Name: Síntesis de funcionalizados 10 nm recubierto de polímero partículas de oro para apuntar el endotelio y el suministro de medicamentos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprende a sintetizar nanopartículas de oro de 10 nm recubiertas con PEG para aplicaciones cardiovasculares. Este método crea partículas biocompatibles con grupos funcionales disponibles para personalización terapéutica.

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Este trabajo fue financiado por el Departamento de ingeniería de química de Universidad de noreste, fondos de puesta en marcha y una beca de estudios de nivel 1 piloto del noreste oficina del preboste de la Universidad, NIH K01 HL125499 y NSF-IGERT beca NSF/DGE-096843. Los autores también desean agradecer a Thomas J. Webster y a su laboratorio para su asistencia, así como la ciencia de la nanomedicina y centro de tecnología y Departamento de ciencias farmacéuticas en la Universidad Northeastern.

1. preparación o adquisición de las soluciones madre (almacenar a temperatura ambiente o congelados hasta su uso)
<ol><li>Preparar una solución madre de hidróxido de sodio (NaOH) de 1 M disolver 400 mg de NaOH en agua ultrapura de 10 mL a temperatura ambiente y mezclar bien los materiales. Nota: Agua ultrapura se define como agua sin impurezas como partículas, bacterias, nucleasas, iones o restos de materia orgánica. Un sistema de purificación se utiliza para obtener agua ultrapuro, dando por resultado su resistividad de 18,2 a mΩ·cm, indicando una baja contaminación aniónica. No se recomienda el uso de agua ultrapura embotellada comercialmente disponible. En adelante, este agua ultrapura se referirán a como el agua, a menos que se especifique lo contrario.</li>
	<li>Preparar una solución stock de NaOH de 6 M por 2,4 g de NaOH en 10 mL de agua de disolución y la solución a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar una solución stock de 250 mM de ácido chloroauric (HAuCl4) disolviendo 1 g de secas HAuCl4 10,16 ml de agua. Diluir 1 mL de 250 mM HAuCl4 con 9 mL de agua para obtener la concentración de trabajo de 25 mM HAuCl4. Almacenar la solución de HAuCl4 a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar un buffer de carbonato de 0.1 M pH 8.8, por disolución de bicarbonato de sodio 84 mg en 10 mL de agua y ajustar el pH a 8.8 añadiendo NaOH M 6 en el paso 1.2. Almacenar el buffer de carbonato a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mezclar 20 mL de tetrazolio sal compuesto, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), con un agente estabilizador, METOSULFATO ethosulfate (PES) (véase Tabla de materiales). Guarde la mezcla PES/MTS en alícuotas (para un máximo de 10 ciclos de congelación y descongelación) a-20 ° C en oscuridad.</li>
</ol>2. síntesis de los núcleos de nanopartículas de oro
<ol><li>Preparar una solución diluida de THPC agregando 12 μl de 80% THPC en agua a 1 mL de agua en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sujetar un matraz de fondo redondo de 100 mL el centro de una placa de agitación magnética. 45 mL de agua, vierta en la cubeta y agregue el agua a 300 rpm usando una barra de agitación magnética en forma de huevo pequeño. Añadir 0,5 mL de 1 M NaOH y 1 mL de solución diluida de THPC. Seguir revolviendo la mezcla de reacción vigorosamente por 5 minutos.</li>
	<li>Continuar agitando la mezcla y añadir 2 mL de solución de HAuCl4 de 25 mM. El color de la mezcla cambia de amarillo a marrón oscuro dentro de segundos, lo que indica que la formación de THPC capsulado AuNPs con una carga negativa. Revolver la mezcla por un adicional 15 min permitir la completa formación de los núcleos de oro.</li>
</ol>3. Además de la Corona de polímero alrededor de las nanopartículas de oro
<ol><li>Durante el período de 15 min se describe en el paso 2.3, preparar la clavija soluciones disolviendo cada uno de los siguientes en 1 mL de agua en frascos de vidrio de 4 mL: 30 mg NH2-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH. Nota: Las concentraciones resultantes deben ser de 8,8 M NH2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH y 3.75 M COOH-PEG-SH.</li>
	<li>Después de reducir la velocidad de agitación de la solución en el matraz de fondo redondo de 100 rpm, agregar que las soluciones de PEG a la solución de THPC capped AuNPs gota a gota. Seguir revolviendo la mezcla suavemente durante la noche, a temperatura ambiente, para garantizar la eficiente remoción de THPC y la sustitución por PEG.</li>
	<li>Para la próxima 72 h, utilice una membrana de celulosa corte de peso molecular de 12-14 kDa para dializarse la mezcla agitada contra una cubeta de 4 L de agua agitado a 60 rpm. Atar los extremos de las membranas por los clips de la diálisis y la solución de transferencia a través de la pipeta. Nota: Este proceso de diálisis con la membrana corte de 12-14 kDa sólo elimina PEG, THPC y otros reactivos químicos, por la difusión a lo largo de un gradiente de concentración.</li>
	<li>Para mantener el alto gradiente de la concentración y promover la difusión continua, cambie el agua cada 2 h para las primeras 6 h y cada 6-12 h para los restantes 66 h. Nota: El propósito de este programa de cambio de agua debe adaptarse a la rápida difusión que ocurre desde el principio debido a la concentración inicialmente alta dentro de la muestra. El proceso de diálisis había descrito hojas la solución de nanopartículas semi purificada, ya que las nanopartículas, precipitados, agregados y otras impurezas de gran tamaño no pueden pasar a través de los poros de la membrana corte de 12-14 kDa.</li>
