Name: Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprende a detectar y cuantificar Plasmodium falciparum en glóbulos rojos mediante espectroscopia ATR-FTIR y análisis multivariante. Este método portátil mejora el diagnóstico rápido de malaria.

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Financiación para los autores fue proporcionada por el Consejo de investigación australiano (futuro beca FT120100926 a BRW), nacional de salud y Consejo de investigación médica de Australia (programa beca y beca de investigación Senior a JGB; Temprana carrera becas JSR; Infraestructura para la investigación institutos de apoyo plan beca para el Instituto de Burnet), y la infraestructura operacional del gobierno victoriano estado beca para el Instituto de Burnet. Reconocemos el Sr. Finlay Shanks para apoyo instrumental.

Por favor consulte apropiado Material hojas de datos de seguridad (MSDS) y buscan una formación de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Todos los pasos de cultivo deben realizarse en un gabinete BSL-2 utilizando una técnica aséptica, es decir hay un riesgo de exposición a la radiación UV perjudicial de descontaminación, produzcan lesiones accidentales con agujas y posible exposición biológica y la infección si la cultura del parásito entra en cualquier lesión. Además, sangre stock de bancos de sangre sólo defendido por ciertas enfermedades y el potencial para la difusión de enfermedades transmitidas por sangre es un riesgo potencial. Buscar ayuda médica inmediata en la ocurrencia de lesiones.
1. preparación y medición de 3 7 serie de diluciones de parásito falciparum del Plasmodium
Nota: Plasmodium SP. cultura es altamente sensible. Utilizar reactivos frescos/no vencido y alimentar los parásitos regularmente cambiando los medios de comunicación. Alimentación cultivos por debajo de 5% de parasitemia cada dos días; alimentación de las culturas entre 6-10% parasitemia una o dos veces al día; y culturas entre 11-20% hasta 4 veces al día. Parásitos que están empezando a morir de hambre perderá su forma y comienzan a contraerse. En tal caso, la alimentación y diluir inmediatamente cambiando los medios de comunicación y agregando valores gr. recoger la sangre de donantes en tubos de sangre con heparina como anticoagulante y medida en las primeras 6 h.
<ol><li>Cultura un total de 30 mL de 3 7 tensión parásitos Plasmodium falciparum según el protocolo estándar hasta que la parasitemia alcanza 10% anillos.</li>
	<li>
Sincronización de parásitos
	<ol>
<li>11 h después de shizogeny en el ciclo de vida del parásito, Resuspender el cultivo y la transferencia en un tubo cónico de 50 mL con una pipeta automática.</li>
		<li>Centrifugue la cultura en 300-400 x g y condiciones estándar de laboratorio (25° C y 100 kPa) durante 5 minutos.</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante por elaborar con una pipeta o con una pipeta Pasteur conectada a una aspiradora sin perturbar el pellet. Desechar el medio inútil en una solución de cloro 10%.</li>
		<li>Lentamente agregar 12 a 15 mL de solución del sorbitol el 4% en el sedimento con una pipeta automatizada y mezclar la cultura capsular y la inversión del tubo hasta que la cultura es homogénea.</li>
		<li>Incubar el cultivo a 37 ° C durante 15 minutos.</li>
		<li>Centrifugue la cultura en 300-400 x g y condiciones normales de laboratorio durante 5 minutos.</li>
		<li>Quite el sobrenadante como se describe en el paso 1.2.3.</li>
		<li>Añadir 10-15 mL de solución salina al 0.9% para el pellet y mezclar la solución de recubrimiento y inversión del tubo hasta que la cultura es homogénea.</li>
		<li>Repita el 1.2.6–1.2.8 pasos dos veces más para lavar todos los restos de sorbitol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la serie de diluciones de parasitemia
	<ol>
<li>Lave el stock de glóbulos rojos como en pasos 1.2.6–1.2.9.</li>
		<li>Centrifugar el cultivo en condiciones estándar de laboratorio, stock gr a 300-400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante como en el paso 1.2.3.</li>
		<li>Calificar a tubos de microcentrífuga de 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, % 0.100, 0.250%, 0,750% y 1.000% y añadir 0 μL, 1 μl, 2.5 μl, 7.5 μl, 10 μl, 25 μl, 75 μl y 100 μl del cultivo respectivamente, usando una pipeta de 0,2-20 μl.</li>
		<li>Añadir 100 μl, 99 μl, 97,5 μl, μl 92.5, 80 μl, 75 μl, 0 y 25 μl de caldo glóbulos rojos tubos con 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0,250%, 0,750% y 1.000%, respectivamente.</li>
		<li>Centrifugar la sangre de donante fresco almacenada en tubos de anticoagulante en 1.200 x g y condiciones normales de laboratorio durante 10 minutos.</li>
		<li>Retire el plasma elaborar con una pipeta y desechando como se describe en el paso 1.2.3.</li>
		<li>Agregar 900 μl de glóbulos rojos aislados en cada tubo de microcentrífuga y homogeneizar por inversión del tubo 10 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adquisición espectral
	<ol>
