Name: Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a preparar cultivos de ganglios de la raíz dorsal de ratón para estudiar neuroplasticidad, neuroinflamación y respuestas neuronales a infecciones virales en modelos ex vivo.

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Agradecemos sinceramente las instalaciones centrales de la proyección de imagen en Midwestern Universidad (Uth) y el grupo de estudiantes [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo y Casey Sigerson] por sus contribuciones en cultivo celular y trabajo de imagen. Este trabajo de investigación fue apoyado por donaciones de la Uth Intramural fondos fondos de puesta en marcha M.F. e investigación a V.T.

Todos los procedimientos incluyendo el uso de los animales han sido aprobados por los protocolos de aprobado por la Junta de revisión institucional (IACUC Midwestern University).
1. recolección de DRG de embriones de ratón
<ol><li>
Eutanasia a los ratones adultos por método de asfixia (CO2) seguidos de la decapitación. Inmediatamente proceder a extirpar quirúrgicamente de la columna vertebral.
	<ol>
<li>Exponer la columna vertebral por el corte hacia abajo de la capa de la piel dorsal con unas tijeras finas. Aislar la columna vertebral por el corte a través de las costillas a ambos lados de la columna y el sacro separar la columna vertebral del resto de los animales.</li>
		<li>Monte la columna vertebral (ventral hacia arriba) sobre una colchoneta quirúrgica utilizando agujas/alfileres.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Con tijeras finas hacen un doble corte en ambos lados de los cuerpos vertebrales para exponer el lado ventral del canal vertebral.</li>
	<li>Microscopio quirúrgico (ampliación a 4 X), use tijeras para mover suavemente la médula espinal en el lado para exponer las raíces espinales dorsales contralaterales y localizar el DRG, a lo largo de las raíces dorsales de los nervios periféricos. Cada ganglio está parcialmente escondido dentro de los agujeros intervertebrales.</li>
	<li>Para cosechar el DRG, pellizcar la raíz dorsal (entre la médula espinal y el DRG) con una pinza y tire suavemente hacia fuera del DRG del agujero intervertebral.</li>
	<li>Coloque la segunda pinza en el nervio espinal periférico para el DRG y tire el DRG junto con el nervio espinal y la raíz espinal.</li>
	<li>Coloque el DRG recogido en una placa de Petri que contiene 3 mL de suero helado libre media (MFS)34de 35 mm.</li>
	<li>Transferir cada DRG individual en un vaso seco de Petri, microscopio quirúrgico, limpieza y recorte el exceso fibras y tejido conectivo fijados al DRG usando una hoja de. El DRG es fácilmente identificable como una estructura transparente abultada a lo largo de la raíz de nervio espinal blanco. Los vasos sanguíneos a menudo se encuentran alrededor del DRG.</li>
	<li>Coloque el DRG limpio en una nueva placa de Petri que contiene medios SFM helados.</li>
	<li>Diluir la mezcla de proteína gelatinosa (véase Tabla de materiales) en SFM helada (1:1).</li>
	<li>El DRG ex vivo en placas de 12 pocillos había cubierto primero con 10/20 μl de mezcla de proteína gelatinosa y establecer dentro de la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 durante 30-60 minutos.</li>
	<li>Suavemente agregar 1.5-2 mL de SFM para el sistema de cultivo cubre el explante entero y mantener los explantes en el cultivo de las condiciones (37 ° C y 5% CO2). Nota: Este es un paso crítico ya que el DRG está anclado a los platos de vidrio solamente por la mezcla de proteína gelatinosa polimerizado. Tiempo de polimerización y pipeteo habilidades son fundamentales para evitar la flotación.</li>
	<li>Cambiar el medio de cultivo DRG cada 72 h y dejar que el DRG a crecer para siempre y cuando sea necesario.</li>
</ol>2. aislar las neuronas unicelular de DRG
<ol><li>Lugar el DRG recoger en un tubo estéril de 1.5 mL con 1,2 mL de medio de F12 que contiene 1,25 mg/mL de colagenasa IV e incubar a 37 ° C y 5% CO2 para 45 min Repita este paso para otro 45 min después de la primera incubación.</li>
	<li>Tratamiento de explantes con 2 mL de medio de F12 que contiene tripsina (0.025%) durante 30 minutos inmediatamente después del tratamiento de la colagenasa IV a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Incubar con 2 mL de medio de F12 que contenga suero fetal bovino (FBS; 33%) a 37 ° C y 5% de CO2 durante 15 minutos.</li>
