Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes

El objetivo general de este procedimiento es construir un modelo de regresión para la predicción de la parasitemia de malaria utilizando espectroscopia ATR-FTIR con análisis de datos multivariados. Este método puede ayudar a acelerar los diagnósticos en el punto de atención que pueden ayudar a mejorar los resultados de los pacientes en el futuro. La principal ventaja de esta técnica es que, aunque el modelo puede tardar algún tiempo en construirse, es altamente portátil, fácil de usar, altamente sensible y de bajo costo.

Aunque este método permite la cuantificación de parásitos de la malaria, también se puede utilizar para observar la respuesta fenotípica a los cambios ambientales, como los cambios en la composición del parásito debido a los agentes antimicrobianos. La idea se desarrolló a partir del trabajo que hicimos en el Sincrotrón Australiano sobre las células infectadas por el paludismo. Esto fue a nivel de una sola célula.

A partir de ahí, decidimos utilizar la espectroscopia ATR-FTIR para desarrollar realmente la prueba de diagnóstico. Antes de iniciar el procedimiento de sincronización, cultivo 30 mililitros de parásitos Plasmodium falciparum de tensión 3D7 como se describe en el protocolo de texto. Usando una pipeta automatizada, resuspender el cultivo y transferirlo a un tubo cónico de 50 mililitros.

Centrifugar el cultivo a 300 a 400 veces g en condiciones de laboratorio estándar durante cinco minutos. Retire el sobrenadante dibujándolo con una pipeta automatizada sin alterar el pellet. Deseche el medio de desecho en una solución de lejía al 10%.

Añadir lentamente de 12 a 15 mililitros de una solución de 4% de sorbitol al pellet y mezclar el cultivo tapando e invirtiendo el tubo hasta que el cultivo sea homogéneo. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de 15 minutos, centrifugar la cultura durante cinco minutos.

Utilice una pipeta automatizada para quitar el sobrenadante sin alterar el pellet. Añadir de 10 a 15 mililitros de 0,9% de solución salina al pellet y mezclar la solución tapando e invirtiendo el tubo hasta que el cultivo sea homogéneo. Repita la centrifugación y la solución salina lave dos veces más para eliminar todos los restos de sorbitol.

Para comenzar este procedimiento, centrifugar los glóbulos rojos de stock, o RBCs. Retire el sobrenadante y lave con 0.9%saline un total de tres veces. Centrifugar los glóbulos rojos y el cultivo a 300 a 400 veces g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante de cada tubo.

Etiquetar ocho tubos de microcentrífuga como se indica. A continuación, utilice una pipeta de 0,2 a 20 microlitrotro para agregar la cantidad adecuada de cultivo a cada tubo. A continuación, añada la cantidad adecuada de glóbulos rojos a cada tubo para obtener la dilución de parasitemia deseada.

Centrifugar la sangre fresca del donante recogida en tubos anticoagulantes a 1.200 veces g y condiciones de laboratorio estándar durante 10 minutos. Retire el plasma dibujándolo con una pipeta y desechándolo en una solución de lejía al 10%. Agregue 900 microlitros de glóbulos rojos aislados del donante en cada tubo de microcentrífuga y mezcle bien invirtiendo 10 veces.

Se utilizará un simple espectrómetro de transformación total de reflexión total de cuatro transformación de sobremesa Fourier o espectrómetro ATR-FTIR para adquirir el espectro. Preparar y limpiar el cristal mediante el uso de toallitas sin pelusas humedecidas con agua ultrapura para frotar suavemente el cristal en un movimiento circular. Luego, usa otra toallita sin pelusas para secar bien el cristal.

Tome una medida de fondo del aire haciendo clic en Medición de fondo. Cada 20 minutos, limpie el cristal y repita esta medición. Abra la vista en vivo haciendo clic en Vista previa.

Observe una línea base plana y horizontal que indique que el cristal está limpio. Pipetear 10 microlitros de agua desionizada directamente sobre el centro del cristal y haga clic en Medir muestra. Seque el cristal con una toallita sin pelusas y un suave movimiento circular.