<li>Utilizando el programa acompañamiento de adquisición espectral, haga clic en "Configuración del instrumento" y establecer los parámetros de colección de datos a la siguiente: 128 análisis de fondo; 32 análisis de la muestra; y la resolución 8/cm sobre la gama máxima de la muestra del instrumento.</li>
		<li>Ajuste la temperatura de la espectrómetro de ATR-FTIR por recomendación del fabricante o durante la noche.</li>
		<li>Limpie el cristal frotando suavemente en un movimiento circular usando pelusa gratis trapos humedecidos con agua ultrapura. Bien seque con otro paño libre de pelusa.</li>
		<li>Tomar una medida de fondo del aire haciendo clic en "Fondo de medición". Cada 20 minutos, limpie el cristal como en el paso 1.4.3 y repita esta medición.</li>
		<li>Abrir la vista en vivo haciendo clic en "Vista previa". Observar una línea de base plana, horizontal, que indica que el cristal esté limpio.</li>
		<li>Pipetear 10 μl de agua desionizada directamente en el centro del cristal y haz click en "Medida muestra". Repita esta medición de agua después de cada quinto muestra.</li>
		<li>Seque el cristal con un paño libre de pelusa y un movimiento circular suave.</li>
		<li>Pipetear 10 μl de muestra y haga clic en "Muestra de la medida".</li>
		<li>Limpie el cristal entre las muestras como en el paso 1.4.3.</li>
		<li>Repita hasta que se adquieren 3 repeticiones, para aleatorizar el orden de las muestras y las repeticiones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. multivariante análisis (MVDA)
Nota: Tratamiento de los datos debe hacerse sobre el conjunto de datos entero para evitar el ruido y la adición de picos de origen no biológico. En cambio, analizar sobre las regiones biológicamente relevantes: 2980-2800/cm y 1750/cm 850.
<ol><li>
Tratamiento de los datos Nota: Dos software, por ejemplo, Matlab (en adelante denominado software 1) y la X del posicionador (en adelante denominado "software 2") se utilizan como ejemplos para MVDA. 1 el software tiene la capacidad de realizar MVDA sin la adición de una interfaz gráfica de usuario (GUI). Sin embargo, se recomienda comprar una interfaz gráfica (Tabla de materiales). Las siguientes instrucciones cuando refiriéndose al software 1 asumirá que es junto con la caja de herramientas GUI disponible comercialmente, y se ha colocado el script de tratamiento de datos de ejemplo.<ol>
<li>Abra el software de análisis de datos multivariante apropiado, haga clic en "Importar datos" y seleccione el tipo de archivo para su análisis.<ol>
<li>Programa 1, la entrada "Análisis" en la ventana comando para abrir la GUI. Haga clic derecho el X box para encontrar "Importar datos".</li>
			<li>En software 2, haga clic en la ficha "Archivo" para encontrar "Importación".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Importar espectros muestra, agua y línea de base como conjuntos de datos en el espacio de trabajo seleccionando todos los espectros en cada juego por separado y haciendo clic en "Abrir" y dar a cada grupo un nombre corto, por ejemplo, 'wat' conjunto de datos de espectros de agua.</li>
		<li>Seleccione nueva tabla/matriz haciendo clic en "nueva matriz, Vector" y generar un vector n × 1, donde n es el número de muestras. La parasitemia de cada muestra de entrada y el vector de nombre "Parasitemia".<ol>
<li>En 1 de software, haga clic en "Nueva Variable" en la ventana de comandos.</li>
			<li>En software 2, haga clic en el icono "Nueva matriz".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Trama de datos haciendo clic en el icono"trazar datos". Inspeccione los espectros para los efectos del vapor de agua haciendo clic en "Zoom" y zoom 1800-1400/cm; más claramente observado como picos corto, agudos, estrechos a lo largo de las laderas de la amida y amida grupos II.</li>
		<li>En casos extremo de vapor de agua, abra la pestaña Editar/pre-procesos de datos y seleccione "Suavizado". Reducir el ruido o el vapor de agua fuertes contribuciones mediante el suavizado de los espectros de la muestra y agua hasta 25 puntos de suavizado o usar un método de corrección de vapor de agua.</li>
		<li>Correcta línea de base no horizontales mediante el algoritmo de corrección de línea base si es apropiado, en la misma pestaña datos editar/pre-procesos de paso 2.1.4.</li>
		<li>Promedio de agua espectros y copie las filas en una matriz de m × n equivalente al conjunto de datos muestra y reducir al 70% de intensidad multiplicándolo por 0.7.<ol>
<li>Software 1, hacerlo en la ventana de comandos, introducir la siguiente secuencia de comandos "AverageWater=mean(WaterDataset)". Luego copiar y pegar las filas para que coincida con el conjunto de datos de muestra. Para reducir la intensidad, la entrada "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reste la media del agua en espectros de cada espectro de la muestra.<ol>
<li>Software 1, hacerlo en la ventana de comandos introduciendo la siguiente secuencia de comandos "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Abra la ficha de datos de edición/pre-procesos para aplicar una segunda función derivada y luego normalizar los datos mediante la selección de función de una variable normal (SNV) y significa centro de datos.<ol>
