Name: Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a registrar transitorios de calcio en dendritas neuronales mediante imagen de dos fotones combinada con técnicas de patch-clamp en rebanadas de cerebro de ratón. Este método permite estudiar la integración sináptica con alta resolución espaciotemporal.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de institutos canadienses de investigación en salud, las ciencias naturales y la investigación en Ingeniería (NSERC Discovery Grant) y la Fundación de Saboya. OC fue apoyado por una beca de doctorado de NSERC.

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices de bienestar animal de la Comisión de protección Animal de Université Laval y el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal.
1. preliminar preparación (opcional: preparar 1 día de anticipación)
<ol><li>Preparar tres tipos de solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (Normal, sacarosa y soluciones de recuperación, 1 L cada; ver tabla 1). Ajustar la osmolalidad de las soluciones a 300 ± 10 mOsm25 y enfriar la ACSF sacarosa hasta un punto cerca del punto de congelación (0-4 ° C). Nota: El uso de una solución de corte bajo en sodio (ACSF-sacarosa) ayuda a preservar la viabilidad de las neuronas en las capas superficiales de rebanadas agudo26.</li>
	<li>Preparar 0,75 mL de solución de parche que contiene un fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa-594) y un indicador de calcio sintético verde (p. ej., Oregon Green BAPTA-1; ver tabla 1). Incluyen la biocitina (ver tabla 1) en la solución de parche si post hoc la identificación morfológica de las células registradas.</li>
	<li>Ajustar la osmolalidad de la solución de 280 ± 5 mOsm y pH 7.35 ± 0.5. Mantener la solución en el refrigerador o en hielo en todo momento. Nota: Elección del indicador de calcio se debe basa su rango dinámico y la naturaleza de las Ca2 + eventos investigados.</li>
	<li>Utilizando un extractor de micropipeta, preparar pipetas de parche de Capillares de vidrio de borosilicato (véase Tabla de materiales) con una punta de 2 μm ≈ (resistencia de la pipeta de MΩ 3-5) y pipetas de estimulación de Capillares de vidrio de theta de borosilicato (véase tabla de Materiales) con una punta de 2-5 μm. Nota: La configuración del extractor para pipetas de un diámetro determinado y la forma se determinará por el tipo de filamento del extractor y resultados de la prueba de rampa para un determinado tipo de vidrio.</li>
</ol>2. hipocampo sector preparación
<ol><li>Anestesiar el ratón (P13-20; la tensión y el sexo del ratón viene determinado por la pregunta experimental se aborda) con 1 mL de isoflurano sobre una toalla de papel dentro de una cámara de narcosis por inhalación. Cuando el animal está anestesiado profundamente, según lo evidenciado por la falta de movimiento y la respiración lenta, retire de la cámara de narcosis y decapitar con una guillotina.</li>
	<li>Exponer el cráneo mediante la reducción de la piel con un pequeño par de tijeras de la parte posterior del cráneo a la nariz. Utilice un par de gubias hueso mini para hacer un agujero en el nivel de bregma. Luego utilice las tijeras para hacer un corte caudal a rostral a lo largo de la sutura sagital. Con las gubias Sujete la parte posterior de cada aleta de cráneo y levante hacia arriba y hacia afuera para extraer el cráneo cubriendo cada hemisferio.</li>
	<li>Después de que el cerebro está completamente expuesto, socavar los nervios ópticos con una pequeña espátula. El cerebro del cráneo y colocarlos en una placa Petri conteniendo continuamente oxigenada, frío ACSF-sacarosa (ver tabla 1 para la concentración de sacarosa).<ol>
<li>Si el tejido de los ratones más viejos se requiere, realizar una perfusión intracardiaca mediante una jeringa (25G) con 20 mL de helado ACSF-sacarosa antes de la extracción de cerebro para obtener rebanadas de buena calidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se preparan rebanadas de hipocampales del cerebro de animales extraídos.<ol>
<li>Deje que el frío cerebro de alrededor de 2 minutos Coloque un pedazo de papel de filtro en una placa de Petri llenas de hielo, transferir el cerebro en el papel de filtro. Diseccionar los dos hemisferios.</li>
		<li>Los hemisferios disecados (la orientación se determina por el objetivo experimental para obtener rebanadas de coronal, transversal u horizontal) del pegamento en una mesa de vibratome y sumergirlo en la bandeja de vibratome con helada ACSF oxigenada-sacarosa. Hacer 300-μm rodajas gruesas en una temperatura de aproximadamente 1 ° C utilizando un vibratome refrigerador o colocar el hielo alrededor de la bandeja de vibratome.</li>
		<li>Usando una brocha plana, se acumulan las rebanadas con el hipocampo (para 6 rebanadas por hemisferio) en un baño que contiene oxigenado ACSF-recuperación calentado a 37 ° C.</li>
		<li>Deja las rodajas en el baño de la ACSF-recuperación de al menos 45 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. celulares Patch-clamp grabaciones
<ol><li>Establecido una rebanada hipocampal en un baño colocado debajo del objetivo (aumento: 40 x, apertura numérica: 0.8) de un microscopio de dos fotones de escaneo láser. Continuamente inundar el baño con oxigenada ACSF Normal calentada a 30-32 ° C a una velocidad de 2,5-3 mL/min.</li>
