Name: Para la medición cuantitativa de la proteína precursora del amiloide mediada por γ-secretasa y muesca hendidura en plataformas de ensayo reportero luciferasa basadas en células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprende a cuantificar la actividad de γ-secretasa mediante ensayos reporteros de luciferasa en células NG y CG. Este método permite identificar moduladores específicos de sustrato para avanzar en terapias contra la enfermedad de Alzheimer.

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Los autores agradecen las instalaciones centrales del Instituto de celular y biología organísmica, Academia Sinica, soporte técnico. Este estudio fue apoyado por el Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán (más 103-2320-B-001-016-MY3 a Y.-F. L.), el programa de innovación aplicada de desarrollo biofarmacéutico – tecnología de eje de plataforma de apoyo régimen (NP7 a F.L. Y.) y Academia Sinica (a Y.-F.L.).

1. medición de las señales de reportero de luciferasa, que corresponden al escote de la γ-secretasa de aplicación-C99 o NΔE
Nota: Consulte las publicaciones anteriores para descripciones detalladas de la generación de CG y NG células20,21.
<ol><li>
Semilla de células NG o CG (20, 000 células/pocillo) en microplacas de 96 pocillos en un volumen final de 200 μL/pozo en medio del crecimiento que se compone de modificado Eagle Medium (DMEM) más 10% suero bovino fetal de Dulbecco (FBS), 5 μg/mL blasticidin, antibiótico de 250 μg/mL (p. ej. zeocin) y 200 de μg/mL higromicina B.
	<ol>
<li>Contar celdas con un hemocitómetro.</li>
		<li>Transferir las placas a una humidificado incubadora de CO2 e incubar a 37 ° C durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saque 100 μL de medio de crecimiento de cada pozo.</li>
	<li>Añadir 100 μL/pocillo de crecimiento mediano contiene 2 μg/mL tetraciclina con cualquiera 0.2% dimetil sulfóxido (DMSO), 2 μM CL-387.785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) u otros relacionados con inhibidores de ErbB1/ErbB2.</li>
	<li>Incubar células tratadas CG o NG en microplacas a 37 ° C durante 24 h.</li>
	<li>Quitar medio 150 μL/pocillo de microplacas.</li>
	<li>Añadir 50 μL/pocillo luciferase ensayo reactivo (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>
Transferencia de las microplacas para un lector de microplacas de luminiscencia.
	<ol>
<li>Mantener las placas a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación suave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinar la luciferasa de luciérnaga (FL)-emite luminiscencia con un programa predefinido almacenado en el lector de microplacas de luminiscencia.
	<ol>
<li>Abra el software de control del instrumento (véase Tabla de materiales para obtener detalles del instrumento).</li>
		<li>En el menú de 'Herramientas', seleccione 'Luminometry'.<ol>
<li>Bajo los parámetros ' no elegir 'filtro' para filtro de emisión, tick 'Normal' para la apertura de la emisión, entre '1' para contar el tiempo y haga clic en 'OK' para configurar la lectura de la luminescencia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>En la pestaña 'Control' del instrumento, desplácese por la lista de protocolos activos y seleccionar el protocolo previamente almacenado para la lectura de la luminescencia.</li>
		<li>En la pestaña 'Pantalla en vivo', definir la escala de la lista desplegable y seleccione 'Logaritmo' o 'Lineal' para el tipo.</li>
		<li>En la pestaña de 'Temperatura', seleccione 'Off' para la calefacción de la placa.</li>
		<li>Haga clic en el botón 'Start' para realizar la lectura de la luminescencia.</li>
		<li>Según sea necesario, exportar los resultados en un formato de hoja de cálculo utilizando el 'Explorer' integrado en el software de control.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cuantificación de la actividad de la γ-secretasa
<ol><li>
Definir una señal de la luminiscencia emitida por CG o células NG tratadas con 0,1% de DMSO en un medio que contiene 1 μg/mL tetraciclina solamente como actividad de γ-secretasa relativa de 100%.
	<ol>
