Para la medición cuantitativa de la proteína precursora del amiloide mediada por γ-secretasa y muesca hendidura en plataformas de ensayo reportero luciferasa basadas en células

El objetivo general de este ensayo cuantitativo de genes reporteros basados en células para la gamma-secretasa es examinar el efecto diferencial de los moduladores putativos de la gamma-secretasa en la escisión mediada por la gamma-secretasa. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de la enfermedad de Alzheimer, como la identificación de nuevos moduladores de la gamma-secretasa para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. La ventaja de esta técnica es que es un sistema de ensayo altamente eficiente y puede identificar fácilmente los moduladores de la gamma-secretasa.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer a través del descubrimiento potencial de fármacos anti-EA con efectos secundarios mínimos. Este método puede proporcionar información sobre la selectividad del sustrato de la gamma-secretasa. También se puede aplicar a los estudios de otras enfermedades, como el neuroblastoma.

Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades con la eliminación cuidadosa y la adición de medios de cultivo celular a la microplaca 96, ya que demasiada perturbación puede complicar los resultados finales. Comience este procedimiento con la preparación de las células NG y CG, como se menciona en el protocolo de texto. Cuente las células NG o CG con un hemocitómetro.

A continuación, siembre las células a 20.000 células por pocillo en microplacas de 96 pocillos a un volumen final de 200 microlitros por pocillo en medio de crecimiento. Transfiera las microplacas a una incubadora de dióxido de carbono humidificado e incube a 37 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación durante la noche, retire 100 microlitros de medio de crecimiento de cada pocillo.

Agregue 100 microlitros por pocillo de medio de crecimiento que contenga dos microgramos por mililitro de tetraciclina con 0.2% de dimetilsulfóxido, dos micromolares CL-387, 785, dos micromolares TAPT u otros inhibidores relacionados de ErbB1/ErbB2. Incubar las células tratadas y las microplacas a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, retire 150 microlitros por pocillo de medio de crecimiento de las microplacas.

A continuación, añada 50 microlitros por pocillo de reactivo de ensayo de luciferasa. A continuación, transfiera las microplacas a un lector de microplacas de luminiscencia y manténgalas a temperatura ambiente durante cinco minutos. Determine la luminiscencia emitida por la luciferasa de luciferasa de luciérnaga utilizando un programa predefinido almacenado en el lector de microplacas de luminiscencia.

Primero, abra el software de control de instrumentos. A continuación, en el menú Herramienta, seleccione Luminometría. En la configuración de Parámetros, elija Sin filtro para el filtro de emisión, marque Normal para la apertura de emisión, ingrese uno para contar el tiempo y haga clic en Aceptar para configurar la lectura de luminiscencia.

En la pestaña Control de instrumentos, desplácese por la lista de protocolos activos y seleccione el protocolo prealmacenado para leer la luminiscencia. En la pestaña Visualización en vivo, defina la escala en el menú desplegable y seleccione Logaritmo o Lineal para el tipo. En la pestaña Temperatura, seleccione Desactivado para el calentamiento de placas.

Finalmente, haga clic en el botón Inicio para realizar la lectura de luminiscencia. Exporte los resultados a un formato de hoja de cálculo utilizando el Explorador integrado en el software de control. Estime la luminiscencia de fondo de las células CG o NG tratadas con un medio de crecimiento que no incluya tetraciclina.

Defina una señal de luminiscencia emitida por células CG o NG tratadas con 0,1% de DMSO en un medio de crecimiento que contenga un microgramo por mililitro de tetraciclina sola como 100% de actividad gamma-secretasa relativa. Por último, normalizar las señales de luciferasa de las células CG o NG que se cultivan con un medio de crecimiento que contiene tetraciclina y CL-387, 785 o DAPT a la señal de luciferasa emitida por las células CG o NG tratadas con DMSO. Aquí se muestran resultados representativos que demuestran las mediciones cuantitativas de la escisión de gamma-secretasa de APP-C99 en las células CG.

Las células se trataron con un micromolar de CL-387, 785 o DAPT en presencia de un microgramo por mililitro de tetraciclina a 37 grados centígrados durante 24 horas. La luminiscencia derivada de la proteólisis mediada por gamma-secretasa de C99-GV se cuantificó después de la adición de 100 microlitros por pocillo de reactivo de ensayo de luciferasa. La señal de luciferasa emitida por las células tratadas con vehículo solo se estableció como 100% de luminiscencia relativa.

Aquí se muestran resultados representativos que demuestran las mediciones cuantitativas de la escisión de la gamma-secretasa de N-delta-E en las células NG. Del mismo modo, las células se trataron con un micromolar de CL-387, 785 o DAPT en presencia de un microgramo por mililitro de tetraciclina a 37 grados centígrados durante 24 horas. La luminiscencia derivada de la proteólisis mediada por gamma-secretasa de N-delta-E-GV se cuantificó después de la adición de 100 microlitros por pocillo de reactivo de ensayo de luciferasa.

La señal de luciferasa emitida por las células tratadas con vehículo solo se estableció como 100% de luminiscencia relativa. Una vez dominada, esta técnica solo requiere un tiempo de práctica de una a dos horas, dependiendo de la cantidad de compuestos a examinar. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que el investigador en el campo de la enfermedad de Alzheimer explorara el modificador genético y químico de la gamma-secretasa en busca de nuevas terapias para la enfermedad de Alzheimer.