	<li>Uso de contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) o microscopía Dodt-SGC para localizar una celda de interés mediante su tamaño, forma y posición. Nota: Dependiendo de la población de neuronas específicas, un modelo de ratón transgénico puede utilizarse para localizar fácilmente las células de interés. En este caso, este paso puede reemplazarse con el uso de una fuente de luz fluorescente.</li>
	<li>Llenar una pipeta de estimulación con una solución de la ACSF Normal que contiene el fluoróforo rojo (por ejemplo, Alexa-594).</li>
	<li>Establece la pipeta de estimulación (conectada a una unidad de estimulación eléctrica) encima de la rebanada para que la punta esté en la misma región que la celda de interés.</li>
	<li>Después de llenar la pipeta del parche con solución de parche y conectarlo a una fase principal, ponerlo sobre la rebanada de modo que su punta esté directamente sobre la célula de interés.</li>
	<li>Encaja una llave de tres vías con una jeringa y conéctela a la pipeta de parche a través del tubo plástico. Inyectar una presión positiva constante en la pipeta de parche (≈ 0,1 mL) utilizando la jeringa. Mantenga la llave de paso en posición "close".</li>
	<li>Activar el módulo de software de control de amplificador e interruptor al modo de pinza de voltaje haciendo clic en el botón "VC". Abra el software de adquisición de datos de electrofisiología (p. ej., clampex) para adquisición de señales electrofisiológicas y haga clic en el icono de "Prueba de membrana" que continuamente envía un pulso de voltaje cuadrado (5 mV, 10 ms), que es necesario controlar cambios en la resistencia de la pipeta.</li>
	<li>Baje la pipeta de parche hasta que está justo encima de la celda objetivo. Al hacer contacto con la membrana celular, retire la presión girando la llave hasta la posición "abierta". Nota: El contacto con la membrana celular se detecta cuando un pequeño aumento en la resistencia de la pipeta (≈ 0.2 MΩ) se ve y una pequeña hendidura en la célula es causada por la presión positiva.</li>
	<li>Aplicar una ligera presión negativa en la pipeta patch usando una jeringa de vacíela instalada en la llave de paso hasta que llegue a la resistencia de pipeta proporcionada por el software de 1 GΩ. En la ventana de 'Test de membrana' del software de adquisición de datos, fije la celda a -60 mV.</li>
	<li>Siga aplicando presión negativa hasta que la célula se abre y se logra la configuración de célula entera. Detección de este estado de la célula se basa en el cambio repentino en la resistencia de la pipeta (de 1 GΩ a MΩ 70-500 dependiendo del tipo de interneurona) y la aparición de grandes transitorios capacitivas en la ventana de 'Test de membrana'.</li>
</ol>4. dos fotones Ca2 + imagen
<ol><li>Si está interesado en las respuestas postsinápticas excitatorias, añadir el gabazine de bloqueador de receptor GABAA (10 μm) y el bloqueador de los receptores GABAB CGP55845 (2 μm) en el baño de la ACSF.</li>
	<li>En el módulo de software de control de amplificador, establecer la configuración de parche a pinza de corriente haciendo clic en el botón "CC" y registrar el patrón de la leña de la célula en respuesta a las inyecciones somáticas de la corriente de despolarización (0.8-1.0 nA, 1 s). Espere al menos 30 min para la célula que se llena de los indicadores presentes en la solución de parche. Nota: La celda patrón de disparo y propiedades activas se pueden utilizar para identificar el subtipo de la célula; por ejemplo, las células rápido disparando. Es importante para la concentración de indicador estabilizar a través de la difusión antes de comenzar a grabar gatos (ver tabla 2 para la solución de problemas).</li>
	<li>AP-evocado gatos<ol>
<li>Utilizando el software de adquisición de imagen, iniciar la adquisición de imágenes. Localizar una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja. Para asegurar una respuesta visible, primero, elegir una dendrita proximal (≤ 50 μm) como la eficiencia de AP backpropagation puede disminuir significativamente con la distancia de interneuronas GABAérgicas22.</li>
		<li>Utilizando la herramienta' rectangular' en el software de adquisición de imagen, zoom en la región de destinada y cambiar a la "xt" (linescan) modo. Posición la exploración a través de la rama dendrítica de interés. Con los controladores de intensidad del laser en el software de adquisición, establecer el régimen de dos fotones láser a un nivel de mínima energía donde la fluorescencia basal verde es poco visible, para evitar fototoxicidad.</li>
		<li>En el software electrofisiología de adquisición de datos software de adquisición de imagen y de ventana de 'Protocolo', crear un ensayo de grabación de la duración deseada que contenga una inyección actual somática de la amplitud deseada.<ol>
<li>Utilizando el software de adquisición de imagen, haga clic en el botón "Start record" y adquirir la fluorescencia continuamente durante 1-2 s. repetir la adquisición de la imagen 3 - 10 veces. Espere al menos 30 s entre exploraciones solo para evitar el fotoenvejecimiento. Si adquirir linescans en múltiples puntos a lo largo de una dendrita, llevarlos en orden aleatorio para evitar efectos de orden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCIS-evocado gatos<ol>