	<li>Filtrar la solución parcialmente purificada de la nanopartícula en un tubo cónico de 50mL usando un filtro de jeringa de 0,2 μm para eliminar los precipitados restantes, agregados y otras impurezas de gran tamaño.</li>
	<li>Coloque el tubo cónico en un congelador de-80 ° C y deje que la solución purificada de PEGylated AuNP (PEG-AuNP) congelar por cerca de 5 horas.</li>
	<li>Utilice una secador de congelación para liofilizar el PEG-AuNP purificado.</li>
	<li>Almacenar el PEG-AuNP seco, purificado a 4 ° C hasta su uso.</li>
</ol>4. conjugar fluoróforos con éster N-hydroxysuccinimide (NHS) en el NH2 grupos en el PEG-AuNP
<ol><li>Sujetar un matraz de fondo redondo de 50 mL el centro de una placa de agitación magnética. Llene el frasco con 18 mL de agua y revolver el agua a 100 rpm con una barra de agitación magnética en forma de huevo.</li>
	<li>Pesar 2 mg del PEG-AuNP liofilizado en un tubo cónico de 4 mL, utilizando una escala de trabajo de alta precisión. Use una pistola antiestática para eliminar la carga estática y aferramiento de la AuNP PEG polvo a la superficie del tubo. Añadir 2 mL de agua al tubo. Verter lo 2 mL de solución de PEG-AuNP al matraz de fondo redondo para la reconstitución de un total de 20 mL de agua. Seguir revolviendo la mezcla a 100 rpm con una barra de agitación magnética en forma de huevo.</li>
	<li>Añadir 1 mL de 0.1 M, pH 8,8 carbonato tampón a los 20 mL del AuNP reconstituido contenido en el matraz de fondo redondo. Continuar revolviendo.</li>
	<li>Añadir 5 μl de éster de NHS fluorescente de 10 mg/mL en dimetilsulfóxido. Nota: Puede utilizarse cualquier colorante fluorescente en este proceso. Remover la clavija fluorescente durante la noche. Mantener a temperatura ambiente y cubierta en papel de aluminio.</li>
	<li>Para la próxima 72 h, quitar exceso fluoróforos utilizando el protocolo descrito en el paso 3.3. Brevemente, dializan la mezcla agitada con una cubeta de 4 L de agua y una membrana de celulosa corte de peso molecular de 12-14 kDa. Cambie el agua cada 2 h durante las primeras 6 h y cada 6-12 h para los restantes 66 h.</li>
	<li>Obtener 1 mL de la solución de PEG-AuNP fluorescente purificada, que se utilizará para la caracterización que se describe a continuación en la sección 5. Congelar y liofilizar la solución restante para obtener nanopartículas fluorescentes en polvo para el almacenamiento a 4 ° C, como se describe en pasos 3.5-3.7.</li>
	<li>Utilice un filtro de jeringa de 0,2 μm para esterilizar y eliminar cualquier potencial precipita una vez reconstituida para aplicaciones de la cultura de célula.</li>
</ol>5. Caracterización de nanopartículas de oro pegilado fluorescente
<ol><li>Utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM) para visualizar la base de nanopartículas de oro y cuantificar el tamaño<ol>
<li>Coloque 10 μl de la solución de PEG-AuNP fluorescente purificada en una cuadrícula TEM de mallas recubiertas de carbón.</li>
		<li>Después de 5 min, use un pedazo de papel de filtro para mecha cuidadosamente lejos exceso de líquido desde el borde de la rejilla TEM hasta una película que contiene el fluorescente que PEG AuNPs se quede atrás.</li>
		<li>Ve el PEG-AuNPs fluorescente 80 kV y a un aumento de 50.000-150.000. Tomar fotos digitales. Nota: Sólo la base del oro será visible porque el PEG no es electrón denso en el TEM.</li>
		<li>Mediante un software de medición, establecer la escala de medición en correlación a la barra de escala. Calcular los diámetros de aproximadamente 20 corazones de oro y luego determinar el diámetro promedio base oro. Nota: El sistema de proyección de imagen de TEM coloca automáticamente una barra de escala en las imágenes digitales.</li>
	</ol></li>
	<li>Medición de tamaño de nanopartícula hidrodinámico con dispersión ligera dinámica (DLS)<ol>
<li>Transferencia de 1 mg de liofilizado AuNPs THPC revestido en un tubo de microcentrífuga utilizando el enfoque descrito en el paso 4.2. Transferencia de 1 mg de liofilizado PEG-AuNP en un tubo separado. Añadir 1 mL de agua a cada tubo y transferir cada solución AuNP a un 1 mL de plástico transparente.</li>
		<li>Colocar una cubeta en un instrumento DLS y medir diámetros hidrodinámicos esféricos utilizando el software de analizador de partículas integrado en el sistema DLS.</li>
		<li>Trazar los diámetros hidrodinámicos medidos utilizando un formato de histograma. Nota: El histograma será grupo de nanopartículas de tamaño. El grupo más grande de las nanopartículas clarificará el diámetro que mejor describa el tamaño de las AuNPs sintetizados en el presente Protocolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmación de fluorescencia fluorométrico Nota: La misma muestra y cubeta de paso 5.2 pueden utilizarse para medir la señal fluorescente.<ol>
<li>Sacar la cubeta de la DLS e inserte en un spectrofluorometer. Conjunto de señales de la longitud de onda de excitación a 633 nm y leer la fluorescencia emitida a lo largo de una longitud de onda de 650-800 nm.</li>