	<li>Lavar los explantes tres veces con 2 mL de medio de F12 y proceder mecánicamente saldarse con una pipeta de vidrio hasta que los medios de comunicación se vuelve turbia. Nota: Este procedimiento implica la colección de DRG limpiar/recortado del animal como se explica en la sección anterior. Al realizar la disociación mecánica de explantes, ser suave y no use fuerza excesiva ya que puede conducir a derrames y la pérdida de material de trabajo.</li>
	<li>Filtrar el cultivo de células disociadas a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar cualquier impurezas y exceso de tejido conectivo. Centrifugar el filtrado celular lysate (2.500 x g) durante 2 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 500 μl de neurobasal medios que contenga suplemento para cultivo neuronal (1 x), mezcla antibiótica (1 x), L-glutamato (0,5 mM) y nervio del factor de crecimiento (5 μg/mL) (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Las células disociadas en diapositivas cubierta revestida de laminina (50 μg/mL; véase Tabla de materiales) de la placa a una densidad celular preferido. Determinar la densidad celular usando un contador de células. Nota: Nos plateó las células de 25.000 diapositivas de las células de la cubierta. Esta técnica permite la disociación de las neuronas y células glial satélite. El componente glial cultivado conjuntamente con las neuronas pseudounipolares juega un papel fundamental para la supervivencia neuronal.</li>
</ol>3. HSV-1 infección de explantes DRG y las células disociadas derivadas de DRG
Nota: Este trabajo se realizó siguiendo estrictamente los bioseguridad nivel 2 (BSL-2) requisitos a los que tenemos un laboratorio totalmente equipado que es aprobado por el Comité de bioseguridad Midwestern University. En este estudio se usó una cepa KOS de HSV-1. Por favor tome medidas apropiadas de seguridad y según las directrices de las instituciones locales si se trabaja con cepas de virus.
<ol><li>Determinar y preparar el virus en las diluciones correctas en medio SFM para infectar al modelo. Los virus utilizados en este estudio fue cepa KOS de HSV-1. Cuando trabajo con derivados de DRG disocia células, utilizar 1 unidad de la multiplicidad de infección (MOI) para la infección, lo que significa el número de virus igual el número de células.</li>
	<li>Si infección DRG explantes, utilice el número de viriones (p. ej., 10.000 viriones) porque no se puede determinar un número exacto de las células en un explante.</li>
	<li>Coloque el explante/células infectadas con el virus en una placa celular estéril o tubo que contiene una mezcla de medios SFM y virus. Nota: Se utilizaron 25.000 viriones para una diapositiva de cubierta que contiene 25.000 células (1 MOI). Para infectar un explante, usamos 10.000 viriones.</li>
	<li>Coloque la placa de la célula o el tubo a 37 º C para infección ocurrir; tiempo de exposición viral puede variar dependiendo de la infectividad viral. Nota: Entrada Viral fue confirmada utilizando Orto-nitrofenil-β-galactósido (ONPG) y 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) ensayos26.</li>
</ol>4. inmunofluorescencia
<ol><li>Fijar los explantes y unicelular muestras en formol al 4% preparado en tampón fosfato salino (PBS). Lavar las muestras durante 10 minutos 3 veces en PBS.</li>
	<li>Incubar las muestras con anticuerpos primarios deseados (anti-β-tubulina, anti-peripherin, anticuerpos de anti-heparán sulfato (HS), o contra la glicoproteína D (gD); véase Tabla de materiales para las diluciones) diluidos en tampón PBS con 0.3% Triton-X (SAFT) y 10 % de suero normal de cabra. Almacenar las muestras a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Lavar las muestras durante 10 minutos con PBS 3 veces. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 1 hora en el correspondiente anticuerpo secundario (488 o Cy3; véase Tabla de materiales para las diluciones) diluido en PBS.</li>
	<li>Lavar las muestras durante 10 minutos con PBS 3 veces. Incubar las muestras con colorante Hoechst (1,5 μm) en PBS durante 20 minutos antes del paso de montaje.</li>
	<li>Montar las muestras en portaobjetos de vidrio con un medio de montaje de fluorescencia y un cubreobjetos.</li>
</ol>

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Los autores no tienen nada a la divulgación.

