Disección y la coloración de los ovarios Pupal de Drosophila

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar y teñir los ovarios de Drosophila pupa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo de la biología, como las relacionadas con la diferenciación de células madre y el desarrollo de tejidos en el organismo modelo drosophila. La principal ventaja de esta técnica es que se utilizan herramientas personalizables para adaptarse al pequeño tamaño y la naturaleza translúcida de los ovarios de la pupa, que de otro modo serían difíciles de aislar.

Tuvimos la idea de usar su método cuando realizamos experimentos de curso de tiempo, para rastrear la división de células madre en el ovario durante el desarrollo de la drosophila pupa. Para comenzar el protocolo, combine 10 moscas Drosophila adultas macho y 15 hembras, en un vial de alimento para moscas rico normal suplementado con levadura. Deje que los huevos se conviertan en larvas a temperatura ambiente durante tres o cuatro días.

Después de tres o cuatro días, use un cepillo fino húmedo con cerdas suaves para hacer un movimiento giratorio con el cepillo a lo largo de la pared del vial, para transferir las larvas errantes del tercer estadio, del vial a un pocillo de vidrio, lleno hasta el borde con solución salina tamponada con fosfato 1X o PBS. Lave los restos de comida de las larvas, transfiriéndolos a otro pozo lleno de 1X PBS. Separe las larvas masculinas y femeninas con pinzas.

Identifique las larvas masculinas por un par de testículos grandes, redondos y translúcidos incrustados en el cuerpo graso en el lado lateral dos tercios hacia abajo de su extremo anterior. Luego recoja al menos 10 hembras del pozo y coloque las larvas femeninas en un pozo separado, lleno de 1X PBS. Use fórceps para transferir las larvas femeninas suavemente a un nuevo frasco de alimento fresco para moscas suplementado con levadura.

Coloque el frasco con las larvas femeninas en un lugar oscuro para facilitar la puparición. A lo largo del día, controle las larvas para ver si están infectadas. A medida que cada larva se lobaliza y se convierte en una pre-pupa, encierre la prepupa contra el frasco y registre el momento aproximado en que se convierte por primera vez en una prepupa.

Derrita la punta de vidrio de una pipeta molesta sobre un mechero Bunsen. A medida que el vidrio se derrite, use pinzas para separar la punta horizontalmente del resto de la pipeta para formar una punta más delgada. Después de enfriar, rompa una pequeña porción de la punta de la pipeta para formar una abertura circular ordenada.

Coloque una pera en el otro extremo de la pipeta y cargue la pipeta con 1X PBS. Para recolectar las pupas pegadas a la pared del vial, aplique una pequeña gota de agua a lo largo de la zona de contacto entre la pupa y el vial. Después de dejar que el pegamento proteico se disuelva durante uno o dos minutos, levanta suavemente la pupa de la pared con un cepillo fino y húmedo.

Transfiera una sola pupa por pocillo lleno con 1X PBS. Mientras agarra el extremo posterior de la pupa con un par de pinzas, rasgue cuidadosamente la porción anterior de la caja de la pupa con otro par hasta que la cabeza de la pupa sea visible. Agarra la punta más anterior de la cabeza de la pupa con pinzas y saca suavemente la pupa de su estuche.

A continuación, separe y deseche la mitad anterior de la pupa de la mitad posterior hasta que solo quede el saco abdominal. Sujete el saco abdominal contra el fondo del pocillo con pinzas en una mano, mientras sostiene la pipeta de vidrio delgada llena de PBS 1X en la otra mano. Dirija la punta fina de la pipeta hacia la abertura del saco y pipetee lentamente 1X PBS en el abdomen para eliminar las células grasas del cuerpo que rodean los ovarios de la pupa.

Lave las células del cuerpo graso hasta que al menos dos tercios del cuerpo graso hayan desaparecido, o hasta que los ovarios sean visibles cerca de la abertura del saco abdominal. Si los ovarios no son visibles dentro del pozo, deberían haber permanecido en el abdomen. Si los ovarios han salido, coloque una nueva pupa en el pocillo y repita este paso.

Transfiera el abdomen a una cámara de vidrio transparente cubierta llena de tampón de fijación y coloque la tapa encima. Diseccionar más ovarios de los necesarios para asegurarse de que haya suficientes ovarios en pie durante el proceso de tinción y montaje. A lo largo del proceso de tinción, use fórceps para empujar suavemente hacia abajo los ovarios flotantes hasta el fondo del pozo de vidrio cubierto para asegurarse de que los ovarios estén completamente sumergidos en la solución de anticuerpos.

Coloque tiras de cinta adhesiva de doble cara sobre la superficie plana del nuevo título y luego coloque el cubreobjetos con cámara que contiene los ovarios y el tampón de fijación en la superficie adhesiva. Incubar los ovarios en tampón de fijación durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, enjuague los ovarios tres veces en 1X PBS con 1% Triton X-100 o 1% PBST durante cinco, 10 y 45 minutos respectivamente, para permitir una permeabilización completa.

Bloquee los ovarios en suero de cabra normal al 10 % en 0,5 % PBST durante 30 minutos. A continuación, incubar los ovarios durante la noche en 600 microlitros de anticuerpo primario al 0,5% PBST al 4% Celsius. Al día siguiente, enjuague los ovarios tres veces durante cinco minutos cada una con 0,5% de PBST.

Incubar los ovarios durante dos horas en 600 microlitros de anticuerpo secundario diluido en 0,5% PBST a temperatura ambiente. Después de la incubación, enjuague los ovarios dos veces durante cinco minutos en 0.5%PBST y una vez durante cinco minutos en 1X PBS. Coloque una pequeña gota de 1X PBS en un portaobjetos de microscopio.

Use fórceps para transferir el saco abdominal del cubreobjetos con cámara a un vaso lleno de 1x PBS. Separe el saco abdominal y cualquier resto de cuerpo graso con pinzas. Transfiera los ovarios del pocillo a una gota de 1x PBS en el portaobjetos del microscopio agarrando el centro de los ovarios entre las puntas de las pinzas.

Agregue unas gotas de 1X PBS al portaobjetos cuando la solución se seque. Una vez que se hayan diseccionado todos los ovarios y se hayan transferido al portaobjetos del microscopio, pipetee 40 microlitros de medio de montaje en un cubreobjetos de 22 x 22 milímetros y coloque el cubreobjetos suavemente sobre los ovarios. Finalmente, deje que el portaobjetos se seque durante la noche antes de tomar imágenes.

La inmunohistoquímica específica de la proliferación celular, como la tinción de fosfohistona H3, se puede utilizar para estudiar los patrones de división celular de las células madre y otros tipos de células mitóticamente activas. Las células del tallo de la pupa derivadas de las células del enjambre se pueden delinear con la tinción con Faspectlina III. Al intentar este procedimiento, es mejor recolectar y diseccionar más PB del necesario para el experimento, dado que algunos ovarios pueden perderse durante la extracción del cuerpo graso o el proceso de inmunohistoquímica.

Gracias por mirar y buena suerte con el experimento.