Síntesis de funcionalizados 10 nm recubierto de polímero partículas de oro para apuntar el endotelio y el suministro de medicamentos

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanoesferas de oro funcionalizadas recubiertas de polímeros que tengan 10 nanómetros de diámetro, sean biocompatibles, tengan un tiempo de circulación prolongado y puedan obtenerse imágenes con microscopía de fluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en cardiología sobre la permeabilidad del endotelio en condiciones enfermas. La principal ventaja de esta técnica es que crea partículas ultra pequeñas biocompatibles que tienen grupos funcionales disponibles para una mayor personalización.

Primero, en un tubo de microcentrífuga, diluya 12 microlitros de 80% de THPC con un mililitro de agua ultrapura. Sujete un matraz de fondo redondo de 100 mililitros sobre una placa de agitación magnética. Agregue al matraz 45 mililitros de agua y una barra pequeña para remover en forma de huevo.

Comience a remover el agua a 300 RPM. Añadir al matraz 0,5 mililitros de una solución de hidróxido de sodio de un molar y un mililitro de la solución diluida de THPC. Continúe revolviendo vigorosamente la mezcla de reacción durante cinco minutos.

Luego, agregue dos mililitros de una solución de ácido cloroáurico de 25 milimolares a la mezcla de reacción mientras revuelve. Confirme que la mezcla de reacción amarilla se vuelve marrón oscuro en segundos, lo que indica la formación de nanopartículas de oro cargadas negativamente y cubiertas de THPC. Continúa revolviendo la mezcla durante 15 minutos.

Mientras se agita la mezcla, prepare una solución acuosa de tiol PEG de amina heterobifuncional, tiol carboximetilPEG y tiol metoxi PEG monofuncional. Una vez que la mezcla de reacción de nanopartículas de oro se haya agitado durante 15 minutos, reduzca la velocidad de agitación a 100 RPM. Agregue las soluciones de PEG gota a gota a la mezcla mientras revuelve.

Continúe revolviendo suavemente la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Luego, cierre un extremo de una membrana de celulosa MWCO de 12-14 kilodalton con un clip de diálisis. Utilice una pipeta para transferir la mezcla de reacción a la membrana.

Cierre el otro extremo de la membrana con una segunda pinza de diálisis. Diálisar la mezcla de nanopartículas contra cuatro litros de agua agitada a 60 RPM durante 72 horas. Cambie el agua cada dos horas durante las primeras seis horas, y cada seis a 12 horas a partir de entonces.

A continuación, filtre la mezcla de nanopartículas de oro pegilado semipurificado a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros, en un tubo cónico de 50 mililitros. Congele la solución de nanopartículas purificada a menos 80 grados Celsius durante unas cinco horas. Liofilizar las nanopartículas purificadas con un liofilizador.

Para comenzar a preparar las nanopartículas fluorescentes de oro pegilado, sujete un matraz de fondo redondo de 100 mililitros sobre una placa de agitación magnética. Agregue 18 mililitros de agua ultrapura y una pequeña barra de agitación en forma de huevo al matraz y comience a revolver a 100 RPM. En un tubo cónico de cuatro mililitros, combine dos miligramos de nanopartículas de oro pegilado liofilizado con dos mililitros de agua.

A continuación, transfiera la solución de nanopartículas al matraz de fondo redondo para su posterior reconstitución. Agregue un mililitro de un tampón de carbonato molar de pH 8.8 y 0.1 molar a las nanopartículas reconstituidas mientras agita. Luego, agregue cinco microlitros de una solución de 10 miligramos por mililitro de un éster fluorescente de anhidroxisuccinimida en dimetilsulfóxido.

Envuelva el matraz en papel de aluminio para excluir completamente la luz. Continúe agitando la mezcla de nanopartículas fluorescentes durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, dializar la mezcla contra cuatro litros de agua durante 72 horas utilizando el procedimiento descrito en la preparación de las nanopartículas de oro pegiladas.

Mantenga el recipiente cubierto con papel de aluminio durante toda la diálisis. Reserve un mililitro de las nanopartículas pegiladas fluorescentes purificadas para la caracterización. Congelar, liofilizar y almacenar las nanopartículas fluorescentes restantes a cuatro grados centígrados.

Para visualizar el núcleo de nanopartículas de oro con microscopía electrónica de transmisión, primero coloque 10 microlitros de la solución de nanopartículas fluorescentes purificadas en una rejilla TEM de malla recubierta de carbono. Deje reposar la gota durante cinco minutos. Luego, use papel de filtro para absorber cuidadosamente el exceso de líquido del borde de la rejilla TEM, hasta que solo quede una película de las nanopartículas fluorescentes en la rejilla.

