevación apenas de las hormonas en la sangre en comparación con el FPA. Nuestro objetivo a largo plazo es utilizar métodos de proteómica para descubrir biomarcadores fiables para aclaración de los mecanismos moleculares de la PA y el reconocimiento de marcadores eficaces de diagnóstico, pronósticos y dianas terapéuticas. Electroforesis en gel bidimensional efectiva (2DE) junto con métodos de espectrometría de masas (MS) fueron presentados aquí para analizar proteomas humanos de PA, incluyendo la preparación de muestras, electroforesis 2D, visualización de proteínas, análisis de imagen, en gel digestión de la tripsina, péptido masiva de huellas dactilares (PMF) y tándem masa espectrometría (MS/MS). 2-dimensional gel electroforesis láser asistida por matriz desorción/ionización espectrometría de PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS y MS/MS procedimientos de cromatografía de líquidos de 2DE (LC) se han aplicado con éxito en el análisis del proteoma de la NFPA. Con el uso de un espectrómetro de masas de alta sensibilidad, muchas proteínas se identificaron con el método de 2DE-LC-MS/MS en cada gel 2D en un análisis del complejo tejido de PA para maximizar la cobertura de proteoma humano de PA.

1. 2DE MALDI MS PMF: con el procedimiento experimental descrito anteriormente, se extrajeron un total de 150 μg proteínas de tejidos expresan FSH NFPA (mujer, 50 años de edad, las hormonas ADRENOCORTICOTRÓFICAS (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+) y TSH (-)) y vestida con un 18 cm La tira IPG (pH 3-10 NL) y un gel de SDS-PAGE de gran formato, entonces visualizado con tinción de plata. Se obtuvo un patrón de gel 2DE reproducibles y buena de NFPA tejido pr...

Aquí, presentamos una electroforesis en gel bidimensional (2DE) acoplada con espectrometría de masas (MS) para separar e identificar adenoma pituitario humano tejido proteoma, que presenta un patrón de 2DE buena y reproducible. Muchas proteínas se observan en cada punto de 2DE al analizar el proteoma del complejo del cáncer con el uso de MS de alta sensibilidad.

Electroforesis en Gel bidimensional juntada con métodos de espectrometría de masas para el análisis del proteoma de tejido humano Adenoma pituitario