<li>Software 1, hacerlo de una sola vez. En primer lugar seleccione "Derivada" y entrados 25 puntos de suavizado, orden Polinómico de 3 orden derivado de la muestra mediante una función de Savitzky-Golay y 25 puntos de suavizado. Continuación, seleccione "SNV" y "Media Center". Haga clic en "OK/Apply".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Abra la ficha de datos de edición/pre-procesos y en la columna "Variables", seleccione 2.980 – 2.800/cm y 1.750 – 850/cm asegurándose de que sólo sus cajas son marcadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de datos
	<ol>
<li>Análisis de componentes principales (PCA)<ol>
<li>Haga clic en "Análisis | Descomposición"y seleccione de la PCA.<ol>
<li>En 1 de software, haga clic en "Modelo de construcción".</li>
				<li>Software 2, entrada de los métodos de la PCA. Entrada el número óptimo de componentes principales (PC) - en este trabajo, 7 - y un máximo de 100 iteraciones y seleccionar validación cruzada para el método de validación. Haga clic en "Ejecutar".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Respete el límite de confianza de 95%, el anillo de puntos, en una parcela de puntuaciones entre PC1 y PC2.</li>
			<li>Marque los espectros de la muestra con las puntuaciones que ocurren fuera del límite como potenciales valores extremos utilizando la herramienta"seleccionar espectros".</li>
			<li>Si los espectros marcados tienen alto Hotellings T2 valores y altos residuos Q excluyen de análisis posterior.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-R)<ol>
<li>Haga clic en "Análisis | Regresión de"y seleccione"PLS-R".<ol>
<li>Software 1, derecha haga clic en bloquear Y y seleccione el vector "Parasitemia | Construcción de modelo".</li>
				<li>Software 2, entrada de los métodos de PLS. Seleccione el vector "Parasitemia" como "Y de referencia" y el conjunto de datos muestra como "conjunto de datos X" y seleccionar validación cruzada como el método de validación. Haga clic en "Ejecutar".</li>
			</ol>
</li>
			<li>Analizar el modelo de regresión. Valores de R2 0,80 y raíz cuadrada media de error de validación cruzada (RMSECV) los valores menores que 0.1% parasitemia son modelos aceptables.</li>
			<li>Analizar el vector de regresión e identificar las bandas biológicas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Topley_Wilson_s_Microbiology_and_Microbi.html?id=vs_3lgEACAAJ">Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology</a>. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).</li>
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<li>Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank+and+limit+of+detection+of+Plasmodium+falciparum+thick+blood+smear+microscopy+in+a+routine+setting+in+Central+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa.</a> Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).</li>
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<li>Khoshmanesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+early-stage+malaria+parasites+in+laboratory+infected+erythrocytes+by+attenuated+total+reflectance+infrared+spectroscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis.</a> Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).</li>
<li>Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+common+anticoagulants+in+detection+and+quantification+of+malaria+parasitemia+in+human+red+blood+cells+by+ATR-FTIR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal%22%5BJournal%5D)">The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy.</a> Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).</li>
<li>Fabian, H., Mäntele, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabian%2C+H+%22Handbook+of+Vibrational+Spectroscopy%22">Handbook of Vibrational Spectroscopy</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2006).</li>
<li>Whelan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscoptMonitoring+the+reversible+B+to+A-like+transition+of+DNA+in+eukaryotic+cells+using+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy.</a> Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).</li>
<li>Wood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+hydration+and+DNA+conformation+in+interpreting+infrared+spectra+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues.</a> Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).</li>
<li>Plyler, E. K. <a target="_blank" href="http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/jres/048/jresv48n4p281_A1b.pdf">Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol.</a> J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Modelo PLS-R es un método multivariante supervisado que encuentra una relación lineal, Y = bX + E, entre las variables predictoras X (aquí, la absorbancia en cada número) y una variable continua Y (aquí, el nivel de parasitemia). En Resumen, el modelo combina las variables en X para crear un nuevo conjunto de variables latentes (LVs) que capturan la varianza en X correlacionada con Y y calcula un vector de regresión (b) que multiplicados por los resultados de un nuevo espectro en la estimación del valor y. La fuerza del ...

