Name: Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprende a detectar y cuantificar Plasmodium falciparum en glóbulos rojos mediante espectroscopia ATR-FTIR y análisis multivariante. Este método portátil mejora el diagnóstico rápido de malaria.

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Financiación para los autores fue proporcionada por el Consejo de investigación australiano (futuro beca FT120100926 a BRW), nacional de salud y Consejo de investigación médica de Australia (programa beca y beca de investigación Senior a JGB; Temprana carrera becas JSR; Infraestructura para la investigación institutos de apoyo plan beca para el Instituto de Burnet), y la infraestructura operacional del gobierno victoriano estado beca para el Instituto de Burnet. Reconocemos el Sr. Finlay Shanks para apoyo instrumental.

Por favor consulte apropiado Material hojas de datos de seguridad (MSDS) y buscan una formación de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Todos los pasos de cultivo deben realizarse en un gabinete BSL-2 utilizando una técnica aséptica, es decir hay un riesgo de exposición a la radiación UV perjudicial de descontaminación, produzcan lesiones accidentales con agujas y posible exposición biológica y la infección si la cultura del parásito entra en cualquier lesión. Además, sangre stock de bancos de sangre sólo defendido por ciertas enfermedades y el potencial para la difusión de enfermedades transmitidas por sangre es un riesgo potencial. Buscar ayuda médica inmediata en la ocurrencia de lesiones.
1. preparación y medición de 3 7 serie de diluciones de parásito falciparum del Plasmodium
Nota: Plasmodium SP. cultura es altamente sensible. Utilizar reactivos frescos/no vencido y alimentar los parásitos regularmente cambiando los medios de comunicación. Alimentación cultivos por debajo de 5% de parasitemia cada dos días; alimentación de las culturas entre 6-10% parasitemia una o dos veces al día; y culturas entre 11-20% hasta 4 veces al día. Parásitos que están empezando a morir de hambre perderá su forma y comienzan a contraerse. En tal caso, la alimentación y diluir inmediatamente cambiando los medios de comunicación y agregando valores gr. recoger la sangre de donantes en tubos de sangre con heparina como anticoagulante y medida en las primeras 6 h.
<ol><li>Cultura un total de 30 mL de 3 7 tensión parásitos Plasmodium falciparum según el protocolo estándar hasta que la parasitemia alcanza 10% anillos.</li>
	<li>
Sincronización de parásitos
	<ol>
<li>11 h después de shizogeny en el ciclo de vida del parásito, Resuspender el cultivo y la transferencia en un tubo cónico de 50 mL con una pipeta automática.</li>
		<li>Centrifugue la cultura en 300-400 x g y condiciones estándar de laboratorio (25° C y 100 kPa) durante 5 minutos.</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante por elaborar con una pipeta o con una pipeta Pasteur conectada a una aspiradora sin perturbar el pellet. Desechar el medio inútil en una solución de cloro 10%.</li>
		<li>Lentamente agregar 12 a 15 mL de solución del sorbitol el 4% en el sedimento con una pipeta automatizada y mezclar la cultura capsular y la inversión del tubo hasta que la cultura es homogénea.</li>
		<li>Incubar el cultivo a 37 ° C durante 15 minutos.</li>
		<li>Centrifugue la cultura en 300-400 x g y condiciones normales de laboratorio durante 5 minutos.</li>
		<li>Quite el sobrenadante como se describe en el paso 1.2.3.</li>
		<li>Añadir 10-15 mL de solución salina al 0.9% para el pellet y mezclar la solución de recubrimiento y inversión del tubo hasta que la cultura es homogénea.</li>
		<li>Repita el 1.2.6–1.2.8 pasos dos veces más para lavar todos los restos de sorbitol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la serie de diluciones de parasitemia
	<ol>
<li>Lave el stock de glóbulos rojos como en pasos 1.2.6–1.2.9.</li>
		<li>Centrifugar el cultivo en condiciones estándar de laboratorio, stock gr a 300-400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante como en el paso 1.2.3.</li>
		<li>Calificar a tubos de microcentrífuga de 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, % 0.100, 0.250%, 0,750% y 1.000% y añadir 0 μL, 1 μl, 2.5 μl, 7.5 μl, 10 μl, 25 μl, 75 μl y 100 μl del cultivo respectivamente, usando una pipeta de 0,2-20 μl.</li>
		<li>Añadir 100 μl, 99 μl, 97,5 μl, μl 92.5, 80 μl, 75 μl, 0 y 25 μl de caldo glóbulos rojos tubos con 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0,250%, 0,750% y 1.000%, respectivamente.</li>
		<li>Centrifugar la sangre de donante fresco almacenada en tubos de anticoagulante en 1.200 x g y condiciones normales de laboratorio durante 10 minutos.</li>
		<li>Retire el plasma elaborar con una pipeta y desechando como se describe en el paso 1.2.3.</li>
		<li>Agregar 900 μl de glóbulos rojos aislados en cada tubo de microcentrífuga y homogeneizar por inversión del tubo 10 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adquisición espectral
	<ol>
<li>Utilizando el programa acompañamiento de adquisición espectral, haga clic en "Configuración del instrumento" y establecer los parámetros de colección de datos a la siguiente: 128 análisis de fondo; 32 análisis de la muestra; y la resolución 8/cm sobre la gama máxima de la muestra del instrumento.</li>
		<li>Ajuste la temperatura de la espectrómetro de ATR-FTIR por recomendación del fabricante o durante la noche.</li>
		<li>Limpie el cristal frotando suavemente en un movimiento circular usando pelusa gratis trapos humedecidos con agua ultrapura. Bien seque con otro paño libre de pelusa.</li>
		<li>Tomar una medida de fondo del aire haciendo clic en "Fondo de medición". Cada 20 minutos, limpie el cristal como en el paso 1.4.3 y repita esta medición.</li>
		<li>Abrir la vista en vivo haciendo clic en "Vista previa". Observar una línea de base plana, horizontal, que indica que el cristal esté limpio.</li>
		<li>Pipetear 10 μl de agua desionizada directamente en el centro del cristal y haz click en "Medida muestra". Repita esta medición de agua después de cada quinto muestra.</li>
		<li>Seque el cristal con un paño libre de pelusa y un movimiento circular suave.</li>
		<li>Pipetear 10 μl de muestra y haga clic en "Muestra de la medida".</li>
		<li>Limpie el cristal entre las muestras como en el paso 1.4.3.</li>
		<li>Repita hasta que se adquieren 3 repeticiones, para aleatorizar el orden de las muestras y las repeticiones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. multivariante análisis (MVDA)
Nota: Tratamiento de los datos debe hacerse sobre el conjunto de datos entero para evitar el ruido y la adición de picos de origen no biológico. En cambio, analizar sobre las regiones biológicamente relevantes: 2980-2800/cm y 1750/cm 850.
<ol><li>
Tratamiento de los datos Nota: Dos software, por ejemplo, Matlab (en adelante denominado software 1) y la X del posicionador (en adelante denominado "software 2") se utilizan como ejemplos para MVDA. 1 el software tiene la capacidad de realizar MVDA sin la adición de una interfaz gráfica de usuario (GUI). Sin embargo, se recomienda comprar una interfaz gráfica (Tabla de materiales). Las siguientes instrucciones cuando refiriéndose al software 1 asumirá que es junto con la caja de herramientas GUI disponible comercialmente, y se ha colocado el script de tratamiento de datos de ejemplo.<ol>