<li>Estimar luminiscencia fondo de células CG o NG tratando las células con medio de cultivo que incluyen tetraciclina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalizar luciferase señales de CG o NG células que son cultivadas con medio de cultivo que contiene 1 μg/mL tetraciclina y cualquiera 1 μM CL-387.785 o 1 μM de DAPT con la señal de luciferase emitido por CG tratados con DMSO o NG células (100% actividad de relativa γ-secretasa, como definido en el punto 2.1).</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li>
<li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/18/3157">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li>
<li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer%27s+disease%3A+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li>
<li>Citron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+strategies+for+disease+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: strategies for disease modification.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).</li>
<li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer%27s+disease%3A+regulation%2C+cell+biology%2C+function%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li>
<li>Parks, A. L., Curtis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+diversifies+its+portfolio%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Presenilin diversifies its portfolio.</a> Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).</li>
<li>Kukar, T. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18548070">Substrate-targeting gamma-secretase modulators.</a> Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).</li>
<li>Kounnas, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gamma-secretase+reduces+beta-amyloid+deposition+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).</li>
<li>Thathiah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+G+protein-coupled+receptor+3+modulates+amyloid-beta+peptide+generation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons.</a> Science. 323 (5916), 946-951 (2009).</li>
<li>Flajolet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid-beta+formation+by+casein+kinase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).</li>
<li>Eisele, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gleevec+increases+levels+of+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+and+of+the+amyloid-beta+degrading+enzyme+neprilysin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin.</a> Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-secretase+activating+protein+is+a+therapeutic+target+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease.</a> Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).</li>
<li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+substrates+of+presenilin%2Fgamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li>
<li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163%2C+a+Potent%2C+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li>
<li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+%28GSI-953%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li>
<li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15(2008).</li>
<li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).</li>
<li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+small+molecular+%28D%29-leucinamides+as+potent%2C+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li>
<li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha%2C+interleukin-1beta%2C+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li>
<li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li>
<li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li>
<li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li>
<li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li>
<li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li>
<li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer%27s+Disease+Patients%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los resultados prometedores de un ensayo de 1b de fase de aducanumab la inmunoterapia para el anuncio han establecido firmemente el papel crítico de Aß en la patogenesia del anuncio22 y sugieren que los enfoques anti-Aß siguen siendo una estrategia viable para el desarrollo de fármacos anti-AD. Aquí, describimos ensayos basadas en células para la cuantificación de proteólisis catalizada por γ-secretasa de aplicación-C99 y NΔE utilizando sistemas de reportero de luciferasa de luciérnaga. APP-C99 y ...