<li>Localizar una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja.</li>
		<li>Ponga la pipeta de estimulación sobre la superficie de la rebanada sobre la dendrita de interés. Baje lentamente la pipeta de estimulación en su lugar, reduciendo al mínimo movimiento para evitar alterar la configuración de célula entera. Coloque la pipeta en 10-15 μm de la dendrita.</li>
		<li>Para visualizar la ubicación de microdominios sináptica en las dendritas aspiny, en el software de adquisición de la imagen pase a la 'xt' (linescan) modo y posición de la línea a lo largo de la rama dendrítica de interés.</li>
		<li>En la ventana de 'Protocolo' (de software de adquisición de datos de electrofisiología) y software de adquisición de imagen, crear un estudio de grabación que activa la unidad de estimulación después del comienzo de la prueba.</li>
		<li>Utilizando el software de adquisición, haga clic en el botón "Start record" para explorar a lo largo de la dendrita continuamente para adquisición de repetir s. 1-2 3 - 5 veces, esperar 30 s entre exploraciones para prevenir el fotoenvejecimiento. Nota: La longitud de exploración puede ajustarse dependiendo de la cinética del evento evocado, pero debe reducirse para evitar el fotodaño (ver tabla 2 para la solución de problemas).</li>
		<li>Repita el paso 4.5.5 en diferentes condiciones (por ejemplo, diferente intensidad, longitud de la estimulación, la introducción de un bloqueador de farmacológico, etc.) dependiendo de la pregunta concreta que se aborda.</li>
		<li>Detener la adquisición cuando la célula muestra signos de deterioro de la salud: despolarización por debajo de -45 mV, aumento en la línea de base nivel de Ca2 + , deterioro morfológico de las dendritas (por ejemplo, el blebbing, fragmentación; ver tabla 2 para la solución de problemas).</li>
		<li>Para obtener información preliminar sobre la morfología de la célula y mantener un registro de la ubicación de la pipeta de estimulación, adquirir una Z -pila de la célula en el canal rojo. Utilizando el software de adquisición de 'xyz' modo, establecer los límites superior e inferior de la pila a toda la célula de la imagen con todos los procesos incluidos. La magnitud en 1 μm e iniciar la adquisición de la pila utilizando el botón "Iniciar registro".</li>
		<li>Cuando la Z-pila adquisición es completa, utilice la opción de "Proyección de la máxima" en el software para superponer todos los planes focales de la pila y Compruebe la calidad de la adquisición. Entonces, retraiga lentamente la pipeta del parche de la rebanada.</li>
		<li>Para corregir el slice para identificación morfológica post hoc , rápidamente retirar el segmento del baño utilizando un pincel plano y colocar entre dos papeles de filtro, en un plato de Petri llenas de ACSF. Vuelva a colocar la ACSF con una solución al 4% paraformaldehido (PFA) y dejar el plato en una habitación de 4 ° C o el refrigerador durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. inmunohistoquímica para Post Hoc identificación morfológica de las células registradas
Nota: Después de 1 noche de fijación en la PFA, el segmento puede almacenarse en tampón de fosfato (PB) con azida de sodio (0,5%) durante 1 mes.
<ol><li>Poner la rodaja en solución salina tamponada con Tris (TBS) con Triton X-100 (0.3%) y realizar 4 lavados (5-10 minutos cada uno).</li>
	<li>Poner la rodaja en TBS-Triton 0.3% con 10% de suero normal de cabra (NGS) durante 1 hora.</li>
	<li>Poner la rodaja en TBS-Triton 0.3% 1% NGS y un fluoróforo conjugado estreptavidina (p. ej., Alexa Fluor 546 conjugado estreptavidina, 1: 200) para la noche incubación.</li>
	<li>Lavar 4 veces (5-10 min) en TBS.</li>
	<li>Monte rebanadas en imagen con un microscopio confocal y microscopio. Para que una reconstrucción completa de la célula, adquirir un Z-stack (tamaño de paso: 1 μm) usando un objetivo de 20 x. Para una etiqueta de Alexa-546-conjugado de la proyección de imagen, uso que un 543 nm láser y una detección de 515-560 nm filtro establecido.</li>
</ol>6. Análisis de los gatos
<ol><li>Extraer los valores de fluorescencia de las regiones de interés (ROIs) en las imágenes de linescan de los canales rojo y verdes y promedio de los valores de las múltiples repeticiones para cada condición reducir el ruido. Nota: Cuando linescan adquisición se realiza a lo largo de la dendrita, es posible extraer datos de varios reyes, que pueden corresponder a microdominios dendríticas (2-5 μm), y permitiendo el estudio de la compartimentalización señal de Ca2 + .</li>
	<li>Cada ROI, expresan los cambios en el Ca2 + amplitud como: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> Nota: Aquí G es el valor de fluorescencia del canal verde; G0 es el valor de fluorescencia de línea de base del canal verde durante el período de estimulación previa; R es el valor de fluorescencia de la canal rojo18. Excitación de dos fotones es muy localizada y no genera un fondo importante, resta de la fluorescencia de fondo no es necesario.</li>
</ol>