<li>Abra el software de análisis de datos multivariante apropiado, haga clic en "Importar datos" y seleccione el tipo de archivo para su análisis.<ol>
<li>Programa 1, la entrada "Análisis" en la ventana comando para abrir la GUI. Haga clic derecho el X box para encontrar "Importar datos".</li>
			<li>En software 2, haga clic en la ficha "Archivo" para encontrar "Importación".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Importar espectros muestra, agua y línea de base como conjuntos de datos en el espacio de trabajo seleccionando todos los espectros en cada juego por separado y haciendo clic en "Abrir" y dar a cada grupo un nombre corto, por ejemplo, 'wat' conjunto de datos de espectros de agua.</li>
		<li>Seleccione nueva tabla/matriz haciendo clic en "nueva matriz, Vector" y generar un vector n × 1, donde n es el número de muestras. La parasitemia de cada muestra de entrada y el vector de nombre "Parasitemia".<ol>
<li>En 1 de software, haga clic en "Nueva Variable" en la ventana de comandos.</li>
			<li>En software 2, haga clic en el icono "Nueva matriz".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Trama de datos haciendo clic en el icono"trazar datos". Inspeccione los espectros para los efectos del vapor de agua haciendo clic en "Zoom" y zoom 1800-1400/cm; más claramente observado como picos corto, agudos, estrechos a lo largo de las laderas de la amida y amida grupos II.</li>
		<li>En casos extremo de vapor de agua, abra la pestaña Editar/pre-procesos de datos y seleccione "Suavizado". Reducir el ruido o el vapor de agua fuertes contribuciones mediante el suavizado de los espectros de la muestra y agua hasta 25 puntos de suavizado o usar un método de corrección de vapor de agua.</li>
		<li>Correcta línea de base no horizontales mediante el algoritmo de corrección de línea base si es apropiado, en la misma pestaña datos editar/pre-procesos de paso 2.1.4.</li>
		<li>Promedio de agua espectros y copie las filas en una matriz de m × n equivalente al conjunto de datos muestra y reducir al 70% de intensidad multiplicándolo por 0.7.<ol>
<li>Software 1, hacerlo en la ventana de comandos, introducir la siguiente secuencia de comandos "AverageWater=mean(WaterDataset)". Luego copiar y pegar las filas para que coincida con el conjunto de datos de muestra. Para reducir la intensidad, la entrada "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reste la media del agua en espectros de cada espectro de la muestra.<ol>
<li>Software 1, hacerlo en la ventana de comandos introduciendo la siguiente secuencia de comandos "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Abra la ficha de datos de edición/pre-procesos para aplicar una segunda función derivada y luego normalizar los datos mediante la selección de función de una variable normal (SNV) y significa centro de datos.<ol>
<li>Software 1, hacerlo de una sola vez. En primer lugar seleccione "Derivada" y entrados 25 puntos de suavizado, orden Polinómico de 3 orden derivado de la muestra mediante una función de Savitzky-Golay y 25 puntos de suavizado. Continuación, seleccione "SNV" y "Media Center". Haga clic en "OK/Apply".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Abra la ficha de datos de edición/pre-procesos y en la columna "Variables", seleccione 2.980 – 2.800/cm y 1.750 – 850/cm asegurándose de que sólo sus cajas son marcadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de datos
	<ol>
<li>Análisis de componentes principales (PCA)<ol>
<li>Haga clic en "Análisis | Descomposición"y seleccione de la PCA.<ol>
<li>En 1 de software, haga clic en "Modelo de construcción".</li>
				<li>Software 2, entrada de los métodos de la PCA. Entrada el número óptimo de componentes principales (PC) - en este trabajo, 7 - y un máximo de 100 iteraciones y seleccionar validación cruzada para el método de validación. Haga clic en "Ejecutar".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Respete el límite de confianza de 95%, el anillo de puntos, en una parcela de puntuaciones entre PC1 y PC2.</li>
			<li>Marque los espectros de la muestra con las puntuaciones que ocurren fuera del límite como potenciales valores extremos utilizando la herramienta"seleccionar espectros".</li>
			<li>Si los espectros marcados tienen alto Hotellings T2 valores y altos residuos Q excluyen de análisis posterior.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-R)<ol>
<li>Haga clic en "Análisis | Regresión de"y seleccione"PLS-R".<ol>
<li>Software 1, derecha haga clic en bloquear Y y seleccione el vector "Parasitemia | Construcción de modelo".</li>
				<li>Software 2, entrada de los métodos de PLS. Seleccione el vector "Parasitemia" como "Y de referencia" y el conjunto de datos muestra como "conjunto de datos X" y seleccionar validación cruzada como el método de validación. Haga clic en "Ejecutar".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Analizar el modelo de regresión. Valores de R2 0,80 y raíz cuadrada media de error de validación cruzada (RMSECV) los valores menores que 0.1% parasitemia son modelos aceptables.</li>
			<li>Analizar el vector de regresión e identificar las bandas biológicas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Topley_Wilson_s_Microbiology_and_Microbi.html?id=vs_3lgEACAAJ">Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology</a>. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).</li>
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<li>Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank+and+limit+of+detection+of+Plasmodium+falciparum+thick+blood+smear+microscopy+in+a+routine+setting+in+Central+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa.</a> Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).</li>
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<li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal%22%5BJournal%5D)">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li>
<li>Fabian, H., Mäntele, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabian%2C+H+%22Handbook+of+Vibrational+Spectroscopy%22">Handbook of Vibrational Spectroscopy</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).</li>
<li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li>
<li>Wood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+hydration+and+DNA+conformation+in+interpreting+infrared+spectra+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues.</a> Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).</li>
<li>Plyler, E. K. <a target="_blank" href="http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/jres/048/jresv48n4p281_A1b.pdf">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Modelo PLS-R es un método multivariante supervisado que encuentra una relación lineal, Y = bX + E, entre las variables predictoras X (aquí, la absorbancia en cada número) y una variable continua Y (aquí, el nivel de parasitemia). En Resumen, el modelo combina las variables en X para crear un nuevo conjunto de variables latentes (LVs) que capturan la varianza en X correlacionada con Y y calcula un vector de regresión (b) que multiplicados por los resultados de un nuevo espectro en la estimación del valor y. La fuerza del ...