		<li>Confirmar que el pico es aproximadamente 665 nm, que se corresponde con el pico de emisión para el NHS. Nota: Ajuste las longitudes de onda de excitación y emisión según el fluoróforo utilizado en el proceso.</li>
	</ol></li>
	<li>MTS11 para evaluar la biocompatibilidad del análisis<ol>
<li>En un cultivo estériles para tejidos claros de 96 pocillos fondo trata de la placa, Pipetee 100 μl de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM; suplementado con 10% fetal bovino suero y 1% de penicilina/estreptomicina) y 3.2 x 103 células en cada pozo. Nota: En este estudio, se utilizan células endoteliales de la almohadilla de grasa de rata. Un total de 21 pozos se utilizan para permitir 3 repeticiones para cada una de las 7 concentraciones diferentes nanopartículas (ver paso 5.4.3 para concentraciones específicas de interés).</li>
		<li>Permitir a las células crecer a confluencia en humedad y 5% CO2 controlada incubadoras en 37 ° C11.</li>
		<li>Preparar los tubos de microcentrífuga individuales, cada una con 300 μL de DMEM con nanopartículas de diferentes concentraciones. Este estudio requiere 7 diferentes tubos de DMEM con las siguientes concentraciones de PEG-AuNP: 0 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL y 1.000 μg/mL.</li>
		<li>Aspire el DMEM del tubo. Llenar los pozos por triplicado con 100 μl de medio DMEM con 0, 10, 50, 100, 250, 500 o 1.000 μg/mL del AuNP.</li>
		<li>Permitir que las células y nanopartículas de co incubar durante un período determinado de tiempo, aquí durante 16 horas.</li>
		<li>Cerca del final de la incubación, descongelar la mezcla MTS/PES de paso 1.5.</li>
		<li>Después de la incubación, aspirar el DMEM y las nanopartículas suspendidas, vagamente conectadas de los pozos. Añada 100 μl de DMEM fresco junto con 20 μl de solución de MTS/PES para obtener 1:5 MTS/PES relación DMEM según protocolo del fabricante. Incubar las células con PES/MTS a 37 ° C por 2 h. Nota: Este tiempo de incubación de 2 h está determinada por la actividad metabólica de las células endoteliales y puede aumentarse hasta 4 h para otros tipos de células. Dentro del período de 2 h, el MTS es metabolizado por las células endoteliales a formazan coloreado que se mezcla con el DMEM. Biocompatibilidad de los PEG-AuNP y la probabilidad de la viabilidad celular se demostrará con precipitado coloreado. Toxicidad de la PEG-AuNP y la posibilidad de que las células mueren se mostrará de color menos intenso.</li>
		<li>Realizar el análisis colorimétrico de cada pozo mediante la lectura de absorbancia a 492 nm con un lector de placas compatibles.</li>
		<li>Para cada concentración de nanopartículas, calcular la absorbancia promedio de los valores de absorbancia por triplicado. Divida la absorbancia promedio por el valor obtenido del promedio de la absorbancia en los pozos que contienen nanopartículas μg/mL 0. Nota: Estos pozos que no contienen AuNPs sirven como controles para el cálculo de porcentaje viabilidad celular en respuesta al tratamiento de nanopartículas en otros pozos.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluación de la microscopia confocal de la fluorescencia de la absorción de nanopartículas en las células endoteliales adherentes con glicocálix intacto o disfuncional11<ol>
<li>Semillas 1.0 x 104 células/cm2 rata grasa células endoteliales sobre cubreobjetos de vidrio de 12 mm estéril del cojín y alimentar las células con DMEM suplementado con 10% fetal bovino suero y 1% de penicilina/estreptomicina. Permitir a las células crecer en plena confluencia en humedad y CO2 controlada incubadoras a 37 ° C, durante aproximadamente 3 días.</li>
		<li>Añadir tratamientos para modificar el Glicocálix, si corresponde. Por ejemplo, 2 h tratamiento de las células endoteliales cultivadas con 2.5 x 10-6 IU heparinase enzima III degrada el glicocálix por unirse específicamente su componente sulfato de heparán. Nota: Se puede modelar glicocálix saludable por crecimiento de las células endoteliales como se describe en el paso 5.5.1 sin la adición de enzimas de degradación.</li>
		<li>Con el glicocálix endotelial deja intacto o vuelto disfuncional, incubar las células endoteliales con fluorescente AuNPs en 550 μg/mL durante 16 horas o en otro momento deseado.</li>
		<li>Lave suavemente las células con 2 mL de albúmina sérica bovina de 37 ° C de 1% en tampón fosfato salino (PBS, que contiene 100 mg/L calcio y magnesio de 100 mg/L). Sumergir las células en 2 mL de paraformaldehído al 2% y 0.1% de glutaraldehído en PBS y permitir a las células reparar por 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retirar la solución de fijación de aldehído y lavan las células con PBS de temperatura para los tres ciclos de 5 minutos.</li>
		<li>Antes de la aplicación del anticuerpo primario, exponer a las células endoteliales al suero de cabra 2% en PBS por 30 min a temperatura ambiente para bloquear sitios de Unión inespecífica. Las células deben estar completamente cubiertas por la solución de bloqueo.</li>
		<li>Incube las células endoteliales durante la noche con 1% anti-heparán sulfato primaria del anticuerpo en el suero de cabra 2% en PBS en 4 ° C para el componente de sulfato de heparán de la glicocálix de la etiqueta. Asegúrese de que las células fijas son completamente en contacto con la solución de anticuerpo.</li>