La malaria está entre las enfermedades más devastadoras de nuestro tiempo; más de la mitad de la población vive en situación de riesgo en regiones endémicas y afecta desproporcionadamente los pobres1,2,3,4. Una gran parte del problema es la portadores asintomáticos y pacientes etapa temprana que actúan como reservorios de mosquitos vectores5, provocando picos de infección durante las temporadas húmedas y permitiendo que persisten en las comunidades. La malaria es causada por cinco parásitos Plasmodium , el más mortal de la que es p. falciparum , que causa la forma más severa de la enfermedad2.
Actualmente, las técnicas para el diagnóstico de la malaria son menos que perfecto. Microscopio óptico, el estándar de oro actual, sólo puede detectar 62-88 parásitos/μl dependiendo del método utilizado6. Además, debido a la intensidad y alta habilidad requerida, en muchas regiones la microscopia diagnostica > 50% de los casos, especialmente aquellos con baja parasitemia2, que puede ser directamente atribuido a la falta de recursos en el área y los resultados en los niveles el mal uso de medicamentos contra la malaria. Los 2 principales métodos de diagnóstico son pruebas de diagnóstico rápido (PDR), que utilizan anticuerpos para la detección y análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que discriminan y cuantificación de parásitos de ADN. En la actualidad, PDR sólo es capaces de detectar por p. falciparum y p. vivax de al menos 100 parásitos/μl de sangre dando como resultado formas más raras de la enfermedad que sin tratamiento. 7 , 8 por el contrario, ensayos PCR discriminan y cuantificar diferentes especies de Plasmodium en una sensibilidad de 5 0.0004 parásitos/μl de sangre. Sin embargo, se requiere de costosos reactivos, equipos y habilidad técnica y así no es conveniente para el uso del campo.
Una técnica altamente sensible, fiable y asequible es esencial para mejorar el diagnóstico y así mejorar los resultados del paciente y posibilitando la eliminación de la enfermedad. Espectroscopia de transformación (ATR-FTIR) de Fourier reflexión Total atenuada ofrece una posible solución a este problema. Trabajo previo ha demostrado que es posible detectar y cuantificar por p. falciparum en metanol fijada películas de sangre alcanzar los límites de detección de < 1 parásito/μl de sangre (< 0.0002% de parasitemia)9, que es comparable a los métodos de PCR. Estudios recientes han demostrado que es posible detectar y cuantificar parásitos en las muestras acuosas y así eliminar el paso de fijación. Sin embargo, factores tales como el vapor de agua, de ruido espectral y tratamiento de los datos deben tomarse en cuenta para un resultado óptimo10.
Este protocolo tiene como objetivo mostrar a los nuevos usuarios cómo adquirir espectros ATR-FTIR y preparar un modelo de regresión para la detección de p. falciparum de acuoso de las muestras de células de sangre rojas (RBC)10.

