Name: Un ensayo de Blot punto cuantitativo para valoración de AAV y su uso para la evaluación funcional de la Asamblea del Virus Adeno-asociado-activar proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Aprende a realizar un ensayo de blot punto cuantitativo para valorar títulos de AAV purificados y no purificados. Este método sencillo y económico evalúa el papel de las proteínas AAP en la ensamblaje de cápsides de diferentes serotipos de virus adeno-asociado.

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Agradecemos a Xiao Xiao en la Universidad de North Carolina en Chapel Hill para facilitarnos el plásmido pEMBL-CMV-GFP. Agradecemos a Christopher Cheng y Samuel J. Huang para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de servicio de salud pública (NIH R01 NS088399 y T32 EY232113).

<ol><li>Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+assembly+factor+promotes+AAV2+capsid+formation+in+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).</li>
<li>Sonntag, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly-activating+protein+promotes+capsid+assembly+of+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes.</a> J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).</li>
<li>Naumer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+adeno-associated+virus+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein.</a> J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+in+the+adeno-associated+virus+serotype+2+assembly-activating+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein.</a> J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).</li>
<li>Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+computational+evolution-based+method+to+study+a+mode+of+co-evolution+of+overlapping+open+reading+frames+in+the+AAV2+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome.</a> PLoS One. 8 (6), e66211(2013).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+Virus+%28AAV%29+Assembly-Activating+Protein+Is+Not+an+Essential+Requirement+for+Capsid+Assembly+of+AAV+Serotypes+4%2C+5%2C+and+11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11.</a> J Virol. 91 (3), (2017).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+are+biologically+active+and+free+of+detectable+helper+and+wild-type+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.</a> Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).</li>
<li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+normal+integration+does+not+require+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression.</a> J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).</li>
<li>Wobus, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Fagone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+errors+in+quantitative+polymerase+chain+reaction+titration+of+self-complementary+adeno-associated+viral+vectors+and+improved+alternative+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).</li>
<li>Farkas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parvovirus+isolated+from+royal+python+%28Python+regius%29+is+a+member+of+the+genus+Dependovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).</li>
<li>NEB, <a target="_blank" href="http://www.neb-online.de/neuerkatalog/">2017-2018 Catalog & Technical Reference</a>. , New England Biolabs. 302-368 (2017).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Addgene. Bacterial Transformation. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/">https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/</a> (2017).</li>
<li>Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/">https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/</a> (2017).</li>
<li>Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf</a> (2017).</li>
<li>Burton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+factor+VIII+heavy+and+light+chain+adeno-associated+viral+vectors+produces+biologically+active+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).</li>
<li>Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+for+short+hairpin+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression.</a> Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).</li>
<li>Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+preparation+of+adeno-associated+viral+vectors+by+using+high+hydrostatic+pressure+to+selectively+inactivate+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus.</a> Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Comparison+and+Validation+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Methods+for+the+Quantitation+of+Adeno-Associated+Viral+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).</li>
<li>Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+nucleic+acid+sequence+homologies+and+relative+concentrations+by+a+dot+hybridization+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).</li>
<li>Reue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+quantitation+techniques%3A+considerations+for+experimental+design+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application.</a> J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).</li>
<li>Clementi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR+and+RT-PCR+in+virology%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR and RT-PCR in virology.</a> PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).</li>
<li>Mezzina, M., Merten, O. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21590399">Adeno-associated viruses.</a> Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).</li>
<li>Chen, W. J., Liao, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+bovine+pancreatic+deoxyribonuclease+I%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+Lett%22%5BJournal%5D)">Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I.</a> Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este informe se describe la utilidad de cuantitativa dot blot ensayos para estudiar AAPs de AAV y su papel en el ensamblaje de la cápside. Conocimiento obtenido de estos estudios puede proporcionar penetraciones detalladas en las diferencias innatas en el proceso de montaje de cápside AAV y el papel funcional de Fiscalizacion entre diferentes serotipos. En este sentido, el punto de Cruz-complementación de AAV VP3-AAP blot ensayo reveló que serpiente AAV VP3 muestra una dependencia estricta de la coexpresión de su cogn...