Imagine las nanopartículas a 80 kilovoltios, con un aumento de 50.000 a 150.000. Para medir el tamaño de las nanopartículas hidrodinámicas, coloque un miligramo de nanopartículas de oro liofilizadas recubiertas de THPC en un tubo de microcentrífuga. Agregue un mililitro de agua a cada tubo y transfiera las soluciones a cubetas de plástico transparente de un mililitro.

Evalúe cada solución con dispersión dinámica de la luz y mida los diámetros hidrodinámicos esféricos de las partículas. A continuación, transfiera la cubeta que contiene las nanopartículas de oro pegilado fluorescente a un espectrofluorómetro. Establezca la longitud de onda de exotación en 633 nanómetros y lea las señales de emisión de 650 a 800 nanómetros.

A continuación, para evaluar la biocompatibilidad a concentraciones de 7 nanopartículas, primero pipetee 100 microlitros de una suspensión de células endoteliales de almohadilla de grasa de rata en DMEM en cada uno de los 21 pocillos de una placa tratada con cultivo de tejido estéril de fondo claro de 96 pocillos. Incubar las células hasta lograr la confluencia, luego, obtener siete soluciones de nanopartículas fluorescentes en DMEM con concentraciones que van de cero a 1000 microgramos por mililitro. Aspire el DMEM de los pozos.

Coloque 100 microlitros de cada una de las siete soluciones de nanopartículas en cada uno de los pocillos separados por triplicado. Deje que las células y las nanopartículas coincuben durante 16 horas. A continuación, aspire el DMEM y las nanopartículas suspendidas o adheridas sin apretar de los pocillos.

Agregue 100 microlitros de DMEM fresco que contenga 20 microlitros de una solución MTS/PES a cada pocillo. Incubar las células a 37 grados centígrados durante dos horas. A continuación, evalúe la viabilidad de las células mediante análisis clorométrico a 492 nanómetros con el lector de placas.

A continuación, las células endoteliales de la almohadilla de grasa de rata de semilla en una cubierta de vidrio estéril de 12 mililitros se deslizan a 10.000 células por centímetro cuadrado. Alimente las células con DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de estreptomicina de penicilina. Incubar las células hasta lograr la confluencia completa.

Modifique el glicocálix endotelial si lo desea, luego, incube las células con 550 microgramos por mililitro de nanopartículas de oro fluorescente durante 16 horas. Preparar las células para la microscopía de inmunofluorescencia. Monte cada cubreobjetos en un portaobjetos de microscopio con medio de montaje antidecoloración que contenga DAPI.

Selle los bordes deslizantes de la cubierta con esmalte de uñas. Obtención de imágenes de las células endoteliales inmunoteñidas con microscopía confocal. Visualice los núcleos, el glicocálix de sulfato de heparina y las nanopartículas con canales azul, verde y rojo lejano, respectivamente.

TEM de nanopartículas de oro recubiertas de THPC, mostró diámetros de partícula de dos a tres nanómetros. La TEM de las nanopartículas pegiladas solo pudo confirmar la presencia de partículas dispersas, ya que el PEG no es visible en las imágenes TEM. El DLS de las nanopartículas recubiertas y pegiladas con THPC mostró un cambio en el diámetro máximo de las partículas de 2,5 nanómetros a 10,5 nanómetros.

La emisión fluorescente tuvo un máximo entre 660 y 672 nanómetros cuando se excitó con luz de 633 nanómetros, lo que fue consistente con la emisión máxima esperada de 665 nanómetros para la sonda fluorescente utilizada. Las células endoteliales de la almohadilla de grasa de rata mostraron niveles similares de viabilidad después de 16 horas de co-incubación con nanopartículas fluorescentes de oro pegolado en concentraciones de hasta un miligramo por mililitro, lo que indica que no hay toxicidad significativa de las nanopartículas. Se observó una absorción mínima de nanopartículas en las células endoteliales de la almohadilla de grasa de rata con glicocálices sanos.

Se produjo una absorción significativamente mayor en las células con glicocálices degradados, como lo demuestra el aumento de las señales fluorescentes rojas de las nanopartículas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar modificaciones adicionales, como la conjugación en los grupos funcionales abiertos, para modificar las partículas para la orientación específica de un componente del endotelio o la administración de un fármaco.