<table><tbody><tr><td>Sangre del donante</td><td>:</td><td></td> <td>debe ser recolectada por un médico capacitado</td></tr><tr><td>Sangre de reserva Cruz</td><td>Roja Australiana'</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>3D7 Plasmodium falciparum</td><td>El Instituto Burnet-Laboratorio</td><td></td> <td>cepa de tipo salvaje equivalente</td></tr> a <tr><td>RPMI-1640 medios con L-hepes sin bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>Albumax (Gibco)</td><td>Thermofisher</td><td>E003000PJ</td><td>Aliquot en tubos de halcón de 50 mL y almacenar en el congelador</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1876</td><td>Debe filtrarse antes de su uso en cultivo</td></tr><tr><td>Tubos de extracción de sangre (Vacutainers)</td><td>Becton, Dickonson and Company</td><td>367671</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión</td><td>Thermofisher</td><td>M3004</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 50 mL Puntas</td> de pipeta <td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>25mL Puntas</td> de pipeta <td>Falcon</td><td>357515</td><td></td></tr><tr><td>10mL</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8902</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipetas automatizado</td><td>Integra-biosciences</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Legend X1R</td><td>Thermofisher</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Forma&trade; 310 Incubadoras de CO2 de calor directo</td><td>Thermofisher</td><td>310TS</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binocular Nikon Eclipse E-100</td><td>Nikon Instruments</td><td>E100_2CE-MRTK-1</td><td>Al comprar, asegúrese de que la lente 100x sea un aceite lente de inmersión</td></tr><tr><td>Bruker Alpha Ft-IR Espectrómetro con ATR Quick Snap Attachment</td><td>Bruker</td><td>9308-3700</td><td>Asegúrese de solicitar el accesorio "Eco-ATR" al comprar</td></tr><tr>el <td>software de análisis de datos multivariante</td><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc</td><td></td> El software de análisis</tr> de <tr><td>datos multivariante</td><td>Unscrambler X</td><td>CAMO</td><td></td></tr><tr><td>PLS-Toolbox</td><td>Mathworks, Inc.</td><td></td><td>Interfaz gráfica de usuario para Matlab</td></tr></tbody></table>