Virus adeno-asociado (AAV) es un pequeño, no envuelto, monocatenario DNA virus con un genoma de aproximadamente 4,7 kilobases (kb). El genoma AAV contiene marcos de lectura abierta (ORFs) para los genes rep y cap . En 2010, una proteína no estructural previamente no identificada codificada por una ORF de marco-cambiado de puesto + 1 dentro del gene de la tapa de AAV2 fue descubierta por Sonntag et al. y encontrada para desempeñar un papel decisivo en el conjunto de proteínas del monómero de la VP de la cápsida de AAV2 en un viral de la cápside1. Esta nueva proteína nombre proteína activadora de Asamblea (AAP) el papel que desempeña en la promoción de cápside de montaje1.
Los ORFs para AAP han sido identificado bioinformatically en el genoma del parvovirus todos dentro del género Dependoparvovirus, pero no dentro de los genomas de los virus de diferentes géneros de la parvovirus familia1,2. Estudios funcionales de esta nueva proteína se centraron inicialmente en la AAP del prototipo AAV2 (AAP2), que ha establecido el papel esencial de AAP2 en contra completamente desmontadas proteínas VP al nucleolo para su acumulación y la formación en montado cápsida1,3,4. La incapacidad de la cápsida de AAV2 para montar en la ausencia de expresión de la AAP ha sido independientemente confirmada por varios grupos, incluido el nuestro1,2,3,4,5 . Estudios posteriores en los serotipos 1, 8 y 9 de AAV corroboraban el papel crítico de Fiscalizacion en la Asamblea de la cápsida, como proteínas de monómero de VP3 de AAV1, 8, y 9 eran incapaces de formar una cápside completamente montada en la ausencia de coexpresión de AAP2.
Recientemente, a través de enfoques que incluyen el uso de cuantitativo dot blot ensayos, investigamos la capacidad de AAV1 12 monómeros VP3 de montar en la cápsida en la ausencia de expresión de la AAP y la capacidad de la AAP1 12 de promover el montaje de VP3 monómeros de serotipos heterólogos. Este estudio ha revelado que AAV4, 5 y 11 VP3 monómeros pueden montar sin AAP. Además, se encontró que ocho de los doce serotipos AAP examinamos (es decir, todos menos AAP4, 5, 11 y 12) muestran una capacidad amplia para apoyar el conjunto de cápside de cápsida de serotipo heterólogo AAV, mientras AAP4, 5, 11 y 12 muestran un substancialmente capacidad limitada en este sentido6. Estos cuatro serotipos son filogenéticamente distantes de los AAP serotipos2,3. Por otra parte, el estudio ha descubierto una heterogeneidad significativa en localizaciones subcelulares de AAPs diferentes6. Además, el estudio ha sugerido que la asociación estrecha de AAP con cápsida montado y el nucleolo, el sello de la Asamblea de capsid AAV2, necesariamente no puede extenderse a otros serotipos incluyendo AAV5, 8 y 9, que mostrar la exclusión nucleolar de cápsida montado6. Así, la información obtenida del estudio de cualquier serotipo particular AAP no es ampliamente aplicable a la biología PAA todos. Tal naturaleza sorprendente de la biología de la AAP recalca la necesidad de investigar el papel y la función de cada PDA de serotipos AAV canónicos y no canónica.
La función biológica de la AAP en el ensamblaje de la cápside puede valorarse mediante la determinación de que los títulos de partícula viral AAV empaquetado completamente producción en riñón embrionario humano (HEK) 293 células, la línea celular más utilizados para la producción del vector AAV, con o sin proteína AAP expresión. Los métodos estándar para cuantificación de AAV son PCR cuantitativa (qPCR)-basado en ensayos7,8 y cuantitativa dot blot basado en ensayos de9. Otros métodos para la cuantificación de partículas virales AAV como densidad óptica medida12 de10,de análisis enzima-ligado del inmunosorbente11 no son ideales para muestras procedentes de muchos serotipos diferentes de AAV o muestras contaminados con impurezas (lisados crudos o medios de cultivo), que son a menudo las muestras utilizadas para la investigación AAV. En la actualidad, qPCR es más ampliamente utilizado para la cuantificación de la AAV; sin embargo, es necesario reconocer posibles advertencias de la prueba de la qPCR, como el ensayo pueden resultar en errores sistémicos y significativo título variaciones13,14. Ensayos de PCR son afectados por una serie de factores de confusión potencialmente factores como la presencia de horquillas terminales covalentemente cerrados en plantillas PCR que inhiben la amplificación13. Incluso un individuo experimentado puede presentar potencial de factores de confusión en qPCR-basado del análisis sin saberlo13. Por el contrario, cuantitativa dot blot ensayos son una técnica de biología molecular clásica que no implica la amplificación del genoma y utiliza un principio mucho más sencillo con un mínimo riesgo de errores en comparación con ensayos de qPCR. El método es menos técnicamente difícil; por lo tanto, los resultados del ensayo son razonablemente reproducibles incluso por personas sin experiencia.
En este informe, describimos los detalles metodológicos de un ensayo de blot dot cuantitativa utilizamos rutinariamente para cuantificación del vector AAV y proporcionar un ejemplo de cómo aplicar el análisis para estudiar el papel de promoción de la Asamblea de Fiscalizacion en común serotipos (AAV5 y AAV9) y un previamente desacostumbrada AAP de serpiente AAV14. En la naturaleza, proteínas VP de AAV y AAP proteínas se expresan en cis de un solo gen (es decir, VP-AAP cis-complementación), mientras que en el análisis aquí descrito, proteínas VP y AAP se suministran en el transporte de dos plásmidos separados (es decir, VP-AAP Trans-complementación). Puesto que cada proteína VP o AAP de diferentes serotipos puede expresarse de cada plásmido independiente, es posible probar combinaciones de VP-AAP heterólogas para el ensamblaje de la cápside (es decir, VP-AAP Cruz-complementación). Brevemente, AAV VP3 de varios serotipos se expresa en las células de HEK 293 por la transfección de DNA de plásmido para empaquetar un genoma del vector AAV en la presencia o ausencia del serotipo cognado AAP, o en presencia de un serotipo heterólogo AAP. Después de la producción, medios de cultivo y lysates de la célula son sometidos a un análisis de dot blot para cuantificar el genoma viral dentro de la cáscara de la cápside. El primer paso de la prueba de dot blot es tratar las muestras con una nucleasa para eliminar contaminantes plásmido DNAs y genoma AAV sin envasar en las muestras. No hacerlo aumentaría las señales de fondo en particular cuando se analizan muestras no purificadas. Esto es seguido por un tratamiento con proteasas para romper la cápsida viral y liberan genomas virales nucleasa resistente a soluciones de muestra. Genomas virales, siguiente son desnaturalizados, borrados en una membrana y cruzado por hibridación con una sonda de DNA específicos del genoma viral para la cuantificación. En el análisis del ejemplo divulgado aquí, demostramos que la serpiente AAV VP3 requiere serpiente AAP para el ensamblaje de la cápside y que serpiente AAP no promueve a la Asamblea de AAV9 cápsida a diferencia de muchos de los AAPs derivados de serotipos de AAP-dependiente que también pueden promover el montaje de cápsida de serotipo heterólogo. Por último, se reporta una importante ADVERTENCIA para qPCR o ensayos de cuantificación de AAV basado en blot dot que la elección de nucleasa afecta significativamente los resultados del ensayo.