La malaria está entre las enfermedades más devastadoras de nuestro tiempo; más de la mitad de la población vive en situación de riesgo en regiones endémicas y afecta desproporcionadamente los pobres1,2,3,4. Una gran parte del problema es la portadores asintomáticos y pacientes etapa temprana que actúan como reservorios de mosquitos vectores5, provocando picos de infección durante las temporadas húmedas y permitiendo que persisten en las comunidades. La malaria es causada por cinco parásitos Plasmodium , el más mortal de la que es p. falciparum , que causa la forma más severa de la enfermedad2.
Actualmente, las técnicas para el diagnóstico de la malaria son menos que perfecto. Microscopio óptico, el estándar de oro actual, sólo puede detectar 62-88 parásitos/μl dependiendo del método utilizado6. Además, debido a la intensidad y alta habilidad requerida, en muchas regiones la microscopia diagnostica > 50% de los casos, especialmente aquellos con baja parasitemia2, que puede ser directamente atribuido a la falta de recursos en el área y los resultados en los niveles el mal uso de medicamentos contra la malaria. Los 2 principales métodos de diagnóstico son pruebas de diagnóstico rápido (PDR), que utilizan anticuerpos para la detección y análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que discriminan y cuantificación de parásitos de ADN. En la actualidad, PDR sólo es capaces de detectar por p. falciparum y p. vivax de al menos 100 parásitos/μl de sangre dando como resultado formas más raras de la enfermedad que sin tratamiento. 7 , 8 por el contrario, ensayos PCR discriminan y cuantificar diferentes especies de Plasmodium en una sensibilidad de 5 0.0004 parásitos/μl de sangre. Sin embargo, se requiere de costosos reactivos, equipos y habilidad técnica y así no es conveniente para el uso del campo.
Una técnica altamente sensible, fiable y asequible es esencial para mejorar el diagnóstico y así mejorar los resultados del paciente y posibilitando la eliminación de la enfermedad. Espectroscopia de transformación (ATR-FTIR) de Fourier reflexión Total atenuada ofrece una posible solución a este problema. Trabajo previo ha demostrado que es posible detectar y cuantificar por p. falciparum en metanol fijada películas de sangre alcanzar los límites de detección de < 1 parásito/μl de sangre (< 0.0002% de parasitemia)9, que es comparable a los métodos de PCR. Estudios recientes han demostrado que es posible detectar y cuantificar parásitos en las muestras acuosas y así eliminar el paso de fijación. Sin embargo, factores tales como el vapor de agua, de ruido espectral y tratamiento de los datos deben tomarse en cuenta para un resultado óptimo10.
Este protocolo tiene como objetivo mostrar a los nuevos usuarios cómo adquirir espectros ATR-FTIR y preparar un modelo de regresión para la detección de p. falciparum de acuoso de las muestras de células de sangre rojas (RBC)10.