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<li>Salomé, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li>
<li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li>
</ol>

Los autores tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de intereses.

El método que se muestra a continuación muestra cómo la combinación de dos fotones Ca2 + proyección de imagen y electrofisiología patch-clamp se puede utilizar para estudiar dendríticas Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo. Este método permite el control de ambos el local Ca2 + elevaciones evocadas por AP eléctrico de estimulación o backpropagating en segmentos dendríticos y la respuesta somática de la célula. Esta es una excelente herramienta para el estudio de...

La contribución de una neurona a la actividad de la red está determinada por la naturaleza dinámica de las entradas sinápticas que recibe. Tradicionalmente, el método predominante de caracterizar la actividad sináptica en las neuronas dependía de grabaciones somáticas celulares-abrazadera del remiendo de corrientes postsynaptic evocadas por la estimulación eléctrica de los axones de paso. Sin embargo, única actividad de la sinapsis situada proximally se divulga con la verdad en este caso1. Además, para evaluar los mecanismos específicos de la sinapsis, se han utilizado grabaciones de pares de neuronas y dendritas en un lugar específico a las sinapsis de interés y los mecanismos de integración dendrítica, respectivamente. Se logró un gran avance en el campo de la Fisiología sináptica a través de una combinación de técnicas ópticas y electrofisiológicas. Láser de excitación de dos fotones microscopía (2PLSM) en combinación con herramientas de optogenetic y Ca2 + la proyección de imagen puede revelar grandes detalles de la organización dinámica de la actividad sináptica en las conexiones neuronales específicas en rebanadas de cerebro en Vitro e in vivo.
Varias ventajas claves hecho 2PLSM sobresalen la excitación convencional, un fotón microscopia2: (1) debido al carácter no lineal de excitación de dos fotones, la fluorescencia se genera solamente en el volumen focal, y representan todos los fotones emitidos señales útiles (sin necesidad de agujero de alfiler); (2) más de largo longitudes de onda, utilizados en 2PLSM, penetran en el tejido de dispersión más eficiente; Además, los fotones dispersos son demasiado diluidos para producir la excitación de dos fotones y la fluorescencia del fondo; (3) fotoenvejecimiento y fototoxicidad también se limitan al plano focal. Por lo tanto, a pesar del alto costo de los sistemas 2-fotón en comparación con los microscopios confocales convencionales, la 2PLSM sigue siendo un método de elección para la investigación de alta resolución de la estructura neuronal y función en tejido grueso vivo.
El primer uso de 2PLSM en el tejido de dispersión fue la imagen de la estructura y función de espinas dendríticas3. 2PLSM en combinación con Ca2 + la proyección de imagen ha revelado esa función de espinas como compartimientos bioquímicos aislados. Ya que en muchos tipos neuronales existe una correspondencia biunívoca entre espinas y las sinapsis individuales4, dos fotones Ca2 + imagen pronto se convirtió en una útil herramienta de reporting de la actividad de las sinapsis individuales en el tejido intacto5, 6,7,8. Además, basado en la 2PLSM Ca2 + proyección de imagen fue utilizado con éxito para supervisar la actividad de los canales de calcio solo y las interacciones no lineales entre las conductancias intrínsecas y sinápticas, así como para evaluar el estado y actividad dependiente regulación de Ca2 + en las dendritas neuronales5,6,7,8,9,10,11.
El calcio es un segundo mensajero intracelular ubicuo y su organización espacio-temporal subcelular determina la dirección de las reacciones fisiológicas, de los cambios en fuerza sináptica a la regulación de iones canales, crecimiento de la dendrita y la columna vertebral, como así como la muerte celular y la supervivencia. Dendríticas Ca2 + elevaciones se producen mediante la activación de múltiples vías. Potenciales de acción (APs), backpropagating a las dendritas, abre voltaje-bloqueado calcio canales12 y producir a relativamente global Ca2 + transitorios (gatos) en las dendritas y espinas13. Transmisión sináptica se asocia con la activación de postsynaptic Ca2 +-permeables receptores (NMDA, Ca2 +-permeable al AMPA y kainato), activación sináptica gatos de14,6,15. Por último, pueden generarse supralinear Ca2 + eventos en dendritas bajo ciertas condiciones11,12,13,16.
Emplea dos fotones Ca2 + proyección de imagen en combinación con las grabaciones electrofisiológicas abrazadera del remiendo sintético Ca2 +-indicadores fluorescentes sensibles, que por lo general se entregan a través de los electrodos de parche durante grabaciones de celulares . Un método estándar para la cuantificación de la dinámica de Ca2 + se basa en el método de doble indicador17,18. Utiliza dos fluoróforos con espectros de emisión bien separados (p. ej., una combinación de un rojo Ca2 +-insensible tinta verde Ca2 + indicadores, tales como verde de Oregon BAPTA-1 o Fluo-4) y tiene varias ventajas en comparación con el método de indicador único. Primero, una Ca2 +-insensible tinte se utiliza para localizar pequeñas estructuras de interés (ramas dendríticos y espinas) donde se realizará la proyección de imagen de Ca2 + . En segundo lugar, la relación entre el cambio en la fluorescencia verde y rojo (ΔG/R) se calcula como una medida de la [Ca2 +], que es en gran parte insensible a los cambios en la fluorescencia basal debido a fluctuaciones en la [Ca2 +]017 , 18. por otra parte, cambios de fluorescencia pueden ser calibradas en términos de absoluta Ca2 + concentraciones19.
Una preocupación general cuando dos fotones Ca2 + de los experimentos en rebanadas agudos es celular salud y estabilidad de la adquisición de la imagen debido a la potencia del láser alta que normalmente se utiliza. Además, en experimentos de Ca2 + proyección de imagen, hay preocupación por la perturbación y considerable sobreestimación de subcelular Ca2 + dinámica debido a que los indicadores de Ca2 + actúan como móvil altamente exógeno Ca2 + almacenadores intermediarios. Por lo tanto, la elección del indicador de Ca2 + y su concentración depende del tipo neuronal, la amplitud esperada de gatos y de la pregunta experimental.
Adaptamos el método de dos fotones Ca2 + proyección de imagen para investigación de Ca2 + las fluctuaciones en las dendritas de GABAérgico interneuronas9,10,11,20,21 , 22. mientras que la mayor parte de los primeros Ca2 + imagen estudios se realizaron en las principales neuronas, inhibitorios interneurons mostrar una gran variedad de funciones Ca2 + mecanismos que son distintas a las de las células piramidales20 , 23 , 24. estos mecanismos específicos de interneurona (p. ej., Ca2 + permeable AMPA receptores) pueden desempeñar papeles específicos en la regulación de la actividad de la célula. Dendríticas Ca2 + en interneuronas es un objetivo tentador para la posterior investigación, dos fotones Ca2 + en las dendritas de estas células presenta desafíos adicionales, de un diámetro más fino de las dendritas y la falta de espinas para una particularmente alta Ca2 + vinculante capacidad endógena. Como nuestra investigación intereses se centran en el estudio de interneurons hippocampal, el siguiente protocolo, si bien aplicable a distintas poblaciones neuronales, fue adaptado para hacer frente a esos desafíos.
Este protocolo fue ejecutado con un microscopio confocal comercial de dos fotones, que fue equipado con dos detectores externos, no descanned (NDDs), modulador electro-óptico (MOE) y un Dodt exploración contraste degradado (SGC) e instalado sobre una mesa óptica. El microscopio fue juntado con un láser de TI: zafiro multifotón modo-bloqueado a 800 nm (> 3 W 140 pulsos de fs, tasa de repetición de 80 Hz). El sistema de proyección de imagen fue equipado con una plataforma de electrofisiología estándar, incluyendo una cámara de perfusión con control de temperatura, una plataforma de traducción con dos micromanipuladores, un amplificador controlado por ordenador del microelectrodo, un digitalizador, un estímulo unidad y software de adquisición de datos.