Los formas de amiloide-β (Aβ) se creen que la causa primaria de la neurodegeneración en los cerebros de pacientes que sufren de enfermedad de Alzheimer (EA)1. Péptidos Aβ se producen por el paso a paso clivaje de la proteína precursora de amiloide (APP), primero por la β-secretasa y luego por la γ-secretasa2. En la última década, enfoques terapéuticos hacia el tratamiento de la EA se han centrado en la prevención de la producción de Aß3. La mayoría de los estudios se ha centrado en ambos el aumento de la actividad de la α-secretasa, que puede impedir la γ-secretasa escote de aplicación y disminuir así la producción de Aß y la inhibición de la γ-secretasa β-y/o actividades4. Desafortunadamente, la inhibición no selectiva de β o γ secretases resultados inevitables efectos secundarios son debido a la interferencia con el funcionamiento de otros substratos fisiológicos de β - y γ-secretasa5,6. Con respecto a los inhibidores de γ-secretasa, recientes estudios han reportado el descubrimiento de una serie de moduladores químicos y genéticos que regulan la producción de Aß y ejerciendo efectos insignificantes en el proceso esencial γ-secretasa-mediada de la muesca7 ,8,9,10,11,12, sin embargo, exitosa terapéutica aún no se han desarrollado. Por lo tanto, más sistemáticas pantallas están garantizados para descubrir nuevos modificadores genéticos y químicos que pueden modular selectivamente la γ-secretasa-mediada por el procesamiento de APP.
Γ-secretasa se sabe allegarse más de 90 diferentes proteínas ancladas a membrana. Entre estos sustratos es de clase, cuya actividad es fundamental para determinar el destino celular y diferenciación durante el desarrollo de13. Modulación selectiva aplicación de γ-secretasa-catalizada de procesamiento en ausencia de afectar la muesca procesamiento será esencial para reducir al mínimo muesca efectos secundarios de los inhibidores de γ-secretasa, y esta selectividad se cree que un factor primario que determinan la eficacia biológica de posibles moduladores de la γ-secretasa para el tratamiento crónico de AD. Ha habido una serie de derivados arylsulfonamide, como GSI-953 (begacestat) y BMS-708163 (avagacestat), que se han encontrado para exhibir potente y selectiva inhibición de la γ-secretasa14,15. Un estudio anterior ha demostrado que la inhibición diferencial de γ-secretasa hendidura del APP y muesca puede observarse utilizando un ensayo ELISA basado en combinación con validación en vivo utilizando el pez cebra16. Además, se han establecido paradigmas de análisis basadas en células para tratar la posible selectividad de substrato de γ-secretasa hacia la aplicación y muesca17,18. Utilizando protocolos similares a los descritos en este documento, recientemente hemos descubierto una nueva clase de (D)-leucinamides que potentemente modulan γ-secretasa hendidura del APP con muesca-escasamente selectividad19. En conjunto, esta colección de estudios proporciona una prueba de concepto apoyando la idea de que la selectividad del sustrato/disponibilidad de γ-secretasa puede ser objeto de modulación química y verificación experimental. Sin embargo, estas plataformas de ensayo a menudo dependen relativamente bajo rendimiento lecturas y enfoques que requieren mucho trabajo que no podrían cumplir con las normas industriales programas de descubrimiento de drogas.
Recientemente hemos generado ensayos de genética de reportero luciferasa basado en la célula que pueden determinar cuantitativamente la actividad catalítica de la γ-secretasa hacia dos sustratos diferentes, lo aminoácidos 99 fragmento c-terminal ácido de APP (APP-C99) y el extracelular eliminar dominio péptido de muesca (NΔE). APP-C99 y NΔE han sido ampliamente utilizados como sustratos directos de γ-secretasa en varios ensayos. Para generar ensayos de genética de reportero luciferasa homogénea y consistente para la hendidura de la γ-secretasa de aplicación-C99 o NΔE, hemos generado una línea de células estable HEK (CG) que expresa constitutivamente un Gal4 impulsado por el promotor firefly luciferase reporter ( Gal4-Luc) y proteína de la fusión de Gal4/VP16-etiquetada APP-C99 (C99-GV). Además, generamos otra línea de células estable HEK (NG) que expresa constitutivamente Gal4-Luc y Gal4/VP16-con la etiqueta NΔE (NΔE-GV). Utilizando estos ensayos de novela sustrato específico γ-secretasa, ahora proporcionan un método para cuantificar y para distinguir la actividad catalítica de la γ-secretasa hacia distintos sustratos (APP-C99 en células CG), o NΔE en las células de NG. Por otra parte, los ensayos de sustrato específico γ-secretasa fueron diseñados para ser propicio a plataformas de proyección de alto contenido. Estos ensayos recién generado γ-secretasa podrían allanar el camino para el descubrimiento de los moduladores de la novela de γ-secretasa que podría mejorar la función cognitiva mediante la supresión de producción de Aß sin producir inhibición de muesca indeseable para el tratamiento de última generación de AD.