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

El objetivo general de esta electroforesis en gel bidimensional junto con el procedimiento de espectrometría de masas es separar e identificar el proteoma tisular del adenoma hipofisario humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los proteomas. Tales como el alto de proteoma.Y el descubrimiento de la situación de la proteína, la proteína cuatro y la proteína espaciada. La principal ventaja de esta técnica es que la electroforesis en gel bidimensional se acopla fácilmente con la espectrometría de masas de alta sensibilidad para identificar el proteoma, especialmente las proteínas de baja abundancia. Situación proteica, proteína cuatro y proteína espaciada.Las implementaciones de esta técnica tienden hacia la PQ iteración de la terapia animal. Debido a la proteína clave para el espacio de proteínas o el patrón de proteínas es útil en el diagnóstico de los pacientes. Mostramos que una demostración de este método es fundamental, ya que los pasos de la electroforesis en gel bidimensional son difíciles de aprender porque lleva tiempo, requiere mucho trabajo y hay varios trucos experimentales.Para comenzar este procedimiento, agregue 250 microlitros de una solución de muestra de proteína previamente preparada a cada ranura de un soporte de tiras IPG de 13 centímetros. Coloque una tira de IPG de 18 centímetros, con el gel hacia abajo, sobre cada solución de muestra de proteína, teniendo cuidado de evitar burbujas. Luego agregue de tres a cuatro mililitros de aceite mineral para cubrir cada tira de IPG.A continuación, ensamble cada soporte de tira IPG en un sistema de enfoque isoeléctrico con el extremo puntiagudo en la placa posterior y el extremo cuadrado en la placa frontal. Después de rehidratar las tiras de IPG durante 18 horas a temperatura ambiente, configure los parámetros IEF en el sistema de enfoque isoeléctrico con un tiempo de funcionamiento total de 7,5 horas y 36.875 voltios hora. Después de IEF, saque cada tira de IPG del sistema de enfoque isoeléctrico y elimine el exceso de aceite mineral con una toalla de papel insoluble.Luego, envuelva cada tira en una hoja de envoltura de plástico y guárdela a menos 80 grados centígrados. Para lanzar un gel PAGE al 12%, agregue agua destilada doble, tampón trisclorhídrico molar 1,5 molar, acrilamida al 40%, solución madre de bis-acrilamida, persulfato de immodium al 10% y temporizado con un vaso de precipitados. Mezcle la solución de gel suavemente, teniendo cuidado de evitar burbujas.Vierta suavemente la solución de gel en una cámara de fundición múltiple hasta la altura esperada del gel de 19 centímetros. Agregue inmediatamente unos tres mililitros de agua destilada doble a la cámara de fundición múltiple para cubrir cada gel de resolución y permitir que cada gel se polimerice durante aproximadamente una hora. Este paso es muy importante para preparar un gel SDS-PAGE de alta calidad y el agua debe agregarse inmediatamente en la parte superior de cada gel.Prepare dos litros de tampón de electroforesis, luego agregue el tampón a un tanque de tampón de la unidad de separación de electroforesis. Después de sacar las tiras de IPG enfocadas del congelador, colóquelas en un recipiente de plástico que contenga un mililitro de tampón de equilibrio reductor y un rastro de azul de bromofenol y equilibre durante 10 minutos con un balanceo suave. Después de retirar el tampón de equilibrio reductor, añada cuatro mililitros de tampón de equilibrio de excalación y un rastro de azul de bromofenol a las tiras de IPG y equilibre durante 10 minutos con un suave balanceo.Durante el equilibrio del gel, desmonte la cámara de fundición múltiple y retire el casete de gel resolutivo preparado. Enjuague el casete de gel tres veces con agua destilada doble, luego retire el agua de acceso del casete de gel con una toalla de papel insoluble y colóquelo en un soporte de gel. A continuación, enjuague las tiras de IPG equilibradas con un tampón de electroforesis y elimine el exceso de líquido en la superficie de cada tira de IPG con una toalla de papel insoluble.Coloque una tira de IPG sobre el gel SDS-PAGE que se resuelve, permitiendo que el lado de plástico de la tira de IPG entre en contacto con la placa de vidrio más larga con el extremo puntiagudo hacia la izquierda. Ahora agregue rápidamente de tres a cuatro mililitros de agarosa caliente al 1% y tampón de electroforesis SDS para sellar la tira de IPG en la parte superior de cada gel SDS-PAGE y coloque la parte superior de la tira de IPG en la parte superior de la placa de vidrio más corta, teniendo cuidado de evitar burbujas. Estos pasos son muy importantes para sellar la tira de IPG al gel SDS-PAGE.Las soluciones de agarosa caliente deben agregarse inmediatamente y la tira de IPG debe colocarse inmediatamente en la parte superior del gel SDS. Después de la polimerización, inserte el casete de gel ensamblado verticalmente entre las juntas de plástico en un sistema de electroforesis vertical. Coloque la parte superior del gel con la tira de IPG junto al cátodo.A continuación, ajuste el nivel de tampón de electroforesis para sumergir el casete de gel añadiendo el volumen adecuado de tampón al sistema de electroforesis. Conecte y configure la fuente de alimentación en modo de voltaje constante y funcione a 200 voltios durante unos 370 minutos mientras monitorea el tinte. Una vez finalizada la ejecución, saque el casete de gel del sistema de electroforesis y retire suavemente el gel del casete de gel, teniendo cuidado de evitar rasgar el gel.Transfiera con cuidado el gel a una bandeja que contenga 250 mililitros de solución de fijación y agite suavemente el gel durante 20 minutos. Después de esto, deseche la solución y agregue 250 mililitros de metanol al 50% a la bandeja. A continuación, agite suavemente el gel durante 10 minutos.Después de agitar el gel en agua bidestilada, añadir 250 mililitros de tampón de sensibilización que contenga un 0,02% de sulfato de sodio. Agite suavemente el gel durante un minuto. Después de agitar el gel dos veces en agua bidestilada, agregue 250 mililitros de solución de reacción de plata y agite suavemente el gel durante 20 minutos.Después de agitar el gel en agua destilada doble, agregue 250 mililitros de solución de desarrollo y agite suavemente hasta obtener la tinción deseada, que generalmente es de uno a tres minutos. Ahora agregue 250 mililitros de ácido al 5% para terminar con las manchas y agite suavemente el gel durante 10 minutos. Después de agitar el gel en agua bidestilada, agregue 250 mililitros de glicerol al 8,8% y almacene el gel a cuatro grados centígrados hasta el análisis.A partir de la electroforesis en gel, se obtuvo un patrón de gel bidimensional reproducible y bueno del proteoma tisular de NFPA con aproximadamente 1.200 puntos de proteína detectados en el mapa de gel bidimensional que se distribuyeron principalmente dentro del área de pH de cuatro a ocho y masa de 15 a 150 kilodaltons. Se identificaron un total de 192 proteínas redundantes de 141 puntos de gel de los 337 puntos de gel analizados en el análisis MALDI-MS PMF y no se identificó ninguna proteína en los 196 puntos restantes. La tinción con azul de commassie produjo un patrón de gel bidimensional reproducible y de alta calidad del proteoma tisular invasivo de NFPA y aproximadamente 1.100 puntos de proteína detectados en un mapa de gel bidimensional que se distribuyeron principalmente dentro del rango de pH de cuatro a ocho y masa de 15 a 150 kilodaltons.Se identificó un promedio de una proteína por mancha con el análisis MALDI tof MS MS. Donde se identificaron tantas proteínas en cada punto correspondiente con el análisis LC-ESI-MS/MS. Estos datos demuestran claramente que cada mancha de gel bidimensional contiene muchas proteínas en el complejo proteoma del tejido canceroso humano.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 32 horas para una electroforesis en gel bidimensional si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir los pasos, especialmente de acuerdo con el protocolo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el marcaje estable, para responder a preguntas adicionales como la codificación de proteínas en el proteoma.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la mezcla de proteínas exploraran modificaciones postraduccionales de proteínas de baja abundancia a mayor escala, especialización de proteínas, proteínas espaciadas y proteínas cuatro en condiciones modelo, pacientes y sistemas de órganos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la electroforesis de gel bidimensional junto con la espectrometría de masas, lograr un patrón de electroforesis de gel bidimensional bueno y reproducible e identificar muchas proteínas en cada punto. No olvide que trabajar con SDS achreomy y TEMED puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes de plástico, mientras se realiza este procedimiento.