<table><tbody><tr><td>Cepa animal: Ratón CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 clorhidrato Abcam</td><td></td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído en polvo, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato de potasio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de Trizma&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico dihidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sodio monobásico monohidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td> Trifosfato de adenosina (ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td> Guanosina (GTP)-Na+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877<</td><td></td></tr><tr><td>br/> Verde Oregón BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td> Sal de fosfocreatina di(tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td> Alexa-546 conjugada con estreptavidina</td><td>Parche ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td> Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td> Theta Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Instrumento Sutter</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td> P-97 Tirador de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCS SP5 Microscopio multifotónico confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chameleon Ultra II Ti:Láser multifotónico de zafiro&nbsp;</td>Software <td>de</td> adquisición de imágenes LAS AF coherente <td></td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MultiClamp 700B Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1440A Digitalizador</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocal Traductor</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> pClamp Software de adquisición de datos</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> A365 Aislador de estímulo de corriente constante</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vibraplane Mesa óptica</td><td>Sistemas</td><td></td><td></td> cinéticos</tr></tbody></table>

proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Proyección de imagen de calcio (Ca2 +) es una herramienta poderosa para investigar la dinámica espacio-temporal de Ca2 + señales intracelulares en las dendritas neuronales. CA2 + las fluctuaciones pueden ocurrir a través de una variedad de membranas y mecanismos intracelulares y juega un papel crucial en la inducción de la plasticidad sináptica y la regulación de la excitabilidad dendrítica. Por lo tanto, la capacidad para registrar diferentes tipos de señales de Ca2 + en ramas dendríticas es valiosa para estudiar cómo las dendritas integran información de grupos. El advenimiento de la microscopía de dos fotones ha facilitado este tipo de estudios significativamente mediante la solución de los problemas inherentes a la proyección de imagen en tejido vivo, como la dispersión de la luz y fotodaño. Además, a través de la combinación de técnicas electrofisiológicas convencionales con dos fotones Ca2 + proyección de imagen, es posible investigar local Ca2 + las fluctuaciones en las dendritas neuronales en forma paralela a las grabaciones de la actividad sináptica en Soma. Aquí, describimos cómo utilizar este método para estudiar la dinámica de local Ca2 + transitorios (gatos) en las dendritas de las interneuronas inhibitorias GABAérgicas. El método puede ser aplicado también al estudio de dendríticas Ca2 + en diferentes tipos neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Utilizando el protocolo presentado aquí, obtuvimos gatos evocados por inyección actual somática y por estimulación eléctrica en las dendritas de las interneuronas oriens/alveus en el área CA1 del hipocampo. Después de remendar una neurona, identificada en su forma y posición base, hemos adquirido el linescans a través de una dendrita proximal en varios puntos en el dado Distancias desde el soma (figura 1A). Se observó una disminución en la amplitud de los gat...

Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

El objetivo general de este experimento es estudiar las elevaciones de calcio en las dendritas neuronales en respuesta a diferentes paradigmas de estimulación utilizando registros de patch-clamp de células completas en somas neuronales en paralelo con imágenes de calcio de dos fotones en dendritas. Este método se puede emplear para monitorear la señalización del calcio en pequeños compartimentos dendríticos, lo que permite una observación cercana de los procesos que ocurren en las ramas dendríticas durante la integración de las entradas sinápticas. La principal ventaja de esta técnica es que permite observar patrones de señalización de calcio con alta resolución espacio-temporal y especificidad.Coloque el cerebro del ratón en una placa de Petri que contenga sacarosa ACSF fría y oxigenada continuamente. Para preparar rodajas de hipocampo del cerebro extraído, deje que el cerebro se enfríe durante unos dos minutos. Luego, coloque un trozo de papel de filtro en una placa de Petri llena de hielo y transfiera el cerebro al papel de filtro.Luego, disecciona el cerebro en dos hemisferios. Pegue los hemisferios disecados en una plataforma de corte de vibratomo y sumérjala en la bandeja de corte llena de sacarosa ACSF oxigenada helada. A continuación, corte rodajas de 300 micrómetros de grosor a un grado centígrado utilizando un enfriador de vibrátomo o colocando el hielo alrededor de la bandeja de vibráto.Con un pincel, transfiera las rodajas que contienen el hipocampo a un baño de recuperación de ACSF oxigenado calentado a 37 grados centígrados. En este paso, transfiera una rebanada de hipocampo a un baño bajo el objetivo de un microscopio de dos fotones de escaneo láser. Perfundir continuamente el baño con ACSF-normal oxigenado.A continuación, utilice la microscopía de contraste de interferencia diferencial infrarroja para localizar una célula de interés utilizando su tamaño, forma y posición. A continuación, llene una pipeta estimulante con una solución ACSF-normal que contenga el fluoróforo rojo. Bájalo en la parte superior de la rebanada para que la punta esté en la misma región que la celda de interés.A continuación, llene la pipeta de parche con solución de parche y conéctela a la platina principal. Colóquelo sobre la rebanada de modo que su punta quede directamente encima de la celda de interés. A continuación, coloque una jeringa en la llave de paso de tres vías y conéctela a la pipeta de parche a través de un tubo de plástico.Inyecte presión positiva constante en la pipeta de parche y mantenga la llave de paso en posición cerrada. A continuación, abra el módulo de software de control del amplificador MultiClamp y cambie al modo Voltage Clamp haciendo clic en el botón VC. Abra el software de adquisición de datos electrofisiológico Clampex para registrar señales electrofisiológicas y haga clic en el icono de prueba de membrana para enviar un pulso de voltaje cuadrado constante para monitorear los cambios en la resistencia de la pipeta.Ahora, baje la pipeta de parche hasta que esté justo encima de la célula objetivo. Al entrar en contacto con la membrana celular, elimine la presión girando la llave de paso a la posición abierta. A continuación, aplique una ligera presión negativa a la pipeta de parche con una jeringa vacía instalada en la llave de paso hasta que la resistencia de la pipeta alcance un gigaohmio.En la ventana Prueba de membrana del software de adquisición de datos, fije la celda a menos 60 milivoltios. Continúe aplicando presión negativa hasta que la resistencia de la pipeta disminuya y se logre la configuración de celda completa. En el módulo de software de control del amplificador MultiClamp, establezca la configuración del parche en pinza amperimétrica haciendo clic en el botón IC y registre las propiedades de la membrana en respuesta a inyecciones somáticas de corrientes hiperpolarizantes y despolarizantes.Espere al menos 30 minutos para que la celda se llene con los indicadores presentes en la solución de parche. Para adquirir imágenes, localice una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja. Asegure una respuesta visible eligiendo una dendrita proximal de menos de 50 micrómetros, ya que la eficiencia de la retropropagación de AP puede disminuir significativamente con la distancia en las interneuronas GABAérgicas, y cambie al modo xt.Con los controladores de intensidad láser, configure el láser de dos fotones a un nivel