Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

El objetivo general de este procedimiento es aislar y cultivar células estromales de la médula ósea (BMSC, por sus siglas en inglés). Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos óseo y adipocitario sobre las células progenitoras. La principal ventaja de esta técnica es que las BMSC se pueden aislar de una manera relativamente rápida, repetible y económica.

La demostración visual de este método es útil, ya que los pasos de disección pueden ser difíciles de explicar solo con texto. Antes de comenzar el procedimiento de recolección de huesos, agregue 100 microlitros de medio de cultivo de células madre de médula ósea en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por cada tres huesos que se van a recolectar. Y corte el extremo de una punta de pipeta de 200 microlitros por tubo de microcentrífuga, de modo que cada punta pueda caber en un solo tubo con las tapas cerradas.

A continuación, coloque el primer ratón eutanasiado de 78 semanas en posición supina sobre una tabla de disección y rocíe al animal con etanol al 70%. Use fórceps para crear una tienda de piel en el abdomen y use tijeras de disección estériles para hacer una incisión en la piel de aproximadamente un centímetro. Retire la piel para exponer la parte inferior del abdomen y las piernas.

Corte a lo largo de la cresta ilíaca de cada cadera para separar las cabezas del fémur de la pelvis, y haga una incisión a través de la línea media de la pelvis para separar los huesos ilíacos, y corte por debajo de las articulaciones del tobillo para quitar los pies. Luego, separa la tibia del fémur cortando la articulación de la rodilla. Luego, use toallitas sin pelusa para quitar cuidadosamente el músculo de los fémures, las tibias y los huesos ilíacos.

Cuando se hayan recolectado todos los huesos, coloque las muestras en PBS sobre hielo y transfiera las muestras a una campana de cultivo estéril. Utilizando una técnica estéril, haga cortes de uno a dos milímetros en los extremos proximal y distal de cada hueso antes de colocar tres huesos en cada punta de micropipeta modificada en los tubos de microcentrífuga. Extraiga la médula ósea de los huesos por centrifugación, confirmando si la médula se ha granulado completamente hasta el fondo de cada tubo de microcentrífuga al final del centrifugado.

Si se ha recolectado toda la médula, los huesos aparecerán blancos. Retire las puntas de la micropipeta y los huesos de los tubos de recolección para una eliminación adecuada de bioseguridad. Para colocar placas en las células de la médula ósea, primero use una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 25 para volver a suspender lentamente los gránulos y romper los grumos, y agrupe las muestras en un solo tubo cónico de 15 mililitros.

Agregue 10 mililitros de medio de cultivo de células madre de médula ósea por 500 microlitros de muestra y filtre la suspensión celular a través de un filtro de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros para eliminar cualquier fragmento de hueso. Después de contar, siembre las células de la médula ósea a una densidad de 10 a la sexta células por centímetro cuadrado en medio de cultivo fresco para una incubación de 72 horas a 37 grados Celsius y 5% de CO2. Al tercer día, reemplace el sobrenadante con medio fresco, cambiando el medio cada dos días a partir de entonces hasta que las células alcancen una confluencia del 80% al 100%.

Para colocar un cultivo dividido de células de médula ósea, coloque las células de médula ósea recolectadas de un ratón en una placa de cultivo celular de 10 centímetros durante 48 horas en un medio de cultivo fresco en una incubadora de cultivo celular. En el segundo día de cultivo, retire el sobrenadante que contiene células madre hematopoyéticas no adherentes y lave cuidadosamente la placa con PBS, sin alterar las células de médula ósea adheridas. Reemplace el PBS con 0.25% de tripsina.

Después de uno a tres minutos a 37 grados centígrados, apague la reacción con medio de cultivo celular fresco y cuente las células en la suspensión celular resultante. Centrifugar el número adecuado de celdas para el recubrimiento y vuelva a suspender el pellet en suficiente medio de cultivo fresco para la densidad de recubrimiento deseada. A continuación, coloque las placas en la incubadora de cultivos celulares hasta la confluencia.

Para inducir la diferenciación osteoblástica de las células madre de la médula ósea, reemplace el medio de cultivo celular con el medio de diferenciación cada dos días, hasta que las células comiencen a producir nódulos blancos de mineralización que se puedan observar macroscópicamente. Para inducir la diferenciación de adipocitos con células madre de médula ósea, reemplace el medio de cultivo celular de un cultivo de células de médula ósea confluente con un medio de inducción de adipocitos. Después de dos días de cultivo, reemplace el sobrenadante con medio de inducción de adipocitos fresco, cambiando a medio base de adipocitos en el cuarto día.

Al séptimo día, confirme que las células han acumulado gotas de lípidos y que muestran un fenotipo similar al de los adipocitos maduros. Para diferenciar las células madre hematopoyéticas en osteoclastos, cuando un cultivo de células de médula ósea total o un cultivo de células no adherentes se adhieren, reemplace el medio de cultivo celular con un medio de diferenciación de osteoclastos. Cambie el medio cada dos días y verifique la diferenciación de los osteoclastos diariamente bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x hasta que los osteoclastos se fusionen y formen células multinucleadas, generalmente alrededor de los días cinco a siete de diferenciación.

Los cultivos confluentes de BMSCs pueden diferenciarse en osteoblastos utilizando un medio osteogénico compuesto de ácido ascórbico y beta-glicerofosfato. Después de unos días de diferenciación, los osteoblastos comienzan a expresar fosfatasa alcalina. Y una mayor diferenciación desencadenará la producción de matriz osteoide y, en última instancia, la mineralización de esta matriz.

Curiosamente, solo una proporción de las células se diferenciará en osteoblastos in vitro, como lo revela la tinción de violeta cristalino. Ya sea que se utilicen poblaciones mixtas o poblaciones de células de médula ósea divididas, solo una proporción de las células se diferenciará en adipocitos, que aparecen como células redondas con múltiples vacuolas lipídicas que se pueden teñir con colorante rojo O de aceite. Los cultivos de células madre humanas suplementados con el factor estimulante de células murinas y RANKL se fusionarán rápidamente para formar células multinucleadas que darán positivo para TRAP.

Estos osteoclastos son capaces de reabsorber la matriz mineral in vitro, y pueden utilizarse para evaluar la actividad osteoclástica. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en menos de una hora, si se realiza correctamente, dependiendo del número de ratones. Al intentar este procedimiento, es importante recordar esterilizar las herramientas y preparar los medios de antemano, para poder trabajar de la manera más rápida y aséptica posible.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y cultivar células estromales de la médula ósea.