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Investigación

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Investigación del cáncer

En este video, demostramos un método de electroforesis en gel bidimensional que separa proteínas individuales de una mezcla compleja de proteínas obtenidas de tejidos tumorales de adenoma hipofisario humano no funcional (NFPA). Las proteínas se separan en función de su carga eléctrica en la primera dimensión y se separan aún más en función de los pesos moleculares en la segunda dimensión.

Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida: una técnica de separación para el análisis de proteínas en mezclas complejas de proteínas basada en la carga y el peso molecular

Fuente: Wulf, M., et.al. Protocolo basado en microdisección láser para el análisis LC-MS/MS del perfil proteómico de gránulos de neuromelanina. J. Vis. Exp. (2021).Este video muestra el análisis de muestras de péptidos de gránulos de neuromelanina (NMG) aislados de tejido cerebral postmortem humano. Los péptidos se separan primero mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y luego se analizan mediante espectrometría de masas para determinar sus relaciones masa-carga (m/z). Los...

Análisis LC-MS/MS del perfil proteómico de gránulos de neuromelanina aislados de tejido cerebral humano

Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.

La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

Aquí se describe un protocolo que las parejas de dos técnicas de proteómica, es decir, de 2 dimensiones electroforesis (2DE) y espectrometría de masas (MS), para identificar expresados ​​diferencialmente / proteínas modificadas después de la traducción entre dos o más grupos de muestras primarias. Este enfoque, junto con los experimentos funcionales, permite la identificación y caracterización de los marcadores de pronóstico / dianas terapéuticas.

Desde un 2DE-Gel Spot para Función de Proteínas: Lección aprendida de HS1 en la leucemia linfocítica crónica

Los análisis en profundidad de los proteomas de las células cancerosas facilitan la identificación de nuevas dianas farmacológicas y biomarcadores de diagnóstico. Describimos un flujo de trabajo experimental para el análisis cuantitativo de (fosfo-)proteomas en subpoblaciones de células cancerosas derivadas de tumores líquidos y sólidos. Esto se logra combinando estrategias de enriquecimiento celular con espectrometría de masas cuantitativa basada en Super-SILAC.

Misa cuantitativa espectrometría de perfiles de los proteomas de células del cáncer derivados de líquidos y tumores sólidos

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

El protocolo tiene como objetivo introducir el uso de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo para el monitoreo de reacción múltiple (MRM) de proteínas de muestras clínicas. Hemos proporcionado un flujo de trabajo sistemático desde la preparación de muestras hasta el análisis de datos para muestras clínicas con todas las precauciones necesarias a tomar.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano

Este método describe una estrategia simple y rápida para la caracterización e investigación de proteoformes de histonas.

Presentación de Proteoformas de Histonas mediante electroforesis en gel 2D-TAU

Aquí, establecemos un método proteómico basado en espectrometría de masas utilizando regiones aisladas de interés en secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina. Este protocolo se utiliza para analizar el proteoma de áreas específicas de tejido en secciones de tejido archivadas fijadas en formol e incluidas en parafina.

Un enfoque simplificado para la proteómica basada en espectrometría de masas utilizando regiones de tejido seleccionadas

Este protocolo preparó con éxito suficiente tejido neovascular de alta calidad a partir de muestras de glioma utilizando microdissección por captura láser para el análisis proteómico cuantitativo de la angiogénesis tumoral, superando las limitaciones de estudios que tradicionalmente se centran principalmente en factores angiogénicos y proporcionando un perfil proteómico a gran escala de la angiogénesis del glioma.

Preparación de tejidos neovasculares de tejidos de glioma humanos para el análisis proteómico cuantitativo de la angiogénesis tumoral

Aprenda electroforesis bidimensional acoplada a espectrometría de masas para analizar el proteoma de adenomas pituitarios humanos. Este método permite identificar proteínas de baja abundancia con alta sensibilidad.

Electroforesis en Gel bidimensional juntada con métodos de espectrometría de masas para el análisis del proteoma de tejido humano Adenoma pituitario (Video) | JoVE Journal

Electroforesis en Gel bidimensional juntada con métodos de espectrometría de masas para el análisis del proteoma de tejido humano Adenoma pituitario

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