de potencia mínimo donde la fluorescencia verde de referencia sea ligeramente visible, para evitar la fototoxicidad. A continuación, en la ventana de protocolo del software de adquisición de datos de electrofisiología Clampex y en el software de adquisición de imágenes, cree una prueba de registro de la duración deseada que contenga una inyección de corriente somática de la amplitud deseada. Después de eso, haga clic en el botón Iniciar grabación y adquiera la fluorescencia de forma continua durante uno o dos segundos.Repita la adquisición de la imagen de tres a 10 veces. Espere al menos 30 segundos entre exploraciones individuales para evitar el fotodaño. Para registrar los transitorios de calcio dendrítico inducidos por la estimulación eléctrica, localice una dendrita de interés utilizando la señal de fluorescencia roja.Coloque la pipeta estimulante en la superficie de la rebanada por encima de la dendrita de interés. Baje lentamente la pipeta de estimulación de 10 a 15 micrómetros de la dendrita, minimizando el movimiento para evitar perturbar la configuración de toda la célula. Para visualizar la ubicación de los microdominios sinápticos en las neuronas espinosas, en el software de adquisición de imágenes, cambie al modo xt y coloque la línea a lo largo de la rama dendrítica de interés.En la ventana Protocolo, cree una prueba de grabación que desencadene la estimulación. Con el software de adquisición, escanee a lo largo de la dendrita de forma continua durante uno o dos segundos. Repita la adquisición de tres a cinco veces, esperando 30 segundos entre exploraciones para evitar el fotodaño.Para obtener información preliminar sobre la morfología de la célula y mantener un registro de la ubicación de la pipeta de estimulación, adquiera una pila Z de la célula en el canal rojo. Usando el software de adquisición en modo xyz, establezca los límites de pila superior e inferior para crear una imagen de toda la celda con todos los procesos incluidos. A continuación, establezca el tamaño del paso en un micrómetro e inicie la adquisición de la pila con el botón Iniciar registro.Cuando se complete la adquisición de la pila Z, utilice la opción Proyección máxima en el software para superponer todos los planos focales de la pila y verificar la calidad de la adquisición. A continuación, retraiga lentamente la pipeta de parche para sacarla de la rebanada. Para fijar la rebanada para la identificación morfológica post hoc, retire rápidamente la rebanada del baño con un pincel y colóquela entre dos papeles de filtro en una placa de Petri llena de ACSF.Reemplace el ACSF con una solución de paraformaldehído al 4% y deje el plato a cuatro grados centígrados durante la noche. En esta figura, la proyección máxima de una pila Z de dos fotones muestra una interneurona parcheada llena de Alexa-594. Las puntas de flecha blancas señalan la ubicación de los terminales axonales dentro de la capa piramidal, lo que sugiere que la interneurona es una célula cesta.Esta figura muestra la rama dendrítica cerca de la cual se colocó el electrodo estimulador. La línea discontinua muestra la ubicación del escaneo de línea. Las imágenes aquí ilustran el resultado de un escaneo de línea en los canales rojo y verde.El aumento de la fluorescencia verde en el momento de la estimulación indica un aumento de la concentración de calcio en esa zona. Las imágenes se pueden agrupar en segmentos más pequeños, lo que permite el análisis de la propagación de la respuesta. Los trazos observados aquí muestran los transitorios de calcio provocados en diferentes segmentos en respuesta a la estimulación eléctrica registrados a nivel somático durante el ensayo de imagen.La amplitud de los transitorios de calcio disminuye con la distancia desde el punto caliente central, lo que indica que la respuesta está localizada espacialmente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes con colorantes sensibles al voltaje o la optogenética, para responder a preguntas adicionales, como los cambios locales en el potencial de memoria dentro de las ramas dendríticas o la integración de entradas específicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo monitorear las fluctuaciones de calcio dependientes de la actividad en las dendritas neuronales utilizando una combinación de técnicas optofisiológicas, que serán útiles para explorar las complejidades de la integración y la plasticidad de la entrada dendrítica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

