Un ensayo de Blot punto cuantitativo para valoración de AAV y su uso para la evaluación funcional de la Asamblea del Virus Adeno-asociado-activar proteínas

Este método puede determinar tanto los títulos de vacío AV purificados como los no purificados y evaluar la capacidad del AAV AAP para promover el ensamblaje de serotipos-capsis AV afines y heterólogos. La principal ventaja de esta técnica es que es un método sencillo y económico que evita los inconvenientes de otros métodos de valoración de AAV. Aunque este método se ha utilizado comúnmente para la cuantificación del vector AAV, también se puede aplicar para abordar varias preguntas fundamentales sobre la biología de AAV, como se muestra en este protocolo.

En el día cero, después de cultivar células HEK 293 hasta un 90% de confluencia, prepare el reactivo de transfección mezclando los plásmidos en 96 microlitros de PBS sin calcio ni magnesio en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros. Como se indica en esta tabla, la cantidad total de ADN es de dos microgramos por pocillo. Agregue cuatro microlitros de solución de PEI a la mezcla de ADN plasmídico PBS.

El volumen final es de aproximadamente 100 microlitros o el 5% del volumen del medio de cultivo. Agite los tubos brevemente e incube la mezcla de ADN PEI a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, haga girar brevemente los tubos en una microcentrífuga para recoger el líquido hasta el fondo.

Y agregue la mezcla de ADN PEI gota a gota al medio de cultivo en cada pocillo de la placa de cultivo HEK 293. A continuación, agite suavemente las placas y devuélvalas a una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de CO2. La transfección de la célula HEK 293 es un componente crítico de este protocolo para la producción de virus de alto título.

Se deben utilizar células sanas de bajo número de paso y se debe tener cuidado de no alterar la monocapa de las células. En los días uno y dos, bajo un microscopio de fluorescencia invertida, observe las células transfectadas con el plásmido PCMVGFP para evaluar la eficiencia de la transfección. Al quinto día, pipetee las células y el medio que contiene virus hacia arriba y hacia abajo o use un raspador de células para raspar todas las células.

Luego, transfiera la suspensión a tubos cónicos de polipropileno de 15 mililitros. Guarde las muestras a menos 80 grados centígrados hasta su uso. Para recuperar las partículas virales, descongele rápidamente los tubos congelados en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Luego, agite los tubos vigorosamente durante un minuto para maximizar la recuperación de AAV de las células. Granular los restos celulares por centrifugación a 3.700 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, transfiera 200 microlitros del sobrenadante de cada tubo a tubos de microcentrífuga marcados con tapones de rosca para el ensayo de transferencia de puntos.

Para tratar las muestras con endonucleasa de Serratia marcescens, prepare la mezcla de reactivos A y B. Agregue 10 microlitros de cada reactivo a cada tubo de muestra. Agite las muestras durante cinco segundos y gírelas brevemente para recoger el líquido hasta el fondo de los tubos.

A continuación, incubar los tubos a 37 grados centígrados durante al menos una hora. Después de centrifugar brevemente las muestras, realice el tratamiento con proteinasa K preparando el reactivo de mezcla C y añadiendo 180 microlitros a cada tubo. Luego, después de vórtice y volver a girar brevemente los tubos, incubelos a 55 grados centígrados durante una hora.

Una vez que las muestras hayan vuelto a temperatura ambiente, agregue 200 microlitros de fenol-cloroformo y agite los tubos durante un minuto. A continuación, centrifugar las muestras en una microcentrífuga a 16,100 veces G y a temperatura ambiente durante al menos cinco minutos. Transfiera 320 microlitros de la capa acuosa o el 80% del volumen de fluido acuoso a un nuevo tubo de microcentrífuga estándar.

Este paso de transferencia es de vital importancia, ya que se debe tomar el mismo volumen de la muestra para mantener la precisión de la cuantificación de AAV. Se debe tener cuidado de evitar la fase orgánica mientras se elimina la capa acuosa. Prepare el reactivo de mezcla D y añada 833 microlitros a cada tubo de muestra.