<table><tbody><tr><td>La benzonasa</td><td>MilliporeSigma</td><td>1016970001</td><td>denominada Serratia marcescen endonucleasa en el texto principal.</td></tr><tr><td>La DNasa I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>denominada DNasa I Enzima A en el texto principal.</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>conoce como DNasa I Enzima B en el texto principal.</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td>Referido como DNasa I Enzima C en el texto principal.</td></tr>Junta <tr><td>tórica adjunta de 1,5 mL Tubos de microcentrífuga Tubos de microcentrífuga</td><td>Corning</td><td>430909</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de polipropileno de 15</td><td>mL Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio de 3 m</td><td>Teknova</td><td>S0298</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de polipropileno de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Células AAV-293</td><td>Agilent</td><td>240073</td><td>línea celular HEK-293 optimizada para el empaquetamiento de viriones AAV.</td></tr><tr><td>AccuGENE 0,5 M Solución de EDTA</td><td>Lonza</td><td>51234</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 10% SDS</td><td>Lonza</td><td>51213</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1X TE Tampón</td><td>Lonza</td><td>51235</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Levantador de células</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>MilliporeSigma</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Kit extractor de ADN</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>295-50201</td><td>Se utiliza para manchas de puntos cuantitativas en virus purificados. Utilizamos solo la mitad del volumen de todos los reactivos en cada paso recomendado para el Esquema de Protocolo 2 en el manual proporcionado por el fabricante.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)-glucosa alta (4,5 g/L)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B</td><td>Cells Thermo Fisher Scientific</td><td>18290015</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22095</td><td>Denominado Polysucrose 400.</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Arenque Esperma ADN</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de hibridación</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-247-150</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant TL</td><td>GE Healthcare Ciencias de la vida</td><td>ImageQuant TL</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulsador Electroporador</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Mini Columnas de ADN de Giro Rápido</td><td>MilliporeSigma</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC2 Vector</td><td>Cell Biolabs Inc</td><td>VPK-422</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Fosforimaging Exposición Cassette</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Varios</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorimaging Screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Varios</td><td></td></tr><tr><td>plásmidos Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Polietilenimina</td><td>Polysciences Inc</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>Prime-It II Kit de etiquetado de cebadores aleatorios</td><td>Agilent Technologies 300385</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Forward (N25 nucleótidos del 4º nucleótido en el AAP ORF, RE1 es un sitio de enzima de restricción para la clonación): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Reverse (N25 son los últimos 25 nucleótidos de la AAP ORF, RE2 es un sitio de enzima de restricción para la clonación): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Primer VP3 Forward (N25 los primeros 25 nucleótidos del VP3 ORF, RE1 es un sitio enzimático de restricción para la clonación): CTAA-RE1-CACC-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>VP3 Reverse (N25 son los últimos 25 nucleótidos de la AAP ORF, RE2 es un sitio de enzima de restricción para la clonación): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K Solution</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de restricción New</td><td>England Biolabs</td><td>Varios</td><td></td></tr><tr><td>espermatozoides de salmón ADN</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio Tribásico Dihidratado</td><td>MilliporeSigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Eppendorf</td><td>6321000515</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos tratada con cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353046</tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Buffer-Saturado Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>XLE-1000</td><td>Se utiliza el modo de reticulación óptima, que proporciona una dosis de energía UV de 120 mJ/cm2.</td></tr><tr><td>membrana Zeta-Probe</td><td>Bio-RAD</td><td>162-0165</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo de blot punto cuantitativo para valoración de aav y su uso para la evaluación funcional de la asamblea del virus adeno-asociado-activar proteínas

