Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

El objetivo general de este método es lograr la integración estable de un gen de interés en el genoma humano de células primarias mediante el sistema de la Bella Durmiente regulado transcripcionalmente empaquetado en vectores lentivirales defectuosos de integración. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia génica, como la integración del gen de interés en las células primarias mediante el sistema de la Bella Durmiente. Las principales ventajas de esta técnica es que el sistema hiperactivo inducible de la Bella Durmiente está entregando de manera eficiente células primarias resistentes a varios métodos de transfección.

La comprobante del procedimiento estará a cargo de Daniela Benati, posdoctorada en mi laboratorio. Antes del día de la transducción, los queratinocitos primarios humanos se cultivan como se describe en el protocolo de texto. Para separar los queratinocitos subconfluentes en cultivo, retire el medio, lave las células con PBS 1X y agregue una solución de trabajo de tripsina precalentada en un mililitro a cada pocillo.

Incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos en la incubadora de cultivos celulares. Vuelva a suspender las células de un pocillo a fondo y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga que contenga dos mililitros de medio que contenga suero. Enjuague el pocillo una vez con tres mililitros de 1X PBS y agregue la solución enjuagada al tubo de centrífuga con la suspensión de celdas.

Centrifugar a 580 veces g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Lave las células con cinco mililitros de PBS 1X, centrifugue a 580 veces g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. En un tubo de polipropileno de 15 mililitros, diluir 1,6 veces 10 hasta el quinto queratinocitos en un mililitro de medio CFAD.

Prepare una dilución para cada afección. Los tres vectores lentivirales defectuosos de integración o IDLV se prepararon anteriormente como se describe en el protocolo de texto. IDLVTKSB lleva las transposiciones hiperactivas SB100X reguladas por TET.

IDLVrtTA codifica para el modulador e IDLVT2 lleva el gen de interés. GFP en este ejemplo flanqueado por repeticiones invertidas de transposón. Diluir los vectores lentivirales en un mililitro de medio CFAD en presencia de 20 microlitros de policereno como se indica en esta tabla.

Uno, dos y tres son controles negativos sin vectores. Cuatro y cinco contienen IDLVTKSB e IDLVrtTA. Seis, siete, ocho y nueve contienen los tres vectores lentivirales.

Transducir células en suspensión añadiendo cada dilución de vector lentiviral a la suspensión de queratinocitos correspondiente. Extraer el medio de las células alimentadoras 3T3-J2 irradiadas letalmente que se retiraron hace un día y colocar los queratinocitos transducidos en ellas. Después de transducir un pozo, proceda con el siguiente.

Incubar a 25 grados durante 30 minutos. Luego transfiera las celdas a 37 grados durante seis horas. Después de seis horas, agregue un mililitro de medio CFAD a cada pocillo.

Agregue un micromolar de doxiciclina a los pocillos cinco, ocho y nueve. Regrese las celdas a 37 grados centígrados. Posteriormente, procese las celdas de cada pocillo como se describe en el protocolo de texto.

Para el análisis citofluorimétrico, los queratinocitos primarios transducidos desprendidos en el día tres y el día seis deben distinguirse de la capa alimentadora 3T3-J2 mediante el marcaje de las células con anticuerpo antialimentador conjugado APC monoclonal de ratón. Prepare cuatro mililitros de tampón de tinción para cada muestra combinando 5 % de FBS, 500 milimolares de EDTA y 1 vez más PBS. Lave las células desprendidas con un mililitro de tampón de tinción.

Centrifugar a 580 veces g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. En un tubo para la adquisición de citometría de flujo, resuspender cinco veces 10 hasta la cuarta célula en 100 microlitros de tampón de tinción. Agregue dos microlitros de anticuerpo antialimentador en una dilución de uno a 50 y mezcle bien.

Incubar en hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Después de 30 minutos, lavar con dos mililitros de tampón tintante. Centrifugar a 580 veces g durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender en 200 microlitros de tampón de tinción. Utilice un citómetro de flujo configurado con un láser azul, un láser rojo y filtros para la detección de fluorescencia GFP y APC para adquirir señales APC y GFP. La fracción celular GFP positiva de la población de células APC negativas indica queratinocitos transducidos.

Para realizar PCR en tiempo real, configure las reacciones por triplicado en una placa de 96 pocillos en un volumen de reacción final de 25 microlitros. Cada reacción contiene un microlitro de ADNc, 12,5 microlitros de mezcla maestra 2X, 1,25 microlitros de cebadores en mezcla de sonda 20X y 10,25 microlitros de agua estéril. Ejecute PCR en tiempo real de acuerdo con este programa de PCR, un ciclo a 95 grados Celsius durante 10 minutos, luego 40 ciclos de 95 grados Celsius durante 15 segundos y 60 grados Celsius durante un minuto y manténgalo a cuatro grados Celsius.

Por último, analice los datos de PCR en tiempo real como se describe en el protocolo de texto. El análisis de la expresión de las células HeLa transducidas con dosis crecientes de transposiciones en vectores moduladores más o menos doxiciclina mostró que se requerían altas dosis de ambos IDLV para inducir fuertemente la expresión de SB100X. El análisis cuantitativo de la expresión de SB100X en células HeLa transducidas con vector transpuesto en presencia o ausencia del vector modulador reveló una activación de ocho veces en el fondo en presencia de doxiciclina.

El sistema de la Bella Durmiente regulado transcripcionalmente también se puede utilizar en células primarias. La expresión de SB100X en queratinocitos transducidos con transposiciones y vectores moduladores mostró una activación de 15 veces en el estado apagado. El experimento de transposición realizado en queratinocitos transducidos con los tres vectores IDLV más o menos doxiciclina indicó que el 12% de las células tratadas con doxiciclina integraron de manera estable al menos una copia de GFP en su genoma.

Una vez dominado, la transducción vital en las células primarias se puede realizar en ocho horas, el análisis citofluorimétrico en dos horas y el análisis de expresión en tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar la combinación de dosis de vectores utilizada para transducir las células primarias y lograr el nivel de expresión más alto de las transposiciones inducibles de la Bella Durmiente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la PCR cuantitativa y la PCR mediada por enlazadores, para responder a preguntas adicionales, como el número de copias de transposones por célula y la integración para el archivo del genoma.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que el investigador en el campo de la terapia génica explorara la aplicación del sistema de la Bella Durmiente en la ingeniería de células clínicamente relevantes. Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo transducir primero los queratinocitos primarios con los vectores IDLV. En segundo lugar, medir la expresión de transposiciones hiperactivas sobre la condición de doxiciclina y, finalmente, seguir la transposición por citometría de flujo.

No olvide que trabajar con vectores virales puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre se deben llevar consigo precauciones como el BCL para contener el nivel y el suministro desechable mientras se realizan estos procedimientos.