Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la recolección de líquido cefalorraquídeo de ratones sin contaminación por sangre. Este método proporciona una forma fácil y fiable de recolectar LCR para monitorear los biomarcadores de enfermedades neuronales. La principal ventaja de esta técnica es que la adición con el micromanipulador para ayudar en la recolección de LCR de ratones disminuye la contaminación de la sangre durante la recolección.

Comience colocando un capilar de vidrio tirado en un soporte capilar que está firmemente montado en un micromanipulador. A continuación, mientras observa a través de un microscopio de disección, use pinzas rectas para romper la punta del capilar afilado de modo que el diámetro interior de la punta rota sea de aproximadamente 10 a 20 micras. A continuación, conecte un tubo delgado y una jeringa al otro extremo del soporte capilar, conecte el tubo delgado y la jeringa con una válvula de tres vías y cambie la válvula de tres vías para abrirla.

A continuación, sumerja la jeringa para expulsar cualquier contaminante y crear una presión positiva en el tubo capilar. Repita esto varias veces desconectando y volviendo a conectar la jeringa a la válvula de tres vías. A continuación, aspire aire de 100 a 200 microlitros antes de la reconexión final de la jeringa con la válvula de tres vías.

Mueva el micromanipulador con el capilar de vidrio hacia un lado para evitar daños durante el procedimiento quirúrgico. Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de que el ratón haya sido completamente anestesiado pellizcando las cuatro extremidades y observando la ausencia de una reacción. Luego, use tijeras de disección para cortar y recortar el cabello en la parte posterior de la cabeza del ratón desde arriba de los ojos entre las orejas hasta la parte inferior del cuello.

Asegure la cabeza del ratón con un adaptador de ratón de marco estereotáxico. Asegúrese de que la cabeza no se pueda mover y esté firmemente asegurada en el adaptador empujando suavemente hacia abajo la cabeza del mouse. Use tijeras y pinzas curvas para cortar la piel del ratón, a través de la parte posterior del cuello y luego por la mitad del cráneo, entre las orejas y los ojos del ratón.

Separe la piel y el tejido y sáquelos del área sobre la cisterna magna. Mientras observa a través del microscopio de disección, diseccione cuidadosamente las últimas capas delgadas de músculo sobre la base del cráneo con fórceps y mueva estas capas de músculo hacia un lado y fuera del área de interés. Una vez que la duramadre sobre la cisterna magna esté expuesta, use un bastoncillo de algodón húmedo para limpiar la membrana y luego use un bastoncillo de algodón seco para secar el área.

La cisterna magna parece triangular con uno o dos grandes vasos sanguíneos que atraviesan el área. Cualquiera de los lados o entre los vasos sanguíneos es óptimo para la inserción capilar y la recolección de líquido cefalorraquídeo. Una vez que la cisterna magna esté expuesta, use el micromanipulador para alinear el capilar de vidrio con la parte posterior de la cabeza del mouse de modo que la punta afilada esté justo detrás de la membrana en un ángulo de 30 a 45 grados.

A continuación, sumerja la jeringa una o varias veces y luego mueva el émbolo hacia atrás de 100 a 200 microlitros para asegurarse de que no haya contaminantes y que haya presión negativa en el capilar de vidrio. A continuación, acerque la punta capilar a la membrana hasta que se pueda ver la resistencia, pero sin perforar la membrana. Golpee los controles del micromanipulador para golpear suavemente el tubo capilar a través de la membrana.

El líquido cefalorraquídeo debe introducirse automáticamente en el tubo capilar una vez que se ha perforado la abertura. Deje el capilar en su lugar para recoger lentamente el líquido cefalorraquídeo. Si el líquido cefalorraquídeo ha dejado de fluir, extraiga lentamente la jeringa aproximadamente 50 microlitros para crear más presión negativa en el capilar.

recolectan de diez a 15 microlitros de líquido cefalorraquídeo en 10 a 30 minutos. Una vez que se haya recogido el volumen deseado de líquido cefalorraquídeo, cierre el tubo desplazando la válvula de tres vías para cerrar y retirar la jeringa conectada al tubo. Abra y luego cierre el tubo para crear una presión igualada en el capilar, el tubo y el área fuera del capilar.

A continuación, vuelva a conectar la jeringa antes de retirar suavemente el capilar de vidrio del ratón con un micromanipulador. A continuación, coloque el tubo de recolección que contiene un microlitro de inhibidor de la proteasa 20X debajo de la punta afilada del capilar de vidrio. Abra el tubo y sumerja suavemente la jeringa.

El líquido cefalorraquídeo debe salir del capilar y entrar en el tubo de recolección. Después de la recolección, centrifugue el LCR por pulsos para mezclar la muestra con el inhibidor de la proteasa en el fondo del tubo de recolección. Las muestras de LCR se pueden alícuota y luego almacenar para su posterior análisis a menos 80 grados Celsius.

El líquido cefalorraquídeo recogido de ratones APP/PS1 demostró un aumento significativo en los niveles de A beta 42 humano a los 12 meses de edad. En ratones de tipo salvaje, no se detectó ningún A beta 42 humano. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en una hora si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar los vasos sanguíneos al insertar el capilar y solo hacer ajustes menores con el micromanipulador durante la recolección del líquido cefalorraquídeo para evitar la contaminación con sangre.