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Mientras que virus adeno-asociado (AAV) es ampliamente aceptado como un atractivo vector para terapia génica, también sirve como un virus modelo para entender la biología del virus. En este último sentido, el reciente descubrimiento de una proteína AAV no estructural, denominado proteína activadora de Asamblea (AAP), ha arrojado nueva luz sobre los procesos implicados en el ensamblaje de las proteínas de la cápside viral VP en una cápside. Aunque muchos serotipos AAV requieren AAP para la Asamblea, recientemente hemos reportado que AAV4, 5, y 11 son excepciones a esta regla. Además, demostramos que la AAPs y cápsida montado de diferentes serotipos localiza a diferentes compartimentos subcelulares. Este inesperada heterogeneidad en las propiedades biológicas y papeles funcional de Fiscalizacion entre AAV diferentes serotipos subraya que la importancia de los estudios sobre fiscalizacion derivada de diversos serotipos. Este manuscrito detalla un análisis de blot de punto sencillo para cuantificación de AAV y su aplicación para evaluar la especificidad de dependencia y serotipo AAP en el ensamblaje de la cápside. Para demostrar la utilidad de este análisis de dot blot, nos propusimos para caracterizar el conjunto de cápside y la dependencia de la AAP de AAV de la serpiente, un reptil previamente desacostumbrado AAV, así como AAV5 y AAV9, que previamente han demostrado ser independiente de la AAP y dependiente de la AAP serotipos, respectivamente. El análisis reveló que AAV serpiente cápside Asamblea requiere serpiente AAP y no puede ser promovido por Fiscalizacion de AAV5 y AAV9. El análisis también demostró que, a diferencia de muchos del serotipo común fiscalizacion que promover el montaje del cápside heteróloga por Cruz-complementación, serpiente AAP no promover el montaje de AAV9 cápsida. Además, nos muestran que la elección de nucleasa afecta significativamente la lectura de la prueba de dot blot, y así, elegir una enzima óptima es crítica para la exitosa evaluación de títulos AAV.

