Consecuencias conductuales y reproductivas a largo plazo de exposición embrionaria a dosis bajas sustancias tóxicas

El objetivo general de estos procedimientos es investigar los efectos a largo plazo de la exposición a dosis bajas de BPA en la embriogénesis temprana. Los embriones de C. elegans se exponen al BPA durante un período limitado y se analizan al llegar a la edad adulta para determinar la fecundidad y el comportamiento de aprendizaje. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los efectos a largo plazo en el desarrollo de la exposición a tóxicos como los bisfenoles y otros compuestos que alteran el sistema endocrino.

La principal ventaja de esta técnica es que permite probar los efectos sutiles y a largo plazo de los tóxicos en el desarrollo a través de ensayos cuantitativos de comportamiento en un modelo de laboratorio de invertebrados fácil de usar. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión de las bases neuronales y de desarrollo de los efectos nocivos para la salud de la exposición a tóxicos, incluso en dosis bajas. La primera vez que tuvimos la idea de estos experimentos fue cuando nos dimos cuenta de que una serie de trastornos complejos o multifactoriales parecían tener algún que otro componente del desarrollo.

Lo que puede ejercer su influencia en parte a través de la expresión anómala de genes críticos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de habituación al tacto interior pueden ser difíciles de aprender únicamente a través de instrucciones basadas en texto. El día antes de la sincronización, transfiera los gusanos N2 a placas de 100 milímetros que contengan medios NGM, esparcidos con E. coli OP50.

Mediante el troceo de la losa de aproximadamente un centímetro cuadrado. Deje que los gusanos crezcan durante tres días a 20 grados centígrados. Después de tres días, cuando las placas estén pobladas por adultos maduros bien alimentados que contengan embriones visibles, comience la sincronización lavando primero cada placa con cinco milímetros de tampón M9 y transfiriendo el líquido a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mililitros.

Centrifugar a 3.000 veces la gravedad durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Después de la certrifugación, use una pipeta de diez mililitros para eliminar cuidadosamente el sobrenadante de cada pelliza suelta de gusanos adultos. Luego agregue 5 mililitros de solución de hipoclorito recién preparada a cada pellet de gusanos y mezcle suavemente.

Centrifugar a 3.000 veces la gravedad a temperatura ambiente durante cuatro minutos. Es fundamental obtener poblaciones sincronizadas. La preparación de una solución fresca de hipoclorito ayuda a evitar la contaminación y los animales no sincronizados.

A continuación, utilice una pipeta de diez mililitros para eliminar el sobrenadante y lave los siete mililitros de tampón M9. Repita este paso dos veces. Después del último lavado, agregue aproximadamente 100 microlitros de tampón M9 a los huevos.

A continuación, transfiera unos 50 microlitros de huevos a dos tubos de microfuga de mililitros que contienen BPA diluido en tampón S. Ajuste la cantidad de tampón S para asegurar la concentración final correcta de BPA por tubo, como se muestra en la tabla. Coloque los tubos en un agitador oscilante o rotativo, moviéndose a 25 inclinaciones por minuto, o 25 RPM durante cuatro horas a 20 grados centígrados.

Después de cuatro horas, coloque los tubos en soportes para tubos y deje que los gusanos se asienten. Deseche el sobrenadante y transfiera los gusanos a placas NGM sembradas con OP50 E. coli. Deje que los gusanos crezcan durante 60 horas a 20 grados centígrados.

Examine las placas todos los días en busca de contaminación. Las placas de NGM contaminadas suelen estar descoloridas y acompañadas de colonias individuales. Revise los gusanos bajo el microscopio para ver si hay hacinamiento.

Primero, use una púa de alambre de platino de calibre 30 esterilizada al fuego para transferir aproximadamente diez gusanos adultos jóvenes sincronizados a nuevas placas NGM sin sembrar. Deje las lombrices sin perturbar durante cinco minutos para darles tiempo de aclimatarse al nuevo plato. A continuación, esteriliza el pelo de una ceja unido al extremo de una brocheta de madera o un palillo de dientes sumergiéndolo en etanol al 70%.

Limpie con un pañuelo limpio y sin pelusa y espere un minuto para que el etanol se evapore. Toque suavemente el gusano en la cabeza con el pelo de las cejas. Repite los toques, dejando diez segundos entre toques para permitir que el gusano se recupere.

Continúe tocando, permita intervalos de diez segundos entre estímulos hasta que el gusano ya no se mueva hacia atrás. Registre el número de toques necesarios para que se produzca esta habituación. Es importante permitir un intervalo de diez segundos entre contactos, ya que esto permite que el animal tenga tiempo de recuperación y ayuda a obtener ensayos de comportamiento de habituación consistentes.

Los animales adultos que fueron expuestos embrionariamente a un micromolar o mayor concentración de BPAs pusieron significativamente menos huevos en comparación con el control representado por la línea horizontal. Los animales adultos derivados de embriones que fueron expuestos a concentraciones de BPA tan bajas como 0,1 micromolares muestran déficits no asociativos basados en el mayor número de toques anteriores necesarios para que se habitúen. Al preparar los embriones para la exposición al BPA, es importante elegir una placa con adultos de C. elegans bien alimentados con huevos maduros visibles bajo el microscopio de disección para tener un tamaño de muestra suficiente.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la toxicología ambiental evalúen los efectos de las toxinas y otros compuestos disruptores endocrinos en el comportamiento y diseñen experimentos mecanicistas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo exponer embriones de C. elegans en etapa temprana al BPA y cómo probar el comportamiento de habituación en los adultos resultantes derivados de los embriones expuestos al BPA.