Después de vórtice los tubos, incubelos a menos 80 grados centígrados durante al menos 20 minutos. Después de la centrifugación, vierta el sobrenadante y seque los tubos una vez sobre una toalla de papel limpia. Pipetee aproximadamente 500 microlitros de etanol al 70% en cada tubo y haga vórtice los tubos durante cinco segundos.

Después de volver a girar las muestras, vierta el sobrenadante y seque los tubos una vez sobre una toalla de papel limpia. A continuación, seque los gránulos a 65 grados centígrados antes de volver a suspenderlos en el tampón TE. Para llevar a cabo el ensayo de transferencia de puntos, prepare patrones de ADN plasmídico diluyendo el ADN plasmídico del genoma vectorial AAV a 10 nanogramos por microlitro en agua o tampón Tris-HCL.

Transfiera una alícuota de 25 microlitros del ADN plasmídico diluido a un tubo nuevo y linealícelo con una enzima de restricción adecuada en un volumen de reacción de 50 microlitros durante una hora. Agregue 450 microlitros de agua o TE al tubo que contiene el patrón de ADN plasmídico digerido y mezcle bien. A continuación, transfiera 70 microlitros de esta mezcla a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con 1.330 microlitros de agua o TE para hacer un patrón de plásmido diluido.

Para configurar el aparato de transferencia de puntos, con unas tijeras, corte la membrana secante a un tamaño adecuado para el número de muestras y estándares. Remoje la membrana con agua durante 10 minutos antes de colocarla en el aparato de mancha de puntos. Luego, cubra los pozos no utilizados.

Agregue agua a los pozos en los que se cargarán las muestras. Aplique una aspiradora, extraiga el agua a través de los pozos, verifique si hay errores y luego vuelva a apretar los tornillos. Vuelva a realizar la prueba si es necesario.

Aplique 400 microlitros de cada patrón de ADN plasmídico diluido a cada pocillo y ejecute cuatro carriles de diluciones estándar. Utilice dos alícuotas separadas del resumen estándar y cargue cada una por duplicado. A continuación, aplique 200 microlitros por pocillo de cada muestra de ADN viral.

Aplique una aspiradora suave para extraer las soluciones de ADN a través de los pocillos. Luego, una vez que se hayan vaciado todos los pocillos, libere el vacío ajustando la válvula de tres vías. Agregue 400 microlitros de una solución alcalina X a cada pocillo.

Luego espere cinco minutos antes de volver a aplicar el vacío para vaciar los pozos. Vuelva a aplicar la aspiradora y desmonte el aparato de mancha de puntos. A continuación, retire la membrana y enjuáguela con dos X SSC.

Coloque la membrana sobre una toalla de papel limpia con el lado unido al ADN hacia arriba para eliminar el exceso de tampón. Utilice un reticulante UV adecuado para entrecruzar el ADN borrado con la membrana. La membrana ya está lista para la hibridación.

Coloque la membrana en una botella de hibridación con el lado unido al ADN hacia arriba. Enjuague la membrana con cinco a 10 mililitros de tampón de hibridación precalentado y deseche el tampón. Luego agregue 10 mililitros de tampón de hibridación precalentado y coloque la botella en un horno de hibridación giratorio ajustado a 65 grados centígrados.

Gire el frasco durante al menos cinco minutos. Agregue rápidamente el ADN de esperma desnaturalizado y la sonda radiactiva al tampón de hibridación en la botella y agítelo durante 10 segundos para mezclar. Regrese la botella al horno a 65 grados centígrados e incubela con rotación a 65 grados centígrados durante al menos cuatro horas.