detección y cuantificación de plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada total reflexión y análisis de datos multivariantes

Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis

Demostrar un método de cuantificación y detección de parásitos en acuoso de glóbulos rojos (gr) mediante un simple Banco atenuada Total reflexión Fourier transforman (ATR-FTIR) Espectrómetro de infrarrojos junto con análisis de datos multivariantes ( MVDA). 3 7 p. falciparum fueron cultivados a los parásitos de etapa 10% parasitemia anillo y utilizado para glóbulos rojos del donante fresco aislado para crear una dilución en serie entre 0 – 1%. 10 μl de cada muestra se colocaron en el centro de la ventana de diamante ATR para adquirir el espectro. Los datos de la muestra fue tratados para mejorar la relación señal a ruido y eliminar el aporte de agua, y luego se aplicó la segunda derivada para resolver características espectrales. Luego se analizaron los datos utilizando dos tipos de MVDA: Análisis de componentes principales el primer (ACP) para determinar cualquier afloramiento y entonces regresión de mínimos cuadrados parciales (PLS-R) para construir el modelo de cuantificación.

Trama de cuadrados mínimos parciales (PLS-R) y su vector de regresión asociado, Figura 1a y 1b respectivamente, muestran que la señal de los parásitos son bastante diferentes de los hematíes que pueden ser utilizados para formar una regresión lineal del modelo a utilizar para la predicción de parásitos en futuros conjuntos de datos.
Se generó un modelo de PLS-R robusto, lineal con u...

Aquí, presentamos un protocolo para la detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosas rojo sangre células infectadas usando un espectrómetro de infrarrojos reflexión total atenuada y análisis de datos multivariantes.

Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes

We demonstrate a method of quantification and detection of parasites in aqueous red blood cells (RBCs) by using a simple benchtop Attenuated Total ...