		<li>Al día siguiente, lavar el anticuerpo con temperatura PBS para los tres ciclos de 10 minutos.</li>
		<li>Incube las células endoteliales con 1:1,000 dilución del anticuerpo secundario fluorescente apropiado durante 30 min a temperatura ambiente, en el oscuro o cubierto con papel de aluminio.</li>
		<li>Lavar el anticuerpo secundario con temperatura PBS para los tres ciclos de 10 minutos.</li>
		<li>Coloque el cubreobjetos en portaobjetos de microscopio usando un medio de montaje anti-fade que contiene 4', 6-diamidino-2-phenylindole, diclorhidrato (DAPI) para la tinción de núcleos. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas.</li>
		<li>Imagen de la célula endotelial immunostained fluorescente muestras con microscopía confocal, utilizando canales azul, verdes y rojos ahora para visualizar los núcleos, heparán sulfato glicocálix y las nanopartículas, respectivamente.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+magnetic+nanoparticles+for+targeted+drug+delivery+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Esta técnica es un método eficaz para sintetizar personalizable, que PEG pequeño revestido AuNPs. Una parte importante de este procedimiento es que la formación inicial de THPC tope oro nanopartículas, que pueden confirmarse por el cambio de color de amarillo a marrón se producirán después de HAuCl4 ha sido añadido a los contenidos en el matraz de fondo redondo (paso 2.3 del Protocolo). No hay cambio de color indica que hay no hay nanopartículas formadas y que las medidas iniciales comprueba y repite antes de proceder. En el caso que el color cambia a algo que no sea marrón como vino rojo o gris, las partículas resultantes no será probablemente alrededor del objetivo 2.5 nanómetro y un nuevo lote debe hacerse así.
Después de la formación de la base del oro, el intercambio de THPC PEG y los procedimientos de purificación contienen varios pasos claves para completar con éxito el protocolo. Mezcla durante la noche permite a ir a completar la reacción de reemplazo. Purificación podría ocurrir si el agua de diálisis no se cambia con la frecuencia prescrita. Agregación y precipitación de las partículas también pueden ocurrir si las partículas quedan en diálisis por más de 72 h. Otros posibles problemas se pudieran observar durante la liofilización. Si la clavija pequeño revestido AuNP solución no fue completamente congelada o el liofilizador no fue configurado correctamente, pueden perderse las muestras. Consulte el manual del liofilizador, como algunos equipos pueden requerir preparaciones diferentes de la muestra.
La facilidad de síntesis y la biocompatibilidad de las partículas resultantes representan ventajas para el uso de las AuNPs PEG. Además, estas nanopartículas tienen la ventaja de ser capaz de interactuar con las estructuras celulares a nanoescala, como lo demuestra la capacidad para identificar glicocálix degradado por la absorción de estas nanopartículas. Esta ventaja se puede aprovechar para el desarrollo de nuevas terapias de ateroesclerosis y las medidas preventivas. Más allá de lo que presentamos aquí, otra ventaja de este protocolo es que permite la personalización de las partículas, así como mayor estabilidad y capacidad de almacenamiento conectando tiol que contiene PEG a las nanopartículas de oro4. El otro extremo de la cadena de PEG puede contener cualquier grupo funcional, y un sinnúmero de moléculas puede conjugado a esos grupos. En este protocolo, se unen los tres grupos funcionales comunes (metilo, carboxilo y aminoacidos). El cociente de la clavija es elegido priorizar detección fluorescente en primer lugar, la capacidad de incorporar una molécula dirigida a secundaria mediante el grupo de ácido carboxílico. Las proporciones de estos grupos pueden ser ajustadas basados en la aplicación, y las longitudes y formas de los polímeros pueden ajustarse así.
Para medir la absorción de partículas, conjuga una sonda fluorescente a uno de los grupos funcionales. Cabe señalar que cualquier verbal más allá de lo que hemos descrito se traducirá en un cambio de propiedades de superficie de la nanopartícula. Cada iteración de las nanopartículas con respecto a los componentes adicionales y las reacciones de conjugación debe ser probado para las propiedades deseadas.
Este método produce nanopartículas de oro pequeño previstas superar las propiedades defensivas del glicocálix extracelular endotelial, que impide la absorción de nanopartículas de tamaños convencional. Sin embargo, el tamaño pequeño se presta a dificultad en la proyección de imagen y el aspecto del cargamento de droga. Estas partículas son significativamente menores que el rango de tamaño de nanopartículas típicas, y como resultado se disminuye grandemente la superficie disponible para los accesorios de la terapia y dirigidos a grupos. Esto puede conducir a dificultad para recoger señales individuales en proyección de imagen las aplicaciones, aunque grupos de partículas todavía pueden ser fácilmente identificados, como se muestra en las imágenes confocales. La superficie reducida para los accesorios de apuntar ligandos y terapéutica puede requerir más partículas debe administrar para lograr los requisitos de dosis objetivo. Sin embargo, las partículas más pequeñas será más eficientes en la entrega al considerar el glicocálix.