El modelo ex vivo DRG es muy útil para investigar una amplia gama de eventos como interacción neurona-glia, así como el efecto del microambiente en ambos el metabolismo neuronal y glial37. Además, el DRG-modelo podría utilizarse como una herramienta rentable para abordar preguntas relevantes sobre el mecanismo patogénico y asociado marcadores desarrollando ex vivo sistemas para fase aguda crónica y latente de la infección o de una determinada enfermedad. Además, una biblioteca de...

En este manuscrito, se presenta un método para obtener un modelo ex vivo de organotypic de un sistema de modelo de ratón derivado DRG como un microambiente como tejido conservado para investigar una amplia gama de respuestas biológicas a los insultos PNS desde neuronal-glial interacción, neuroplasticidad, marcadores inflamatorios, infección viral. Además, hemos desarrollado un protocolo para crear una cultura co primaria de derivados de DRG solo neuronas sensoriales y las células satélite.
El DRG son gris-materia-unidades satélite situadas fuera de sistema nervioso central (SNC) a lo largo de las raíces espinales dorsales de los nervios espinales. El DRG, situado en la proximidad de los agujeros intervertebrales, las neuronas sensoriales pseudounipolares casa y células gliales por satélite. Las neuronas pseudounipolares tienen una sola neurita que se divide en un proceso periférico lleva entradas somáticas y viscerales de objetivos periféricos al cuerpo de la célula y un proceso central que envía información sensorial del cuerpo celular en el SNC. Una cápsula de tejido conectiva define y aísla esta agrupación periférica de neuronas y células gliales del SNC. Sin migración celular postnatal desde el DRG o nunca se ha descrito y un nicho de células madre local es responsable de eventos neurógeno, que ocurre a lo largo de la vida1. Por lo tanto, este modelo es particularmente adecuado para el estudio de la neurogénesis adulta, axonogenesis, respuesta a la lesión traumática y la célula muerte2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
En el campo de Neurorregeneración, el DRG extraídas en vivo y explantado en vitro reproduce axonotmesis, una condición de la lesión en que axones son totalmente roto y el cuerpo neuronal de la célula está desconectada del destino inervados10 ,11. Es bien sabido que lesión periférica del nervio puede causar expresión génica disminución y aumento en el DRG y muchos de estos cambios son el resultado de procesos regenerativos pero muchos también pueden ser el resultado de la respuesta inmune u otra respuesta de las células no neuronales. Mediante el uso de un ex vivo sistema de DRG aislado, algunos de esta complejidad se elimina y vías mecanicistas pueden investigarse más fácilmente.
Además de su papel central en transporte entradas sensoriales al SNC, la abundancia de receptores para muchos neurotransmisores como GABA12,13,14,15 a nivel del soma neuronal, así como evidencia de excitación de Cruz interneuronal puede sugerir que DRG son sofisticados integradores preliminares de entradas sensoriales16,17. Estos nuevos hallazgos confieren al explante DRG las características de un sistema de red mini-neuronal similar a otros modelos "mini cerebro", que son específicos de tejido nervioso organitas utilizado para campos experimentales más amplio de investigación y terapéutica enfoque a enfermedades neurológicas18,19. Estas evidencias junto con el hecho de que el GRD es un grupo discreto y bien definido de tejido neuronal rodeado por una cápsula de tejido conectiva, hacen que sea un órgano adecuado para el trasplante de vivo ex .
Cultivo ratón DRG presenta una opción atractiva multicelular modelo pathophysiologies humanas debido a las similitudes estructurales y genéticas entre las especies. Además, un gran repositorio de cepas de ratón transgénico es muy propicio para futuros estudios mecanicistas. Extensión del neurite tanto durante el desarrollo y después de la lesión requiere interacciones mecánicas entre crecimiento cono y sustrato20,21. Nano - y micro-patrón sustratos se han utilizado como herramientas para dirigir la consecuencia del neurite y demostrar su capacidad para responder a las características topográficas en sus microambientes. Han demostrado las neuronas para sobrevivir, se adhieren, migran y orientar sus axones para navegar características superficiales como surcos en sustratos,,2223. Sin embargo, estos estudios han utilizado típicamente líneas de cultivo de células y es difícil predecir cómo primarios neuronales células voluntad responde a pautas bien definidas, física en vivo o ex vivo.
El modelo de explante ex vivo del ratón DRG utilizado para esta propuesta imita la interacción célula-célula real y señales bioquímicas que rodea los axones creciente. Entre muchos diferentes paradigmas experimentales que van desde la regeneración axonal, desarrolló la producción, neuroinflamación, el DRG explante modelo continúa sirviendo como una herramienta valiosa para investigar el aspecto de la infección y la latencia viral en sensorial los ganglios24,25,26,27.
El sistema nervioso (NS) en general es blanco para infecciones virales28,29,30. Mayoría de los virus infecta las superficies de células epiteliales y endoteliales y hace su camino desde la superficie del tejido a NS a través de nervios periféricos las fibras sensoriales y motoras. En particular, el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) después de una infección inicial en las células epiteliales establece un estado de vida latente en los ganglios sensoriales preferiblemente, el DRG del PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacidad de infectar el PNS en último término conduce a enfermedades neurológicas33.