La actividad espontánea de la creación de redes neuronales se puede medir con AM-éster formas de tintes indicadores sensibles de calcio. Cambios en el calcio intracelular, lo que indica la activación neuronal, se detectan los cambios transitorios de la fluorescencia con un indicador o imagen de dos fotones. Este protocolo puede ser adaptado para una serie de redes neuronales del desarrollo que dependen...

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

En este protocolo, actualizamos los recientes avances en imágenes...

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Una técnica de imagen para el monitoreo de los cambios de potencial de membrana con una resolución temporal sub-micrométrico espacial y sub-milisegundos es descrito. La técnica, basado en una excitación láser de colorantes sensibles a voltaje, permite realizar mediciones de señales en los axones y colaterales axónicas, ramas terminales individuales dendríticas, y las espinas dendríticas.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Este video muestra un protocolo para el registro de patch-clamp de células completas e imágenes de calcio de dos fotones en cortes de hipocampo cerebral. Este método permite estudiar la dinámica de los transitorios locales de Ca2+ (CaTs) en dendritas de diferentes tipos neuronales en cortes cerebrales agudos.

Establecimiento de una configuración de célula completa para la obtención de imágenes de calcio de dos fotones de cortes de cerebro

Se describen procedimientos para realizar registros simultáneos del potencial o corriente de membrana y los cambios en la concentración de calcio intracelular. Las neuronas del núcleo supraquiasmático se llenan con el indicador de calcio bis-fura-2 mediante un electrodo de pinza de parche en la configuración de pinza de parche de toda la célula.

Registro electrofisiológico simultáneo e imágenes de calcio de neuronas del núcleo supraquiasmático

Las imágenes de lapso de tiempo en el animal vivo proporcionan información valiosa sobre la reorganización estructural en el cerebro intacto. Aquí, presentamos una preparación de cráneo adelgazado que permite la obtención de imágenes transcraneales de estructuras sinápticas marcadas con fluorescencia en la corteza del ratón vivo mediante microscopía de dos fotones.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

Se describe la combinación de focal foto-activación inducida por UV de compuestos neuroactivos con células enteras patch-clamp y las imágenes de múltiples fotones de los transitorios de sodio intracelulares en dendritas y espinas de las neuronas del hipocampo en cortes de tejido agudas del cerebro de ratón.

Multi-fotón intracelular de sodio Imaging Combinado con Desembalado focal UV-mediada de glutamato en las neuronas CA1 Piramidal

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Aprende a registrar transitorios de calcio en dendritas neuronales mediante imagen de dos fotones combinada con técnicas de patch-clamp en rebanadas de cerebro de ratón. Este método permite estudiar la integración sináptica con alta resolución espaciotemporal.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

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