<table><tbody><tr><td>Sangre del donante</td><td>:</td><td></td> <td>debe ser recolectada por un médico capacitado</td></tr><tr><td>Sangre de reserva Cruz</td><td>Roja Australiana'</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>3D7 Plasmodium falciparum</td><td>El Instituto Burnet-Laboratorio</td><td></td> <td>cepa de tipo salvaje equivalente</td></tr> a <tr><td>RPMI-1640 medios con L-hepes sin bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Albumax (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>E003000PJ</td><td>Aliquot en tubos de halcón de 50 mL y almacenar en el congelador</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1876</td><td>Debe filtrarse antes de su uso en cultivo</td></tr><tr><td>Tubos de extracción de sangre (Vacutainers)</td><td>Becton, Dickonson and Company</td><td>367671</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión</td><td>Thermofisher</td><td>M3004</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 50 mL Puntas</td> de pipeta <td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>25mL Puntas</td> de pipeta <td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>10mL</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipetas automatizado</td><td>Integra-biosciences</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Legend X1R</td><td>Thermofisher</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Forma&trade; 310 Incubadoras de CO2 de calor directo</td><td>Thermofisher</td><td>310TS</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binocular Nikon Eclipse E-100</td><td>Nikon Instruments</td><td>E100_2CE-MRTK-1</td><td>Al comprar, asegúrese de que la lente 100x sea un aceite lente de inmersión</td></tr><tr><td>Bruker Alpha Ft-IR Espectrómetro con ATR Quick Snap Attachment</td><td>Bruker</td><td>9308-3700</td><td>Asegúrese de solicitar el accesorio "Eco-ATR" al comprar</td></tr><tr>el <td>software de análisis de datos multivariante</td><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc</td><td></td> El software de análisis</tr> de <tr><td>datos multivariante</td><td>Unscrambler X</td><td>CAMO</td><td></td></tr><tr><td>PLS-Toolbox</td><td>Mathworks, Inc.</td><td></td><td>Interfaz gráfica de usuario para Matlab</td></tr></tbody></table>

