Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

El objetivo general de este experimento es visualizar la formación compleja de proteínas SNARE en células vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del tráfico de membranas, como la identificación de los conjuntos de proteínas SNARE que catalizan los pasos específicos del tráfico de organelo. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización directa de las ubicaciones celulares donde los SNAREs participan en la formación compleja.

En este experimento, se utilizan 900.000 células HeLa divididas en tres tubos Eppendorf para la transfección. Transfecte las celdas como se describe en el protocolo de texto con las siguientes construcciones. La muestra número uno con la construcción de sitaxina-4 mCitrine, la muestra número dos con la sintradina-4 mCitrine y VAMP3-mCherry, y la muestra número tres con sintaxinina-3 fusionada con mCitrine y mCherry.

Cultivo de las células transfectadas en DMEM de alta glucosa suministrado con 10% de FCS y 1% antimicótico antibiótico a 37 grados Celsius con 5% de CO2 en una incubadora de cultivo celular durante la noche. Al día siguiente, aspire el medio y lave las células una vez con medio de imagen de células vivas durante dos minutos. Después de eso, coloque las células en un medio de imagen nuevo.

Para comenzar este procedimiento, coloque la muestra número dos a 37 grados Celsius, en una platina calentada, bajo un microscopio confocal de imágenes de por vida con fluorescencia en el dominio del tiempo con una fuente de excitación pulsada para el fluoróforo donante y la adquisición de datos resueltos en el tiempo. Antes de cada microscopía de fluorescencia o medición de FLIM, seleccione una celda con expresión visible de las proteínas SNARE marcadas con mCitrine y mCherry y registre una imagen confocal de 256 por 256 píxeles con excitación simultánea de ambos fluoróforos. Grabe una imagen FLIM haciendo clic en ejecutar FLIM con la imagen FLIM grabada con las mismas dimensiones y resolución espacial que la imagen confocal grabada anteriormente.

Grabe la imagen con al menos 50.000 fotones para el análisis FLIM de célula completa o al menos 400 fotones por píxel. Es importante registrar las mediciones de FLIM al menos a un micrómetro de distancia de la superficie del vidrio para evitar una vista de reflexión. Repita la imagen de varias células en la muestra número dos y para las células de la muestra número uno y la muestra número tres.

A continuación, coloque un cubreobjetos de vidrio limpio en la platina del microscopio para registrar la función de respuesta de un instrumento o IRF. Ajuste el monocromador del detector de emisiones a la longitud de onda de excitación y haga clic en el botón ejecutar FLIM para grabar una imagen FLIM con la dispersión posterior del deslizamiento de la cubierta de vidrio. Las grabaciones fotográficas se convertirán en imágenes FLIM con el software de conversión PT32ICS.

Configure el software. Establezca la salida en ImageJ para generar imágenes FLIM. Establezca el tamaño de la imagen en 256 por 256 píxeles y el canal en dos.

Presione convertir y cargue una o más trazas de fotones. Mantenga pulsada la tecla de control para seleccionar varias trazas de fotones. Las imágenes FLIM deben generarse en la misma carpeta donde se guardan las trazas de fotones.

Comience abriendo el programa de software de análisis de datos capaz de encajar con la deconvolución. Importe el archivo de texto que contiene el histograma para cada trazo de foto. Reorganice la tabla de modo que el IRF esté en la segunda columna de la tabla, junto a los valores de tiempo de la columna A.Determine la calidad de las trazas de fotones registradas seleccionando todas las columnas.

No analice trazas de fotones con un pico de reflexión alto. Aquí se muestra un ejemplo. Utilice la tecla de control para seleccionar todas las columnas que contengan los histogramas de vida útil de calidad controlada que se ajustarán, así como el IRF en la columna B, y cargue el ajuste no lineal.

Cargue la función de ajuste deconvolutado agregando esta función al software de análisis. Seleccione el archivo de función de ajuste. Esta función se ajusta a los histogramas de vida útil de fluorescencia con una función de decaimiento monoexponencial deconvoneada con el IRF.

Realice el escalado del eje X de las curvas ajustadas. Ajusta las curvas pulsando ajustar. Esto convertirá el ajuste y generará una hoja de informe en la matriz con la tabla que contiene los tiempos de vida, los desplazamientos y las amplitudes de la fluorescencia.

También generará una ficha técnica con las curvas ajustadas y los residuos del ajuste. Se muestran imágenes confocales representativas de helocélulas que expresan solo sintaxina cuatro mCitrino, esnitaxina cuatro mCitrino con VAMP3 mCherry, o la sintaxina tres mCitrine mCherry construcción en tándem. En estas imágenes de fluorescencia que acompañan, el color indica la vida útil fluorescente aparente promedio.

A continuación, las imágenes se complicaron con las intensidades de fluorescencia del fluoróforo donante de mCitrine. A continuación se muestran las mismas imágenes con ajuste con funciones de decaimiento biexponencial. Los colores de los píxeles indican las fracciones estimadas de sintaxina cuatro en complejo con VAMP3.

La función de respuesta del instrumento de la configuración se midió utilizando la retrodispersión en la interfaz de agua cristalina. Se muestran histogramas de vida útil de células enteras para células que expresan solo sintaxina cuatro mCitrino, que coexpresan sintaxina cuatro mCitrine con VAMP3 mCherry y expresan la sintaxina tres mCitrine mCherry constructo tándem. El panel E muestra una superposición de las curvas de decaimiento de los paneles B, C y D. Las incrustaciones muestran los mismos gráficos, pero con una escala logarítmica del eje Y.

Un histograma fluorescente de la vida útil registrado demasiado cerca de la superficie de la cubierta del microscopio dio como resultado un gran pico de reflexión, representado por el área sombreada en amarillo. Por último, se muestra un histograma de vida útil con ajuste representativo con función de decaimiento biexponencial. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos a cuatro horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar registrar varias células, ya que los niveles de expresión del donante y del interceptor SNARES pueden influir en la vida útil. Siguiendo este procedimiento, las células pueden activarse para responder a preguntas específicas del tipo de célula relacionadas con el reenraizamiento del tráfico de membrana mediado por SNARE. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del tráfico de membranas exploraran las vías intercelulares del tráfico de organelas en todas las células eucariotas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo registrar y analizar los datos FLIM. No olvide que trabajar con organismos genéticamente modificados y láseres de alta potencia puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como guantes y protecciones para los ojos, al intentar este procedimiento.