Estas nuevas partículas pequeño son capaces de entrega en la difícil llegar a nanoescala áreas dentro del cuerpo con una interrupción mínima del microambiente. La incorporación de la PEG permite mayor biocompatibilidad y ofrece grupos funcionales para el arreglo para requisitos particulares pesado de las partículas para diversas aplicaciones. El tamaño más pequeño en comparación con nanopartículas típico viene con algunas deficiencias, pero si desarrolla estratégicamente, la partícula pequeño es un enfoque prometedor para alojamiento de los difíciles de penetrar, intrincada y frágil glicocálix en vascular entrega orientación y drogas.

Nanopartículas se han aplicado a la administración de fármacos y la proyección de imagen por su capacidad para navegar a través del cuerpo para llegar a zonas de interés1,2. Las partículas pueden acumular dentro de tumores a través de la vasculatura con fugas o localizar donde un ligando de destino es overexpressed y expuesto. Oro, específicamente, se ha convertido en un material comúnmente usado nanopartículas debido a sus propiedades químicas y físicas únicas que afectan el transporte y liberación de terapéutica3. El oro es un material eficaz de nanopartículas ya que su superficie puede ser modificada para enlazar a tioles y tiene alta biocompatibilidad debido a su baja toxicidad4. AuNPs son capaces de ser portadores de fármacos biomoleculares grande y han tenido éxito en la entrega de péptidos, ácidos nucleicos y proteínas, permitiendo AuNPs favorable para apuntar al blanco2,4.
Por desgracia, efectividad de entrega de drogas de nanopartículas ha sido obstaculizado por el glicocálix cargado negativamente, que es la capa extracelular de la membrana de las células mamíferas más y cuenta con tamaños de poro de hasta 7 nm5,6. Este tamaño de poro es más pequeño que la mayoría portadores de drogas de nanopartículas, que tienen diámetros típicos oscilan entre 50 y 200 nm. En condiciones de enfermedad, estos poros de glicocálix ser más grandes debido a la degradación, aumentando la permeabilidad a través de las células endoteliales. Sin embargo, las nanopartículas más todavía son demasiado grandes para tomar ventaja de este cambio estructural en el glicocálix. Una de las implicaciones de este desajuste de tamaño es que convencionalmente tamaño de las partículas no interactúan favorablemente con las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos. Esto afecta la entrega de partículas por vía intravenosa administradas en el endotelio y puede decirse también del transporte de partículas a través de la sangre cerebral barrera7,8,9,10.
Una estrategia para combatir este problema es utilizar partículas más pequeñas para pasar a través de los poros pequeños en el glicocálix. Aquí sintetizamos un 10,5 nm pequeño oro nanopartículas, que normalmente deben ser disuadido por glicocálix intacto, saludable. Una vez que el glicocálix comienza a deteriorarse, la nanopartícula debe penetrar fácilmente las células por el aumento de tamaño del poro. El protocolo en este trabajo detalla una síntesis de alma de oro pequeño con PEG, que aumenta la biocompatibilidad y reduce el espacio sistémico4. El PEG también puede contener varios tipos de grupos funcionales, abriendo vías para la conjugación de dirigidos a ligandos, fluoróforos y terapéutica. Previamente los resultados publicados indican que estas nanopartículas pequeño tienden a tomarse más favorable en las regiones de glicocálix endoteliales alteración función incluso sin cualquier activo dirigidas a4,11. Esto indica la viabilidad y la importancia de utilizar partículas de tamaño adecuado para aplicaciones de entrega. El siguiente protocolo presenta la síntesis, purificación y la caracterización de las AuNPs revestido de PEG (PEG-AuNP), con la discusión para la confección de los grupos funcionales y verbos para otras aplicaciones.

<table><tbody><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Oro (III) Cloruro trihidrato (HAuCl4.3H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis (hidroximetil) cloruro de fosfnio</td><td>Sigma Aldrich 404861</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPEG-tiol monofuncional</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td>Mw: 2,000 Da</td></tr><tr><td>hetero bi-funcional anime-PEG-thiol</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>NH2-PEG-SH-3400-1g</td><td>Mw: 3.400 Da</td></tr><tr><td>Carboximetil-PEG-tiol</td><td>Layson Bio Inc.</td><td>CM-PEG-SH-2000-1g</td><td>Mw: 2.000 Da Membrana</td></tr> de <tr><td>diálisis de celulosa (12-14 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9777</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat instrumento antiestático</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z108812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647) éster succinimidilo de ácido carboxílico</td><td>Fisher</td><td>A20006</td><td>Fluoróforo</td></tr><tr><td>Fisherbrand Círculos de papel de filtro normal de grado cualitativo - grado P5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-801-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía electrónica de transmisión</td><td>JEOL USA</td><td>JEOL JEM-1000</td><td>TEM</td></tr><tr><td>Dispersión dinámica de luz</td><td>Brookhaven Instruments Corporation</td><td>Brookhaven 90 Plus Analizador de tamaño de partícula</td><td>DLS</td></tr><tr><td>Fluorímetro</td><td>Horiba Scientific</td><td>Jobin Yvon Fluromax 4</td><td></td></tr><tr><td>Fluorímetro CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>MTS Lector de</td></tr><tr><td>placas</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M4</td><td>Lector de placas</td></tr><tr><td>10E4 epítopo HS anticuerpo IgM monoclonal de ratón (anticuerpo primario)</td><td>Amsbio</td><td>370255</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG (anticuerpo secundario)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37120</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Medio de montaje VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>con</td></tr><tr><td>microscopio confocal</td> DAPI Carl <td>Zeiss Meditex AG</td><td>Zeiss LSM 700</td><td>Microscopía Confocol</td></tr></tbody></table>

síntesis de funcionalizados 10 nm recubierto de polímero partículas de oro para apuntar el endotelio y el suministro de medicamentos

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Nanopartículas de oro (AuNPs) se han utilizado extensivamente en la investigación médica debido a su tamaño, la biocompatibilidad y la superficie modificable. Entrega orientación y medicamentos específica son algunas de las aplicaciones de las AuNPs y absorción de partículas endotelial extracelular matrices propiedades defensivas del cesto. Para solucionar este problema, se describe un método de síntesis de nanopartículas de oro pequeño mejorar suministro vascular, con grupos funcionales adaptables y longitudes de polímero para realizar ajustes adicionales. El protocolo rendimientos de 2.5 nm AuNPs que están capped con cloruro de tetrakis (hidroximetil) fosfonio (THPC). La sustitución de THPC con hetero-funcional polietilenglicol (PEG) en la superficie de la AuNP aumenta el radio hidrodinámico a 10.5 nm mientras que proporciona varios grupos funcionales en la superficie. La última parte del protocolo incluye una adición opcional de un fluoróforo para permitir las AuNPs para visualizarse bajo fluorescencia a la absorción de nanopartículas. Diálisis y liofilización fueron utilizados para purificar y aislar las AuNPs. Estas nanopartículas fluorescentes pueden ser visualizadas en experimentos tanto in vitro como in vivo debido a la biocompatible sondas PEG capa y fluorescente. Además, la gama de tamaño de estas nanopartículas hacen un candidato ideal para sondear el glicocálix sin interrumpir la función normal de la vasculatura, que puede llevar a la mayor entrega y terapéutica.