<table><tbody><tr><td>Ratones adultos NIH/</td><td>Suiza Harlan Laboratories Placa</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Petri de 35 mm</td><td>Tratamiento de células</td><td>229635</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel ECM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1270</td> mezcla <td>de proteínas gelatinosas</td></tr><tr><td>F12</td><td>Media Gibco</td><td>11765-054</td><td>*Parte de SFM</td></tr><tr><td>Media Colagenasa IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 0,22um</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Medios neurobasales</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Suplemento para el cultivo neuronal</td></tr><tr><td>Antibióticos PSN</td><td>Gibco</td><td>15640-055</td><td>*Parte de los medios SFM Mezcla de antibióticos</td></tr><tr><td>L-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>*Parte de los medios de SFM</td></tr><tr><td>NGF</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td>Factor de crecimiento nervioso</td></tr><tr><td>Portaobjetos recubierto de laminina</td><td>Neuvitro</td><td>GG-14-Laminin</td><td></td></tr><tr><td>ONPG subtrata</td><td>Pierce</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Invitrogen</td><td></td> 15520034 <td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-B-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8328</td><td>1:2000 dilución</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-periferona</td><td>Millipore</td><td>AB1530</td><td>dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Colorante Hoechst</td><td>Thermo Fisher</td><td>62249</td><td>1.5 &micro; M concentración final</td></tr><tr><td>Sulfato antiheparán</td><td>US Biológico</td><td>H1890-10</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti gD</td><td>Virostat</td><td>196</td><td>dilución 1:10</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>*Parte de los medios SFM</td></tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>21010-046</td><td>*Parte de los medios SFM</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>*Parte de los medios SFM</td></tr><tr><td>KIT (Insulina-transferrina-Selenio-A)</td><td>Gibco</td><td>51300-044</td><td>*Parte de los medios SFM</td></tr><tr><td>Vitamina-C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td>*Parte de los medios SFM</td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td>*Parte de SFM media</td></tr><tr><td>488 (anti-ratón de cabra)</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 (anti-conejo de cabra)</td><td>Laboratorios de investigación inmunológica de Jackson</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal&nbsp;</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector</td><td>H-1500</td><td>Flurescence</td></tr><tr><td>mount Diamond White Glass Coverslides</td><td>Globe Scientific</td><td>1380-20</td><td></td></tr></tbody></table>

ratón adulto drg explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección viral y la neuroplasticidad