<table><tbody><tr><td>Lector de placas de luminiscencia VictorLight</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0010</td><td></td></tr><tr><td>Clase II, Tipo 2 Cabina de seguridad biológica</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>CL-387,785</td><td>EMD Calbiochem</td><td>233100-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>565770</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12100046</td><td>principal componente del medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina B</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805 Microplaca Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>de 96 pocillos</td><td>Nunc</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de ensayo de luciferasa Steady-Glo</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 humidificada</td><td>Revco</td><td>Ultima II</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular T-REx293</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td></td></tr><tr><td>Wallac 1420 software versión 3.0</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>software de control de instrumentos del lector de microplacas de luminiscencia</td></tr></tbody></table>

para la medición cuantitativa de la proteína precursora del amiloide mediada por γ-secretasa y muesca hendidura en plataformas de ensayo reportero luciferasa basadas en células

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

Hemos desarrollado un par de ensayos de gen reportero basadas en células para medir cuantitativamente la γ-secretasa escote de distintos sustratos. Este manuscrito describe los procedimientos que pueden utilizarse para monitorizar la γ-secretasa-mediada por hendidura del APP-C99 o muesca, utilizando un sistema de Gal4 impulsado por el promotor firefly luciferase reportero. Estos ensayos fueron establecidos por estable Co transfectar las células HEK293 con el gen reportero de luciferasa Gal4-conducido y el fragmento de Gal4/VP16-etiquetadas C-terminal de APP (APP-C99; Células del CG), o el Gal4/VP16-tagged muesca-ΔE (NΔE; Células de NG). Mediante estos ensayos reportero en paralelo, hemos demostrado que un inhibidor ErbB2, CL-387.785, preferentemente puede suprimir la γ-secretasa hendidura del APP-C99 en células del CG, pero no NΔE en las células de NG. Las respuestas diferenciales exhibidas por las células del centro de gravedad y NG, con CL-387.785, representan una característica preferida para moduladores de la γ-secretasa, y estas respuestas están en marcado contraste con la pan-inhibición de la γ-secretasa inducida por DAPT. Nuestros estudios proveen evidencia directa que las actividades de la γ-secretasa hacia diferentes sustratos pueden diferenciarse en un contexto celular. Estos nuevos ensayos por lo tanto pueden ser herramientas útiles en el descubrimiento de fármacos para mejorar terapias de AD.

Inhibición de ErbB2 por CL 387.785 diferencialmente puede promover el proceso de aplicación-C99 por Γ -secretasa sin afectar el escote de la muesca Para establecer un ensayo basado en la célula que puede medir cuantitativamente el clivaje proteolítico de un substrato determinado γ-secretasa, generamos la línea celular CG HEK293 derivado por la transfección estable Co de un tetracycline inducible C-terminal Gal4/VP16-tagged APP-C99 y un...

Hemos generado con éxito dos ensayos de sustrato específico γ-secretasa. Ambos ensayos celulares presentados aquí están diseñados para cuantificar las actividades enzimáticas de la γ-secretasa a través de la salida de los reporteros de luciferasa de luciérnaga.

Para la medición cuantitativa de la proteína precursora del amiloide mediada por γ-secretasa y muesca hendidura en plataformas de ensayo reportero luciferasa basadas en células

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

El objetivo general de este ensayo cuantitativo de genes reporteros basados en células para la gamma-secretasa es examinar el efecto diferencial de los moduladores putativos de la gamma-secretasa en la escisión mediada por la gamma-secretasa. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de la enfermedad de Alzheimer, como la identificación de nuevos moduladores de la gamma-secretasa para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. La ventaja de esta técnica es que es un sistema de ensayo altamente eficiente y puede identificar fácilmente los moduladores de la gamma-secretasa.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer a través del descubrimiento potencial de fármacos anti-EA con efectos secundarios mínimos. Este método puede proporcionar información sobre la selectividad del sustrato de la gamma-secretasa. También se puede aplicar a los estudios de otras enfermedades, como el neuroblastoma.Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades con la eliminación cuidadosa y la adición de medios de cultivo celular a la microplaca 96, ya que demasiada perturbación puede complicar los resultados fi

quantitative-measurement-secretase-mediated-amyloid-precursor-protein

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Este video muestra el procedimiento de medición de la actividad de la γ-secretasa en células humanas modificadas genéticamente utilizando un sistema inducible por tetraciclina. El proceso consiste en inducir la expresión génica de APP con tetraciclina, generar péptidos β amiloide y activar la producción de luciferasa. A continuación, se mide la bioluminiscencia resultante de la reacción luciferasa-sustrato, reflejando la actividad de la γ-secretasa.

Ensayo de luciferasa para medir la actividad de la γ-secretasa en células humanas

El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.

Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

La transferencia de célula a célula de agregados de proteínas, o semillas proteopáticas, puede ser la base de la progresión de la patología en las enfermedades neurodegenerativas. Aquí, se describe un nuevo ensayo de citometría de flujo FRET que permite la detección específica y sensible de la actividad de siembra a partir de muestras recombinantes o biológicas.

Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

Este informe describe protocolos para medir las tasas de degradación de proteínas mal plegadas mediante Western blot o ensayos basados en fluorescencia. Los métodos se pueden aplicar al análisis de otras proteínas mal plegadas y para el cribado de alto rendimiento.

Los ensayos para la degradación de proteínas en células de mal plegadas

Se describe un método para cuantificar la agregación de proteínas mal plegadas. Nuestros detalles del protocolo lentivirales inducida por generación de línea celular estable, proyección de imagen confocal automatizado y análisis de imágenes de agregados proteicos. Como una aplicación ilustrativa, se estudió el efecto de pequeñas moléculas en la promoción de la agregación de SOD1 en una forma dependiente de dosis y tiempo.

Desarrollo de ensayos para cuantificación de contenido alto de Sod1 mutante de la proteína total formación en células vivas

Existe una demanda para hacer clínico pruebas de una nueva clase de fármacos "huérfanos" llamadas chaperonas farmacológicas reproducible, rápida y eficiente. Desarrollamos un análisis basado en la cultura de célula simple, altamente estandarizados y versátil a pantalla para pacientes elegibles así como chaperonas farmacológicas novela drogas.

In Vitro Medición de la enzima a prueba chaperonas farmacológicas respuesta de Fabry y la enfermedad de Pompe

La proyección de imagen molecular con láser asistida por matriz basada en desorción/ionización de espectrometría de masas (MALDI-IMS) permite la asignación simultánea de múltiples analitos en muestras biológicas. Aquí, presentamos un protocolo para la detección y visualización de la proteína β amiloide en los tejidos cerebrales de la enfermedad de Alzheimer y las muestras de la Angiopatía amiloide cerebral usando MALDI-IMS.

Visualización de depósitos β amiloide en el cerebro humano con desorción láser asistida por matriz/ionización del Spectrometry total de la proyección de imagen

Este protocolo presenta un método para evaluar la actividad proteolítica de una proteasa de rotación intrínseca baja actividad, solo en un contexto celular. Específicamente, este método se aplica para evaluar la actividad proteolítica de PCSK9, un factor clave del metabolismo de los lípidos cuya actividad proteolítica se requiere para su última función hipercolesterolémicos.

Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa PCSK9

Este protocolo describe cómo realizar ensayos rápidos de luciferasa de bajo costo a rendimiento medio utilizando una Gaussia luciferase ligada a la insulina como un proxy para la secreción de insulina de células beta. El ensayo se puede realizar con la mayoría de los lectores de placas de luminiscencia y pipetas multicanal.

Medición de la secreción relativa de insulina mediante un sustituto de la Luciferase co-secretada

Este protocolo explica cómo medir el efecto de la variación genética asociada con los trastornos del neurodesarrollo sobre la actividad de la enzima desubiquitilante mediante la combinación de la purificación de proteínas recombinantes con ensayos de escisión de la cadena de ubiquitina.

Medición de la actividad enzimática de las enzimas desubiquitilantes asociadas a trastornos del neurodesarrollo mediante un ensayo de escisión de la cadena de ubiquitina in vitro

Aquí, describimos un sistema de levadura que reconstituye la γ-secretasa humana. Este sistema permite la identificación y el estudio de las mutaciones que afectan a la actividad y el cribado de los inhibidores de la γ-secretasa (GSIs). Utilizando las propiedades de pérdida de función de los mutantes familiares de la enfermedad de Alzheimer, es posible detectar moduladores de la γ-secretasa (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modelos de la enfermedad de Alzheimer para detectar genes, mutaciones y sustancias químicas que afectan la producción de beta amiloide por γ-secretasa

Aprende a cuantificar la actividad de γ-secretasa mediante ensayos reporteros de luciferasa en células NG y CG. Este método permite identificar moduladores específicos de sustrato para avanzar en terapias contra la enfermedad de Alzheimer.

Para la medición cuantitativa de la proteína precursora del amiloide mediada por γ-secretasa y muesca hendidura en plataformas de ensayo reportero luciferasa basadas en células (Video) | JoVE Journal

Para la medición cuantitativa de la proteína precursora del amiloide mediada por γ-secretasa y muesca hendidura en plataformas de ensayo reportero luciferasa basadas en células

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