Las AuNPs sintetizada, cubierto con THPC o PEG (figura 1A y figura 1B, respectivamente), son imágenes con TEM y las partículas de tamaños se miden usando el TEM y DLS para asegurar la distribución de tamaño de nanopartícula adecuada. La figura 2 muestra la imagen TEM de una muestra de THPC AuNP 80 kV y 150.000 aumentos. Los diámetros de la AuNP THPC partículas entre 2-3 nm, basado en la barra de calibración en imágenes TEM. También es evidente en este tamaño de THPC AuNP DLS tamaño medida histograma se muestra en la figura 2, en que cubrió el THPC AuNP es demostrado para tener un pico a 2,5 nm. La pegilación no es visible bajo TEM como los polímeros no son electrón denso. Proyección de imagen de TEM de PEG-AuNP muestras simplemente confirma la presencia de partículas dispersas individuales, que se espera porque la corona de polímeros de PEG en las nanopartículas de ayuda en la prevención de la agregación. Para estas muestras PEG-AuNP, el histograma de medición DLS tamaño muestra un cambio en el pico, a aproximadamente 10,5 nm en la DLS. Accesorios de otros ligandos o drogas sobre grupos funcionales afectarán el tamaño de la nanopartícula, así y deben tenerse en cuenta al medir el diámetro.
La adición del fluoróforo (figura 1) se confirma mediante el uso de un Fluorímetro para medir señal de fluorescencia de una muestra de nanopartículas, como se muestra en la figura 3. Cuando excitó con una longitud de onda de 633 nm, la emisión se mide para un máximo entre 672 y 660 nm, que coincide con la información del fabricante producto de emisión máxima a 665 nm. Accesorio de otras sondas fluorescentes debe medirse de una manera similar para asegurar una respuesta fluorescente.
La biocompatibilidad de las partículas y la viabilidad celular relacionados son evaluados usando el ensayo MTS para determinar metabolismo celular relativo de MTS después de 16 h de incubación con diferentes concentraciones de las nanopartículas. El fluoróforo conjugada PEGylated AuNPs no muestra ninguna toxicidad significativa, según lo indicado por los niveles similares de la viabilidad celular en todas las concentraciones de hasta 1 mg/mL (Figura 4A). Esta biocompatibilidad puede cambiar dependiendo de la terapéutica o el ligando unido a los restantes grupos funcionales para personalizar aún más las partículas. Accesorios de drogas tienden a aumentar la toxicidad, pero dependiendo de las concentraciones de trabajo, no puede afectar la viabilidad de una manera significativa.