Una vez completada la hibridación, detenga la rotación. Retire la botella de hibridación y luego vierta la solución de sonda radiactiva en un tubo cónico de 50 mililitros con una tapa de sellado de tapón a prueba de fugas. Para lavar la membrana, agregue de 20 a 30 microlitros de tampón de lavado precalentado a la botella de hibridación y gírela durante cinco minutos.

Repite este lavado dos veces más. Después del tercer lavado, retire la membrana de la botella de hibridación y, con toallas de papel, retire el exceso de tampón de la membrana. A continuación, coloque la membrana en un soporte de papel de plástico transparente.

Con un contador Geiger, compruebe las señales radiactivas en la membrana. Después de exponer la pantalla de imágenes de fósforo borrada a la membrana, escanee la pantalla utilizando un sistema de escaneo de imágenes de fósforo y obtenga los datos sobre la intensidad de la señal de cada punto. Realizar análisis de datos según el protocolo de texto.

Esta transferencia de puntos cuantitativa para la valoración de vectores AAV 2G9 tiene dos conjuntos de estándares y tres cantidades diferentes de una preparación de vectores AAV, incluidos 0,3, 0,1 y 0,03 microlitros por duplicado. Las cantidades que deben analizarse en el blot se determinan empíricamente o se basan en un ensayo preliminar. Se determinó por interpolación que las alícuotas de 0,3, 0,1 y 0,03 microlitros del vector AAV 2G9 tenían en promedio un título de 5,16, 0,27 nanogramos de microlitros equivalentes.

Todas las posibles combinaciones de serotipos afines y heterólogos de las proteínas VP3 cas-pid y AAP de AAV5, AAV9 y AAV de serpiente se evaluaron para el ensamblaje de la cápside mediante un ensayo cuantitativo de transferencia de puntos. Los resultados de este gráfico muestran que AAV5 VP3 se ensambla independientemente de si AAP se proporcionó en trans. Además, AAP5 y AAP9 pueden promover el ensamblaje de la cápside AAV9 VP3, aunque AAP5 funciona con menos eficacia que AAP9.

Ni AAP5 ni AAP9 exhiben una actividad de promoción de ensamblaje en AAV VP3 de serpiente, y AAP de serpiente solo promueve el ensamblaje de AAV VP3 de serpiente. Se aplicó un análisis de transferencia de puntos para evaluar la actividad nucleasa de tres nucleasas disponibles comercialmente en condiciones no optimizadas que contenían impurezas derivadas de células y medios de cultivo. Se encontró que la enzima A no era tan activa como las otras dos enzimas, lo que demuestra que la elección de la nucleasa podría afectar significativamente la lectura del ensayo de transferencia de puntos.

Esta técnica es sencilla para la cuantificación del vector AAV y fundamental para evaluar el papel de AAP en la promoción del ensamblaje de cápsidas AAV derivadas de serotipos afines y heterólogos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día si se realiza correctamente una vez que se obtienen muestras de ensayo en experimentos de cultivo celular. Al intentar este procedimiento, es importante recordar pipetear cuidadosamente el volumen de líquido correcto para garantizar la precisión cuantitativa.

Después de su desarrollo, la aplicación del ensayo cuantitativo de transferencia de puntos para estudiar el AAP ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la biología del AAV comprendan mejor el mecanismo de ensamblaje de la cápside del AAV. No olvide que trabajar con células humanas, agentes virales, fenol-cloroformo y materiales radiactivos puede ser extremadamente peligroso. Y se necesita el uso de batas de laboratorio, guantes y gafas protectoras para limitar la exposición.

Estos materiales solo deben manipularse en áreas aprobadas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar muestras de transferencia de puntos para la cuantificación de AAV, configurar el aparato de transferencia de puntos, determinar el título de AAV y aplicar el procedimiento al estudio de la biología de AAV. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros ensayos, como los ensayos de transducción de vectores AAV en células en cultivo, para responder a preguntas adicionales, como el título funcional de la vectorización en comparación con el título de partículas físicas determinado por el ensayo de transferencia de puntos.