Un resultado representativo de lacras punto cuantitativo para cuantificación de purificada vector AAV las reservas producidas a gran escala se muestra en la figura 1. Con este ensayo de dot blot, se determinó la concentración de una población de vector de doble hebra AAV2G9-CMV-GFP. El vector se purificó por dos rondas de cloruro de cesio (CsCl) gradiente de densidad ultracentrifugación seguida de diálisis como se describió anteriormente20</...

Este manuscrito detalla un análisis de blot punto sencillo para la cuantificación de los títulos de virus adeno-asociado (AAV) y su aplicación para estudiar la función de activación de montaje proteínas (AAPs), una nueva clase de proteínas virales no estructurales en los AAV serotipos, en la promoción de la Asamblea de cápsida derivado de serotipos AAV cognados y heterólogos.

Un ensayo de Blot punto cuantitativo para valoración de AAV y su uso para la evaluación funcional de la Asamblea del Virus Adeno-asociado-activar proteínas

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Este método puede determinar tanto los títulos de vacío AV purificados como los no purificados y evaluar la capacidad del AAV AAP para promover el ensamblaje de serotipos-capsis AV afines y heterólogos. La principal ventaja de esta técnica es que es un método sencillo y económico que evita los inconvenientes de otros métodos de valoración de AAV. Aunque este método se ha utilizado comúnmente para la cuantificación del vector AAV, también se puede aplicar para abordar varias preguntas fundamentales sobre la biología de AAV, como se muestra en este protocolo.En el día cero, después de cultivar células HEK 293 hasta un 90% de confluencia, prepare el reactivo de transfección mezclando los plásmidos en 96 microlitros de PBS sin calcio ni magnesio en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros. Como se indica en esta tabla, la cantidad total de ADN es de dos microgramos por pocillo. Agregue cuatro microlitros de solución de PEI a la mezcla de ADN plasmídico PBS.El volumen final es de aproximadamente 100 microlitros o el 5% del volumen del medio de cultivo. Agite los tubos brevemente e incube la mezcla de ADN PEI a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación

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Investigación

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Biology

Biología

En este video, demostramos un ensayo colorimétrico in vitro para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes contra vectores del virus adenoasociado recombinante 6 (rAAV6) que expresan fosfatasa alcalina en muestras de suero de ovejas. El ensayo utiliza la reacción entre el AAV que codifica un gen de fosfatasa alcalina de la placenta humana y su sustrato para generar un producto púrpura insoluble.