Absorción de fluorescente, PEGylated AuNPs (figura 1) por las células adherentes se evalúa con las células endoteliales de la almohadilla de grasa de rata cultivadas de glicocálix intacto o disfuncional (Figura 4B). Las condiciones de glicocálix disfuncional se logran agregando enzima de heparinase III a la cultura, dando por resultado una degradación del componente de glicocálix de heparan sulfato y comprometer la matriz12. Figura 4B se muestra los diferentes niveles de absorción de AuNPs de PEG, como puntos rojos en la vista transversal de las células endoteliales representante. Un glicocálix saludable impide la absorción de las nanopartículas de oro, pero se observa un incremento sustancial cuando la enzima es trabajador por cuenta ajena11. Este resultado pone de relieve el potencial de estas nanopartículas ultrapequeño para ofrecer terapéutica a las células endoteliales de forma controlada por distintas interacciones que se basan en la salud de glicocálix.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig1.jpg"> Figura 1: esquemas de nanopartículas de oro. (A) THPC revestido AuNP nanosphere antes del reemplazo de PEG. (B) PEGylated AuNP con 3 tipos de terminaciones de PEG, incluyendo COOH, NH2y CH3. Ondas azules representan el polímero. (C) conjugados a nanopartículas para imágenes de fluorescencia. Estrellas rojas muestran los fluoróforos conjugados a grupos funcionales de NH2 . <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig2.jpg"> Figura 2: tamaño medidas de nanopartículas de oro. Izquierda: TEM de nanopartículas de oro antes de la adición de PEG a 80 kV y 150.000 aumentos con la barra de escala se muestra. Derecha: Histograma nanopartículas del tamaño de la medida por DLS antes (AuNP) y después del reemplazo (PEG-AuNP) el THPC con PEG. Los resultados DLS para AuNP recubiertas THPC cuantifican lo que se visualiza por TEM. Los resultados de la AuNP revestido DLS PEG superan el reto de la incapacidad para visualizar PEG por TEM debido a los polímeros no ser electrón denso. Un TEM de PEG-AuNP mostrará sólo las nanopartículas de oro de base y el mismo se verá como un tapón de THPC AuNP. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig3.jpg"> Figura 3: datos de fluorescencia del PEG-AuNP fluorescente. El pico de fluorescencia en 667 partidos de nm, la emisión del fluoróforo conjugada con PEG-AuNP. A.U.: unidades arbitrarias.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig4.jpg"> Figura 4: interacciones con el PEG-AuNP fluorescente de la célula. (A) parcela de viabilidad (metabolismo MTS) de la célula grasa de rata cojín de células endoteliales después de 16 h de incubación conjunta con PEG-AuNP fluorescente. (B) Confocal imágenes seccionadas transversalmente de la grasa de rata fija cojín de células endoteliales teñidas con DAPI para el núcleo (azul) y anticuerpos contra heparán sulfato, un componente de glicocálix (verde). Imagen de arriba es un glicocálix saludable y parte inferior es una capa de glicocálix degradados; hay significativamente más fluorescencia roja de las nanopartículas en la muestra con glicocálix degradado. Barra de escala es 10 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se describe un método de sintetizar biocompatibles nanopartículas de oro de 10 nm, funcionalizadas por glicol de polietileno capa sobre la superficie. Estas partículas pueden ser usados en vitro y en vivo para brindar terapias a nanoescala espacios celulares y extracelulares son difícil acceso con tamaños de nanopartículas convencional.

Síntesis de funcionalizados 10 nm recubierto de polímero partículas de oro para apuntar el endotelio y el suministro de medicamentos

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanoesferas de oro funcionalizadas recubiertas de polímeros que tengan 10 nanómetros de diámetro, sean biocompatibles, tengan un tiempo de circulación prolongado y puedan obtenerse imágenes con microscopía de fluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cardiología sobre la permeabilidad del endotelio en condiciones enfermas. La principal ventaja de esta técnica es que crea partículas ultra pequeñas biocompatibles que tienen grupos funcionales disponibles para una mayor personalización.Primero, en un tubo de microcentrífuga, diluya 12 microlitros de 80% de THPC con un mililitro de agua ultrapura. Sujete un matraz de fondo redondo de 100 mililitros sobre una placa de agitación magnética. Agregue al matraz 45 mililitros de agua y una barra pequeña para remover en forma de huevo.Comience a remover el agua a 300 RPM. Añadir al matraz 0,5 mililitros de una solución de hidróxido de sodio de un molar y un mililitro de la solución diluida de THPC. Continúe revolviendo vigorosamente la mezcla de reacción durante cinco minutos.Luego, agregue dos mililitros de una solución de ácido cloroáurico de 25 milimolares a la mezcla de reacción mientras revuelve. Confirme que la mezcla de reacción amarilla se vuelve marrón oscuro en segundos, lo que indica la formación de nanopartículas de oro cargadas negativamente y cubiertas de THPC. Continúa revolviendo la mezcla durante 15 minutos.Mientras se agita la mezcla, prepare una solución acuosa de tiol PEG de amina heterobifuncional, tiol carboximetilPEG y tiol metoxi PEG monofuncional. Una vez que la mezcla de reacción de nanopartículas de oro se haya agitado durante 15 minutos, reduzca la velocidad de agitación a 100 RPM. Agregue las soluciones de PEG gota a gota a la mezcla mientras revuelve.Continúe revolviendo suavemente la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Luego, cierre un extremo de una membrana de celulosa MWCO de 12-14 kilodalton con un clip de diálisis. Utilice una pipeta para transferir la mezcla de reacción a la membrana.Cierre el otro extremo de la membrana con una segunda pinza de diálisis. Diálisar la mezcla de nanopartículas contra cuatro litros de agua agitada a 60 RPM durante 72 horas. Cambie el agua cada dos horas durante las primeras seis horas, y cada seis a 12 horas a partir de entonces.A continuación, filtre la mezcla de nanopartículas de oro pegilado semipurificado a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros, en un tubo cónico de 50 mililitros. Congele la solución de nanopartículas purificada a menos 80 grados Celsius durante unas cinco horas. Liofilizar las nanopartículas purificadas con un liofilizador.Para comenzar