detección y cuantificación de plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada total reflexión y análisis de datos multivariantes

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Demostrar un método de cuantificación y detección de parásitos en acuoso de glóbulos rojos (gr) mediante un simple Banco atenuada Total reflexión Fourier transforman (ATR-FTIR) Espectrómetro de infrarrojos junto con análisis de datos multivariantes ( MVDA). 3 7 p. falciparum fueron cultivados a los parásitos de etapa 10% parasitemia anillo y utilizado para glóbulos rojos del donante fresco aislado para crear una dilución en serie entre 0 – 1%. 10 μl de cada muestra se colocaron en el centro de la ventana de diamante ATR para adquirir el espectro. Los datos de la muestra fue tratados para mejorar la relación señal a ruido y eliminar el aporte de agua, y luego se aplicó la segunda derivada para resolver características espectrales. Luego se analizaron los datos utilizando dos tipos de MVDA: Análisis de componentes principales el primer (ACP) para determinar cualquier afloramiento y entonces regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-R) para construir el modelo de cuantificación.

Trama de cuadrados mínimos parciales (PLS-R) y su vector de regresión asociado, Figura 1a y 1b respectivamente, muestran que la señal de los parásitos son bastante diferentes de los hematíes que pueden ser utilizados para formar una regresión lineal del modelo a utilizar para la predicción de parásitos en futuros conjuntos de datos.
Se generó un modelo de PLS-R robusto, lineal con u...

Aquí, presentamos un protocolo para la detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosas rojo sangre células infectadas usando un espectrómetro de infrarrojos reflexión total atenuada y análisis de datos multivariantes.

Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

El objetivo general de este procedimiento es construir un modelo de regresión para la predicción de la parasitemia de malaria utilizando espectroscopia ATR-FTIR con análisis de datos multivariados. Este método puede ayudar a acelerar los diagnósticos en el punto de atención que pueden ayudar a mejorar los resultados de los pacientes en el futuro. La principal ventaja de esta técnica es que, aunque el modelo puede tardar algún tiempo en construirse, es altamente portátil, fácil de usar, altamente sensible y de bajo costo.Aunque este método permite la cuantificación de parásitos de la malaria, también se puede utilizar para observar la respuesta fenotípica a los cambios ambientales, como los cambios en la composición del parásito debido a los agentes antimicrobianos. La idea se desarrolló a partir del trabajo que hicimos en el Sincrotrón Australiano sobre las células infectadas por el paludismo. Esto fue a nivel de una sola célula.A partir de ahí, decidimos utilizar la espectroscopia ATR-FTIR para desarrollar realmente la prueba de diagnóstico. Antes de iniciar el procedimiento de sincronización, cultivo 30 mililitros de parásitos Plasmodium falciparum de tensión 3D7 como se describe

detection-quantification-plasmodium-falciparum-aqueous-red-blood

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Una vez que un gen es identificado como potencialmente resistentes a la malaria, que debe ser evaluado por su papel en la prevención de las infecciones por Plasmodium en el mosquito. Este protocolo se ilustra cómo la extensión de la infección por Plasmodium de mosquitos se puede probar. Las técnicas para la preparación del cultivo de gametocitos, la alimentación de los mosquitos membrana de sangre humana, y analizando los títulos virales en el intestino del mosquito se ha demostrado.

Protocolo de infecciones por Plasmodium falciparum en la determinación de fenotipo mosquitos y la infección

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Este video muestra un ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo que involucra eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum marcados y opsonizados por monocitos. La citometría de flujo identifica la fluorescencia en los monocitos, lo que confirma la identificación exitosa de eritrocitos opsonizados a través de la fagocitosis.

Un ensayo para cuantificar la fagocitosis mediada por anticuerpos de eritrocitos infectados por parásitos

Las propiedades paramagnéticas de hemozoína se utilizan para aislar las últimas etapas...

Separación de los<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-eritrocitos infectados por medios magnéticos

Función de medición de anticuerpos es la clave para la comprensión de la inmunidad a la malaria Plasmodium falciparum. Este método describe la purificación de merozoitos viables, y la medición de la opsonización dependiente de la fagocitosis mediante citometría de flujo.

Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

Los invade parásito de la malaria y se replica dentro de las células rojas de la sangre. La evaluación precisa de la invasión merozoite y parasitemia es por lo tanto crucial para evaluar el curso de la infección por malaria. Aquí se describe un protocolo basado en citometría de flujo para la medición de estos parámetros en un modelo de ratón de la malaria.

En la Evaluación in vivo de roedores Plasmodium parasitemia y Merozoite Invasión por Citometría de Flujo

Los microRNAs humanos se translocan de los eritrocitos del huésped a los parásitos Plasmodium falciparum. En este trabajo se describen las técnicas utilizadas para transfectar microRNAs sintéticos en eritrocitos del huésped y aislar todos los RNAs de P. falciparum.  Además, en este trabajo se detallará un método de aislamiento de polisomas en P. falciparum para determinar la ocupación ribosómica y el potencial traduccional de los transcritos de parásitos.

Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones sobre cómo medir la capacidad de los anticuerpos presentes en los sueros o plasma de individuos, expuestos naturalmente a la infección por Plasmodium falciparum, para opsonizar e inducir la fagocitosis de los eritrocitos infectados por parásitos (IE).

Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo

Este protocolo describe un ensayo de inmunoadsorción enzimática en sándwich para detectar esporozoítos de glándulas salivales en mosquitos. Mediante el uso de anticuerpos monoclonales fácilmente disponibles, el método permite la detección rentable y de alto rendimiento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax. El método es adecuado para la investigación de la transmisión del paludismo, incluidos los estudios de vectores.

Detección de esporozoítos de Plasmodium en mosquitos Anopheles mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas

El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .

Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles

Aquí describimos un nuevo método para ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad celular a Plasmodium durante la etapa sanguínea de la infección. Este es un ensayo in vitro que mide la destrucción de glóbulos rojos infectados por linfocitos citotóxicos.

In vitro Ensayo de destrucción de glóbulos rojos infectados con plasmodio por linfocitos citotóxicos

Aprende a detectar y cuantificar Plasmodium falciparum en glóbulos rojos mediante espectroscopia ATR-FTIR y análisis multivariante. Este método portátil mejora el diagnóstico rápido de malaria.

Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes (Video) | JoVE Journal

Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes

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