Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

El objetivo general de este experimento es estudiar las elevaciones de calcio en las dendritas neuronales en respuesta a diferentes paradigmas de estimulación utilizando registros de patch-clamp de células completas en somas neuronales en paralelo con imágenes de calcio de dos fotones en dendritas. Este método se puede emplear para monitorear la señalización del calcio en pequeños compartimentos dendríticos, lo que permite una observación cercana de los procesos que ocurren en las ramas dendríticas durante la integración de las entradas sinápticas. La principal ventaja de esta técnica es que permite observar patrones de señalización de calcio con alta resolución espacio-temporal y especificidad.

Coloque el cerebro del ratón en una placa de Petri que contenga sacarosa ACSF fría y oxigenada continuamente. Para preparar rodajas de hipocampo del cerebro extraído, deje que el cerebro se enfríe durante unos dos minutos. Luego, coloque un trozo de papel de filtro en una placa de Petri llena de hielo y transfiera el cerebro al papel de filtro.

Luego, disecciona el cerebro en dos hemisferios. Pegue los hemisferios disecados en una plataforma de corte de vibratomo y sumérjala en la bandeja de corte llena de sacarosa ACSF oxigenada helada. A continuación, corte rodajas de 300 micrómetros de grosor a un grado centígrado utilizando un enfriador de vibrátomo o colocando el hielo alrededor de la bandeja de vibráto.

Con un pincel, transfiera las rodajas que contienen el hipocampo a un baño de recuperación de ACSF oxigenado calentado a 37 grados centígrados. En este paso, transfiera una rebanada de hipocampo a un baño bajo el objetivo de un microscopio de dos fotones de escaneo láser. Perfundir continuamente el baño con ACSF-normal oxigenado.

A continuación, utilice la microscopía de contraste de interferencia diferencial infrarroja para localizar una célula de interés utilizando su tamaño, forma y posición. A continuación, llene una pipeta estimulante con una solución ACSF-normal que contenga el fluoróforo rojo. Bájalo en la parte superior de la rebanada para que la punta esté en la misma región que la celda de interés.

A continuación, llene la pipeta de parche con solución de parche y conéctela a la platina principal. Colóquelo sobre la rebanada de modo que su punta quede directamente encima de la celda de interés. A continuación, coloque una jeringa en la llave de paso de tres vías y conéctela a la pipeta de parche a través de un tubo de plástico.

Inyecte presión positiva constante en la pipeta de parche y mantenga la llave de paso en posición cerrada. A continuación, abra el módulo de software de control del amplificador MultiClamp y cambie al modo Voltage Clamp haciendo clic en el botón VC. Abra el software de adquisición de datos electrofisiológico Clampex para registrar señales electrofisiológicas y haga clic en el icono de prueba de membrana para enviar un pulso de voltaje cuadrado constante para monitorear los cambios en la resistencia de la pipeta.

Ahora, baje la pipeta de parche hasta que esté justo encima de la célula objetivo. Al entrar en contacto con la membrana celular, elimine la presión girando la llave de paso a la posición abierta. A continuación, aplique una ligera presión negativa a la pipeta de parche con una jeringa vacía instalada en la llave de paso hasta que la resistencia de la pipeta alcance un gigaohmio.

En la ventana Prueba de membrana del software de adquisición de datos, fije la celda a menos 60 milivoltios. Continúe aplicando presión negativa hasta que la resistencia de la pipeta disminuya y se logre la configuración de celda completa. En el módulo de software de control del amplificador MultiClamp, establezca la configuración del parche en pinza amperimétrica haciendo clic en el botón IC y registre las propiedades de la membrana en respuesta a inyecciones somáticas de corrientes hiperpolarizantes y despolarizantes.

Espere al menos 30 minutos para que la celda se llene con los indicadores presentes en la solución de parche. Para adquirir imágenes, localice una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja. Asegure una respuesta visible eligiendo una dendrita proximal de menos de 50 micrómetros, ya que la eficiencia de la retropropagación de AP puede disminuir significativamente con la distancia en las interneuronas GABAérgicas, y cambie al modo xt.