Pipetear 10 microlitros de muestra en el centro del cristal y haga clic en Medir muestra. Limpie el cristal entre las muestras. En esta demostración, el análisis de datos multivariante se realizará utilizando MATLAB.

Para iniciar el tratamiento de datos, introduzca el análisis en la ventana de comandos para abrir la interfaz gráfica de usuario. Haga clic con el botón derecho en el cuadro X para buscar Importar datos. Seleccione el tipo de archivo para el análisis.

Importe los espectros de muestra, agua y línea base como conjuntos de datos en el lugar de trabajo seleccionando todos los espectros de cada conjunto por separado, haciendo clic en Abrir y dando a cada conjunto un nombre corto. Haga clic en Nueva variable en la ventana de comandos y asigne al vector el nombre Parasitemia. Introduzca la Parasitemia de cada muestra.

Haga clic con el botón derecho en el cuadro X para buscar Datos de trazado. Haga clic en el icono Datos de trazado para trazar los datos. Inspeccione los espectros en busca de efectos de vapor de agua haciendo clic en Zoom y haciendo zoom en 1, 800 a 1, 400 por centímetro, más claramente observado como picos cortos, agudos y estrechos a lo largo de las laderas de las bandas Amide I y Amide II.

En casos de vapor de agua extremo, abra la pestaña Editar datos de preproceso y seleccione Suavizado. Reduzca el ruido y/o las fuertes contribuciones de vapor de agua al suavizar la muestra y los espectros de agua. Después de un tratamiento de datos adicional como se describe en el protocolo de texto, abra la pestaña Editar datos y, en las variables de columna, seleccione 2980 a 2800 por centímetro y de 1750 a 850 por centímetro asegurándose de que solo sus casillas estén marcadas.

Los datos ya están listos para su análisis. Para realizar el análisis de componentes principales o PCA, haga clic en Descomposición de análisis y seleccione PCA. Haga clic en Generar modelo.

Observe el límite de confianza del 95%, el anillo discontinuo, en la gráfica de puntuaciones entre PC 1 y PC 2. Utilice la herramienta Seleccionar espectro para marcar los espectros de muestra con puntuaciones que se producen fuera del límite como valores atípicos potenciales. Para realizar la regresión de mínimos cuadrados parciales o PLSR, haga clic en Regresión de análisis y seleccione PLSR.

Haga clic con el botón derecho en el bloque Y y seleccione el modelo de compilación Parasitemia vectorial. Analice el modelo de regresión y el vector de regresión e identifique las bandas biológicas. Una gráfica de regresión de mínimos cuadrados parciales de RBC aumentada entre el cero y el uno por ciento de Parasitemia generó un valor R cuadrado de 0,87 y un error de validación cruzada al cuadrado medio de raíz de 0,13%Parasitemia.

Esto demuestra la capacidad del modelo para predecir la Parasitemia en cada muestra con el Parasitemia conocido en el eje X y el Parasitemia predicho en el eje Y. El coeficiente de regresión asociado describe la contribución de cada banda a la capacidad predictiva del modelo. Cuanto más intensa es la banda, más contribuye al modelo, y por lo tanto, cómo el parásito altera la composición química de la sangre.

Los resultados muestran que la señal de los parásitos es lo suficientemente distinta de los RBC que se pueden utilizar para formar un modelo de regresión lineal para la predicción de parásitos en conjuntos de datos futuros. Una vez masterada, esta técnica puede tardar menos de tres minutos por muestra si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar limpiar los cristales ATR de todos los residuos.

Después de este procedimiento, otras especies de malaria como P vivax y P malariae pueden ser modeladas con el fin de responder a preguntas como, ¿Es la espectroscopia ATR-FTIR lo suficientemente sensible como para distinguir entre especies? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioespectroscopia exploraran la detección y cuantificación de otros patógenos transmitidos por la sangre e incluso analizaran en la sangre como la glucosa y la urea. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de la espectroscopia ATR-FTIR y el análisis NVDA para construir un modelo de regresión.

No olvide que trabajar con muestras de sangre y malaria del paciente puede ser peligroso, y siempre se debe realizar un entrenamiento y contención adecuados a nivel de bioseguridad al intentar este procedimiento.