a preparar las nanopartículas fluorescentes de oro pegilado, sujete un matraz de fondo redondo de 100 mililitros sobre una placa de agitación magnética. Agregue 18 mililitros de agua ultrapura y una pequeña barra de agitación en forma de huevo al matraz y comience a revolver a 100 RPM. En un tubo cónico de cuatro mililitros, combine dos miligramos de nanopartículas de oro pegilado liofilizado con dos mililitros de agua.A continuación, transfiera la solución de nanopartículas al matraz de fondo redondo para su posterior reconstitución. Agregue un mililitro de un tampón de carbonato molar de pH 8.8 y 0.1 molar a las nanopartículas reconstituidas mientras agita. Luego, agregue cinco microlitros de una solución de 10 miligramos por mililitro de un éster fluorescente de anhidroxisuccinimida en dimetilsulfóxido.Envuelva el matraz en papel de aluminio para excluir completamente la luz. Continúe agitando la mezcla de nanopartículas fluorescentes durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, dializar la mezcla contra cuatro litros de agua durante 72 horas utilizando el procedimiento descrito en la preparación de las nanopartículas de oro pegiladas.Mantenga el recipiente cubierto con papel de aluminio durante toda la diálisis. Reserve un mililitro de las nanopartículas pegiladas fluorescentes purificadas para la caracterización. Congelar, liofilizar y almacenar las nanopartículas fluorescentes restantes a cuatro grados centígrados.Para visualizar el núcleo de nanopartículas de oro con microscopía electrónica de transmisión, primero coloque 10 microlitros de la solución de nanopartículas fluorescentes purificadas en una rejilla TEM de malla recubierta de carbono. Deje reposar la gota durante cinco minutos. Luego, use papel de filtro para absorber cuidadosamente el exceso de líquido del borde de la rejilla TEM, hasta que solo quede una película de las nanopartículas fluorescentes en la rejilla.Imagine las nanopartículas a 80 kilovoltios, con un aumento de 50.000 a 150.000. Para medir el tamaño de las nanopartículas hidrodinámicas, coloque un miligramo de nanopartículas de oro liofilizadas recubiertas de THPC en un tubo de microcentrífuga. Agregue un mililitro de agua a cada tubo y transfiera las soluciones a cubetas de plástico transparente de un mililitro.Evalúe cada solución con dispersión dinámica de la luz y mida los diámetros hidrodinámicos esféricos de las partículas. A continuación, transfiera la cubeta que contiene las nanopartículas de oro pegilado fluorescente a un espectrofluorómetro. Establezca la longitud de onda de exotación en 633 nanómetros y lea las señales de emisión de 650 a 800 nanómetros.A continuación, para evaluar la biocompatibilidad a concentraciones de 7 nanopartículas, primero pipetee 100 microlitros de una suspensión de células endoteliales de almohadilla de grasa de rata en DMEM en cada uno de los 21 pocillos de una placa tratada con cultivo de tejido estéril de fondo claro de 96 pocillos. Incubar las células hasta lograr la confluencia, luego, obtener siete soluciones de nanopartículas fluorescentes en DMEM con concentraciones que van de cero a 1000 microgramos por mililitro. Aspire el DMEM de los pozos.Coloque 100 microlitros de cada una de las siete soluciones de nanopartículas en cada uno de los pocillos separados por triplicado. Deje que las células y las nanopartículas coincuben durante 16 horas. A continuación, aspire el DMEM y las nanopartículas suspendidas o adheridas sin apretar de los pocillos.Agregue 100 microlitros de DMEM fresco que contenga 20 microlitros de una solución MTS/PES a cada pocillo. Incubar las células a 37 grados centígrados durante dos horas. A continuación, evalúe la viabilidad de las células mediante análisis clorométrico a 492 nanómetros con el lector de placas.A continuación, las células endoteliales de la almohadilla de grasa de rata de semilla en una cubierta de vidrio estéril de 12 mililitros se deslizan a 10.000 células por centímetro cuadrado. Alimente las células con DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de estreptomicina de penicilina. Incubar las células hasta lograr la confluencia completa.Modifique el glicocálix endotelial si lo desea, luego, incube las células con 550 microgramos por mililitro de nanopartículas de oro fluorescente durante 16 horas. Preparar las células para la microscopía de inmunofluorescencia. Monte cada cubreobjetos en un portaobjetos de microscopio con medio de montaje antidecoloración que contenga DAPI.Selle los bordes deslizantes de la cubierta con esmalte de uñas. Obtención de imágenes de las células endoteliales inmunoteñidas con microscopía confocal. Visualice los núcleos, el glicocálix de sulfato de heparina y las nanopartículas con canales azul, verde y rojo lejano, respectivamente.TEM de nanopartículas de oro recubiertas de THPC, mostró diámetros de partícula de dos a tres nanómetros. La TEM de las nanopartículas pegiladas solo pudo confirmar la presencia de partículas dispersas, ya que el PEG no es visible en las imágenes TEM. El DLS de las nanopartículas recubiertas y pegiladas con THPC mostró un cambio en el diámetro máximo de las partículas de 2,5 nanómetros a 10,5 nanómetros.La emisión fluorescente tuvo un máximo entre 660 y 672 nanómetros cuando se excitó con luz de 633 nanómetros, lo que fue consistente con la emisión máxima esperada de 665 nanómetros para la sonda fluorescente utilizada. Las células endoteliales de la almohadilla de grasa de rata mostraron niveles similares de viabilidad después de 16 horas de co-incubación con nanopartículas fluorescentes de oro pegolado en concentraciones de hasta un miligramo por mililitro, lo que indica que no hay toxicidad significativa de las nanopartículas. Se observó una absorción mínima de nanopartículas en las células endoteliales de la almohadilla de grasa de rata con glicocálices sanos.Se produjo una absorción significativamente mayor en las células con glicocálices degradados, como lo demuestra el aumento de las señales fluorescentes rojas de las nanopartículas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar modificaciones adicionales, como la conjugación en los grupos funcionales abiertos, para modificar las partículas para la orientación específica de un componente del endotelio o la administración de un fármaco.

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