Con los controladores de intensidad láser, configure el láser de dos fotones a un nivel de potencia mínimo donde la fluorescencia verde de referencia sea ligeramente visible, para evitar la fototoxicidad. A continuación, en la ventana de protocolo del software de adquisición de datos de electrofisiología Clampex y en el software de adquisición de imágenes, cree una prueba de registro de la duración deseada que contenga una inyección de corriente somática de la amplitud deseada. Después de eso, haga clic en el botón Iniciar grabación y adquiera la fluorescencia de forma continua durante uno o dos segundos.

Repita la adquisición de la imagen de tres a 10 veces. Espere al menos 30 segundos entre exploraciones individuales para evitar el fotodaño. Para registrar los transitorios de calcio dendrítico inducidos por la estimulación eléctrica, localice una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja.

Coloque la pipeta estimulante en la superficie de la rebanada por encima de la dendrita de interés. Baje lentamente la pipeta de estimulación de 10 a 15 micrómetros de la dendrita, minimizando el movimiento para evitar perturbar la configuración de toda la célula. Para visualizar la ubicación de los microdominios sinápticos en las neuronas espinosas, en el software de adquisición de imágenes, cambie al modo xt y coloque la línea a lo largo de la rama dendrítica de interés.

En la ventana Protocolo, cree una prueba de grabación que desencadene la estimulación. Con el software de adquisición, escanee a lo largo de la dendrita de forma continua durante uno o dos segundos. Repita la adquisición de tres a cinco veces, esperando 30 segundos entre exploraciones para evitar el fotodaño.

Para obtener información preliminar sobre la morfología de la célula y mantener un registro de la ubicación de la pipeta de estimulación, adquiera una pila Z de la célula en el canal rojo. Usando el software de adquisición en modo xyz, establezca los límites de pila superior e inferior para crear una imagen de toda la celda con todos los procesos incluidos. A continuación, establezca el tamaño del paso en un micrómetro e inicie la adquisición de la pila con el botón Iniciar registro.

Cuando se complete la adquisición de la pila Z, utilice la opción Proyección máxima en el software para superponer todos los planos focales de la pila y verificar la calidad de la adquisición. A continuación, retraiga lentamente la pipeta de parche para sacarla de la rebanada. Para fijar la rebanada para la identificación morfológica post hoc, retire rápidamente la rebanada del baño con un pincel y colóquela entre dos papeles de filtro en una placa de Petri llena de ACSF.

Reemplace el ACSF con una solución de paraformaldehído al 4% y deje el plato a cuatro grados centígrados durante la noche. En esta figura, la proyección máxima de una pila Z de dos fotones muestra una interneurona parcheada llena de Alexa-594. Las puntas de flecha blancas señalan la ubicación de los terminales axonales dentro de la capa piramidal, lo que sugiere que la interneurona es una célula cesta.

Esta figura muestra la rama dendrítica cerca de la cual se colocó el electrodo estimulador. La línea discontinua muestra la ubicación del escaneo de línea. Las imágenes aquí ilustran el resultado de un escaneo de línea en los canales rojo y verde.

El aumento de la fluorescencia verde en el momento de la estimulación indica un aumento de la concentración de calcio en esa zona. Las imágenes se pueden agrupar en segmentos más pequeños, lo que permite el análisis de la propagación de la respuesta. Los trazos observados aquí muestran los transitorios de calcio provocados en diferentes segmentos en respuesta a la estimulación eléctrica registrados a nivel somático durante el ensayo de imagen.

La amplitud de los transitorios de calcio disminuye con la distancia desde el punto caliente central, lo que indica que la respuesta está localizada espacialmente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes con colorantes sensibles al voltaje o la optogenética, para responder a preguntas adicionales, como los cambios locales en el potencial de memoria dentro de las ramas dendríticas o la integración de entradas específicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo monitorear las fluctuaciones de calcio dependientes de la actividad en las dendritas neuronales utilizando una combinación de técnicas optofisiológicas, que serán útiles para explorar las complejidades de la integración y la plasticidad de la entrada dendrítica.