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

Este protocolo describe un modelo ex vivo de raíz dorsal de ratón derivados ganglios (DRG) explante y en vitro derivados de DRG Co cultura de disociado de las neuronas sensoriales y las células glial satélite. Estos son modelos versátiles y útiles para investigar una variedad de respuestas biológicas asociadas con condiciones fisiológicas y patológicas del sistema nervioso periférico (PNS) que van desde la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la infección viral. El uso de explantes de DRG es científicamente ventajoso en comparación con las células simples modelos por múltiples razones. Por ejemplo, como una cultura organotypic, explante GRD permite a transferencia ex vivo de toda una red neuronal como el microambiente extracelular que juegan un papel significativo en todas las funciones neuronales y gliales. Además, DRG explantes pueden también mantener ex vivo para varios días y las condiciones de cultivo pueden ser perturbadas como deseado. Además, el DRG cosechado puede ser disociado más en una cultura Co en vitro de neuronas sensoriales primarias y células glial satélite para investigar la interacción neuronal-glial, neuritogenesis, cono axonal interacción con el medio extracelular microambiente y más general, cualquier aspecto asociado con el metabolismo neuronal. Por lo tanto, el sistema de DRG-explante ofrece una gran flexibilidad para estudiar una amplia gama de eventos relacionados con las condiciones biológicas, fisiológicas y patológicas de una manera rentable.

Múltiples aspectos de la interacción de la neuroplasticidad y la neurona y el medio ambiente se pueden investigar mediante DRG y un modelo de cultura de célula disociados. Comenzamos los estudios aislando un explante de GRD y las células disociadas derivadas de DRG como esquemáticamente representadas en la figura 1. Modelos de células y tejidos pueden ser analizados usando una variedad de técnicas moleculares como la inmunofluorescencia, Western blot, ensayos de genómicos y otras técnicas an...

En este informe, se destacan las ventajas de las culturas organotypic y disociadas cultivos primarios de ganglios de raíz dorsal derivadas de ratón para investigar una amplia gama de mecanismos asociados a la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la respuesta a la infección viral.

Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un modelo ex vivo de un explante de ganglios de la raíz dorsal y/o un modelo de célula disociada primaria derivada de DRG para investigar las respuestas neuronales a las señales ambientales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroplasticidad, o neuroinflamación, en respuesta a la exposición a patógenos. La principal ventaja de esta técnica es que los explantes de los ganglios de la raíz dorsal mantienen la complejidad similar a la de un órgano, útil para iniciar la acción del ciclo celular y los cambios en el microambiente intercelular debido a tratamientos específicos.La demostración atenta de este método es muy crítica, ya que la identificación de los GRD, así como su cosecha, puede ser bastante difícil debido a su tamaño y ubicación. Para comenzar este procedimiento, exponga la columna vertebral cortando la capa de piel del animal, dorsalmente con unas tijeras finas. A continuación, aísla la columna vertebral cortando las costillas a ambos lados de la columna y a través del sacro, separando la columna vertebral del resto del animal.Después, monta la columna vertebral con el lado ventral hacia arriba sobre una colchoneta quirúrgica con agujas y clavos. A continuación, haga un corte doble en ambos lados de los cuerpos vertebrales para exponer el lado ventral del canal vertebral. Bajo un microscopio quirúrgico, mueva suavemente la médula espinal hacia un lado para exponer las raíces espinales dorsales contralaterales y para localizar el DRG a lo largo de las raíces dorsales de los nervios periféricos.Cada ganglio está parcialmente oculto dentro de los agujeros intervertebrales. Para cosechar DRG, pellizque la raíz dorsal con una pinza y extraiga suavemente el DRG del agujero intervertebral. A continuación, coloque la segunda pinza en el nervio espinal periférico al DRG y tire del DRG junto con el nervio espinal y la raíz espinal.Posteriormente, coloque el DRG recolectado en una placa de Petri de 35 milímetros que contenga tres mililitros de medio helado y libre de suero. Transfiera cada DRG a una placa de Petri de vidrio seco. Bajo un microscopio quirúrgico, limpie y recorte el exceso de fibras y tejido conectivo aún adherido al DRG con una cuchilla.El DRG es fácilmente identificable como una estructura abultada y transparente a lo largo del nervio espinal blanco, y a menudo se encuentran vasos sanguíneos alrededor del DRG. Después de eso, coloque el DRG limpio en una nueva placa de Petri que contenga medios helados y sin suero. Diluya la mezcla de proteínas gelatinosas en medios helados sin suero en una proporción de 1:1.A continuación, coloque el DRG ex vivo en las placas de 12 pocillos prerrecubiertas con 10 o 20 microlitros de mezcla de proteínas gelatinosas. Y manténgalos a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. A continuación, añada suavemente de 1,5 a dos mililitros de medios sin suero al sistema de cultivo para cubrir todo el explante y mantener los explantes en condiciones de cultivo.Cambie el medio de crecimiento de DRG cada 72 horas y deje que el DRG crezca durante el tiempo que sea necesario. Este es un paso crítico ya que el DRG se ancla a la placa de vidrio utilizando la mezcla de proteínas gelatinosas. Por lo tanto, la oporización del tiempo y las habilidades de pipeteo son fundamentales para evitar la flotación.En este procedimiento, coloque todo el DRG recolectado en un tubo estéril de 1,5 mililitros con medio F12 que contenga colagenasa 4 e incube a 37 grados centígrados durante 45 minutos. A continuación, sustituya el medio fresco que contiene colagenasa 4 e incube la muestra durante otros 45 minutos. A continuación, trate los explantes con dos mililitros de medio F12 que contenga 0,025% de tripsina a 37 grados centígrados durante 30 minutos inmediatamente después del tratamiento con colagenasa 4.Incubarlos con dos mililitros de medio F12 que contenga suero fetal bovino a 37 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, lavar los explantes tres veces con dos mililitros de medio F12 y proceder a disociarlos mecánicamente con una pipeta de vidrio hasta que el medio se vuelva turbio. A continuación, filtre el cultivo celular disociado a través de un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar las impurezas y el exceso de tejido conectivo.A continuación, centrifugar el lisado celular filtrado durante dos minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 500 microlitros de Nurobasal Media. Coloque las celdas disociadas en portaobjetos de cubierta recubiertos de laminado a una densidad de celda preferida.En este paso, prepare el virus en las diluciones correctas en medios libres de suero para infectar el modelo utilizando una unidad de MOI cuando se trabaje con células disociadas derivadas de DRG. Coloque los explantes que se van a infectar con el virus en una placa de células estériles que contenga una mezcla de medios libres de suero y virus. A continuación, coloque la placa o el tubo de la célula a 37 grados centígrados para que se produzca la infección.Ahora fije la muestra en formalina al 4%. Lávelo tres veces durante 10 minutos cada una en PBS. A continuación, incubar la muestra con el anticuerpo primario deseado diluido en PBST y suero de cabra normal al 10%.Almacene la muestra a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave la muestra tres veces durante 10 minutos cada una con PBS. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante una hora en el anticuerpo secundario adecuado diluido en PBS.Luego lávelo tres veces durante 10 minutos cada una con PBS. Incubar la muestra con colorante Hoechst en PBS durante 20 minutos antes del paso de montaje. Posteriormente, monte la muestra en portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje de fluorescencia y un cubreobjetos.En esta imagen, la infección por HSV-1 de células satélite disociadas representada a lo largo de neuritas bata tubulina positivas en verde se revela utilizando un anticuerpo antiviral GD en rojo. Los núcleos de las células gliales satélite se tiñen de azul con Hoechst. El mismo anticuerpo revela la entrada viral en las neuronas DRG disociadas.Las células están co-marcadas con un anticuerpo contra el heparán sulfato expresado en la membrana celular. El heparán sulfato también es un componente de la matriz extracelular y desempeña un papel importante en el crecimiento axonal. Las neuronas se marcan con Pariferina en rojo, mientras que el azul de Hoechst se utiliza para identificar los núcleos de las células satélite.Una vez dominado, el extractinato de DRG ex vivo puede completarse en dos o dos horas y media si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar respetar el tiempo. Y no dejar que los ejemplares se sequen para mantener vivos los explantes.Después de la recolección de la DRG, se pueden realizar otras técnicas como la disociación de células individuales para responder a preguntas adicionales como el efecto de las preguntas ambientales para el metabolismo intercelular. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la neurología neural exploraran la respuesta inmunitaria neuronal a los patógenos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar explantes de ganglios de raíz dorsal y cómo generar cultivos celulares disociados primarios derivados de ganglios de raíz dorsal.No olvide que trabajar con virus o cualquier otro patógeno puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como guantes y batas de laboratorio, desechar adecuadamente sus desechos mientras se realiza este procedimiento.

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Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

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Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad (Video) | JoVE Journal

Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad

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