Ensayo de anticuerpos neutralizantes AAV basado en células: una técnica colorimétrica para detectar anticuerpos neutralizantes contra virus adenoasociados específicos en suero

En este video, describimos el ensayo de dot blot para cuantificar un genoma viral. La intensidad de la señal está directamente relacionada con la cantidad de ADN viral en la muestra.

Ensayo de transferencia de puntos para cuantificar el genoma viral

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción a gran escala de vectores AAV de grado de investigación utilizando células HEK 293 adherentes cultivadas en pilas celulares y purificación por cromatografía de afinidad. Este protocolo produce consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vectoriales / ml, proporcionando cantidades vectoriales apropiadas para estudios con animales grandes.

Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

Este protocolo presenta cómo cuantificar la eficiencia de la transducción de AAV en la retina del ratón mediante PCR digital por gotas (dd-PCR) junto con la producción de AAV a pequeña escala, la inyección intravítrea, las imágenes de la retina y el aislamiento del ADN genómico de la retina.

Método de PCR de gotas digitales para la cuantificación de la eficiencia de la transducción AAV en la retina murina

Se describe un protocolo de laboratorio completo y un flujo de trabajo de análisis para un ensayo basado en células colorimétricas rápidas, rentables y sencillas para detectar elementos neutralizantes contra AAV6.

Un método paso a paso para detectar anticuerpos neutralizantes contra AAV utilizando un ensayo colorimétrico basado en células

Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y validación de buenas prácticas de laboratorio en la detección compatible de vectores virales adenoasociados en lágrimas humanas por reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas en apoyo del desarrollo clínico de vectores de terapia génica.

Un ensayo validable de reacción digital de la polimerasa en cadena de gotas para la detección de vectores virales adenoasociados en estudios de bioderramamiento de lágrimas

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la generación y purificación de vectores virales adenoasociados utilizando un método optimizado de cromatografía de afinidad basado en heparina. Presenta un enfoque simple, escalable y rentable, que elimina la necesidad de ultracentrifugación. Los vectores resultantes exhiben una alta pureza y actividad biológica, lo que demuestra su valor en estudios preclínicos.

Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

A medida que el campo de la terapia génica continúa evolucionando, existe una creciente necesidad de métodos innovadores que puedan abordar estos desafíos. Aquí, se presenta un método único, que agiliza el proceso de generación de vectores AAV de alto rendimiento y alta pureza utilizando una plataforma de fábrica de células, cumpliendo con los estándares de calidad para estudios in vivo .

Un procedimiento simplificado y estandarizado para generar vectores de virus adenoasociados de alta calidad y alto título utilizando una plataforma de fábrica de células

La cuantificación precisa de las copias del genoma del vector de virus adenoasociados (AAV) es fundamental, pero aún no se ha establecido un protocolo estandarizado. Este protocolo describe un método validado para preparar muestras purificadas de AAV y realizar una reacción en cadena de la polimerasa (dd_PCR) digital para cuantificar de forma fiable el título del genoma viral.

Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales

El peldaño de la escalera caminando tarea es una nueva prueba para evaluar el caminar calificados y medir patas delanteras y la extremidad posterior colocación, paso a paso, y entre los miembros de coordinación.

El peldaño de la escalera a pie de la tarea: un sistema de puntuación y su aplicación práctica.

Aprende a realizar un ensayo de blot punto cuantitativo para valorar títulos de AAV purificados y no purificados. Este método sencillo y económico evalúa el papel de las proteínas AAP en la ensamblaje de cápsides de diferentes serotipos de virus adeno-asociado.

Un ensayo de Blot punto cuantitativo para valoración de AAV y su uso para la evaluación funcional de la Asamblea del Virus Adeno-asociado-activar proteínas (Video) | JoVE Journal

Un ensayo de Blot punto cuantitativo para valoración de AAV y su uso para la evaluación funcional de la Asamblea del Virus Adeno-asociado-activar proteínas

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