El objetivo general de este procedimiento es construir un modelo de regresión para la predicción de la parasitemia de malaria utilizando espectroscopia ATR-FTIR con análisis de datos multivariados. Este método puede ayudar a acelerar los diagnósticos en el punto de atención que pueden ayudar a mejorar los resultados de los pacientes en el futuro. La principal ventaja de esta técnica es que, aunque el modelo puede tardar algún tiempo en construirse, es altamente portátil, fácil de usar, altamente sensible y de bajo costo.Aunque este método permite la cuantificación de parásitos de la malaria, también se puede utilizar para observar la respuesta fenotípica a los cambios ambientales, como los cambios en la composición del parásito debido a los agentes antimicrobianos. La idea se desarrolló a partir del trabajo que hicimos en el Sincrotrón Australiano sobre las células infectadas por el paludismo. Esto fue a nivel de una sola célula.A partir de ahí, decidimos utilizar la espectroscopia ATR-FTIR para desarrollar realmente la prueba de diagnóstico. Antes de iniciar el procedimiento de sincronización, cultivo 30 mililitros de parásitos Plasmodium falciparum de tensión 3D7 como se describe en el protocolo de texto. Usando una pipeta automatizada, resuspender el cultivo y transferirlo a un tubo cónico de 50 mililitros.Centrifugar el cultivo a 300 a 400 veces g en condiciones de laboratorio estándar durante cinco minutos. Retire el sobrenadante dibujándolo con una pipeta automatizada sin alterar el pellet. Deseche el medio de desecho en una solución de lejía al 10%.Añadir lentamente de 12 a 15 mililitros de una solución de 4% de sorbitol al pellet y mezclar el cultivo tapando e invirtiendo el tubo hasta que el cultivo sea homogéneo. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de 15 minutos, centrifugar la cultura durante cinco minutos.Utilice una pipeta automatizada para quitar el sobrenadante sin alterar el pellet. Añadir de 10 a 15 mililitros de 0,9% de solución salina al pellet y mezclar la solución tapando e invirtiendo el tubo hasta que el cultivo sea homogéneo. Repita la centrifugación y la solución salina lave dos veces más para eliminar todos los restos de sorbitol.Para comenzar este procedimiento, centrifugar los glóbulos rojos de stock, o RBCs. Retire el sobrenadante y lave con 0.9%saline un total de tres veces. Centrifugar los glóbulos rojos y el cultivo a 300 a 400 veces g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante de cada tubo.Etiquetar ocho tubos de microcentrífuga como se indica. A continuación, utilice una pipeta de 0,2 a 20 microlitrotro para agregar la cantidad adecuada de cultivo a cada tubo. A continuación, añada la cantidad adecuada de glóbulos rojos a cada tubo para obtener la dilución de parasitemia deseada.Centrifugar la sangre fresca del donante recogida en tubos anticoagulantes a 1.200 veces g y condiciones de laboratorio estándar durante 10 minutos. Retire el plasma dibujándolo con una pipeta y desechándolo en una solución de lejía al 10%. Agregue 900 microlitros de glóbulos rojos aislados del donante en cada tubo de microcentrífuga y mezcle bien invirtiendo 10 veces.Se utilizará un simple espectrómetro de transformación total de reflexión total de cuatro transformación de sobremesa Fourier o espectrómetro ATR-FTIR para adquirir el espectro. Preparar y limpiar el cristal mediante el uso de toallitas sin pelusas humedecidas con agua ultrapura para frotar suavemente el cristal en un movimiento circular. Luego, usa otra toallita sin pelusas para secar bien el cristal.Tome una medida de fondo del aire haciendo clic en Medición de fondo. Cada 20 minutos, limpie el cristal y repita esta medición. Abra la vista en vivo haciendo clic en Vista previa.Observe una línea base plana y horizontal que indique que el cristal está limpio. Pipetear 10 microlitros de agua desionizada directamente sobre el centro del cristal y haga clic en Medir muestra. Seque el cristal con una toallita sin pelusas y un suave movimiento circular.Pipetear 10 microlitros de muestra en el centro del cristal y haga clic en Medir muestra. Limpie el cristal entre las muestras. En esta demostración, el análisis de datos multivariante se realizará utilizando MATLAB.Para iniciar el tratamiento de datos, introduzca el análisis en la ventana de comandos para abrir la interfaz gráfica de usuario. Haga clic con el botón derecho en el cuadro X para buscar Importar datos. Seleccione el tipo de archivo para el análisis.Importe los espectros de muestra, agua y línea base como conjuntos de datos en el lugar de trabajo seleccionando todos los espectros de cada conjunto por separado, haciendo clic en Abrir y dando a cada conjunto un nombre corto. Haga clic en Nueva variable en la ventana de comandos y asigne al vector el nombre Parasitemia. Introduzca la Parasitemia de cada muestra.Haga clic con el botón derecho en el cuadro X para buscar Datos de trazado. Haga clic en el icono Datos de trazado para trazar los datos. Inspeccione los espectros en busca de efectos de vapor de agua haciendo clic en Zoom y haciendo zoom en 1, 800 a 1, 400 por centímetro, más claramente observado como picos cortos, agudos y estrechos a lo largo de las laderas de las bandas Amide I y Amide II.En casos de vapor de agua extremo, abra la pestaña Editar datos de preproceso y seleccione Suavizado. Reduzca el ruido y/o las fuertes contribuciones de vapor de agua al suavizar la muestra y los espectros de agua. Después de un tratamiento de datos adicional como se describe en el protocolo de texto, abra la pestaña Editar datos y, en las variables de columna, seleccione 2980 a 2800 por centímetro y de 1750 a 850 por centímetro asegurándose de que solo sus casillas estén marcadas.Los datos ya están listos para su análisis. Para realizar el análisis de componentes principales o PCA, haga clic en Descomposición de análisis y seleccione PCA. Haga clic en Generar modelo.Observe el límite de confianza del 95%, el anillo discontinuo, en la gráfica de puntuaciones entre PC 1 y PC 2. Utilice la herramienta Seleccionar espectro para marcar los espectros de muestra con puntuaciones que se producen fuera del límite como valores atípicos potenciales. Para realizar la regresión de mínimos cuadrados parciales o PLSR, haga clic en Regresión de análisis y seleccione PLSR.Haga clic con el botón derecho en el bloque Y y seleccione el modelo de compilación Parasitemia vectorial. Analice el modelo de regresión y el vector de regresión e identifique las bandas biológicas. Una gráfica de regresión de mínimos cuadrados parciales de RBC aumentada entre el cero y el uno por ciento de Parasitemia generó un valor R cuadrado de 0,87 y un error de validación cruzada al cuadrado medio de raíz de 0,13%Parasitemia.Esto demuestra la capacidad del modelo para predecir la Parasitemia en cada muestra con el Parasitemia conocido en el eje X y el Parasitemia predicho en el eje Y. El coeficiente de regresión asociado describe la contribución de cada banda a la capacidad predictiva del modelo. Cuanto más intensa es la banda, más contribuye al modelo, y por lo tanto, cómo el parásito altera la composición química de la sangre.Los resultados muestran que la señal de los parásitos es lo suficientemente distinta de los RBC que se pueden utilizar para formar un modelo de regresión lineal para la predicción de parásitos en conjuntos de datos futuros. Una vez masterada, esta técnica puede tardar menos de tres minutos por muestra si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar limpiar los cristales ATR de todos los residuos.Después de este procedimiento, otras especies de malaria como P vivax y P malariae pueden ser modeladas con el fin de responder a preguntas como, ¿Es la espectroscopia ATR-FTIR lo suficientemente sensible como para distinguir entre especies? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioespectroscopia exploraran la detección y cuantificación de otros patógenos transmitidos por la sangre e incluso analizaran en la sangre como la glucosa y la urea. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de la espectroscopia ATR-FTIR y el análisis NVDA para construir un modelo de regresión.No olvide que trabajar con muestras de sangre y malaria del paciente puede ser peligroso, y siempre se debe realizar un entrenamiento y contención adecuados a nivel de bioseguridad al intentar este procedimiento.

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Investigación

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Chemistry

Química

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Este protocolo describe un ensayo de inmunoadsorción enzimática en sándwich para detectar esporozoítos de glándulas salivales en mosquitos. Mediante el uso de anticuerpos monoclonales fácilmente disponibles, el método permite la detección rentable y de alto rendimiento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax. El método es adecuado para la investigación de la transmisión del paludismo, incluidos los estudios de vectores.

Detección de esporozoítos de Plasmodium en mosquitos Anopheles mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas

El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .

Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles

Aquí describimos un nuevo método para ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad celular a Plasmodium durante la etapa sanguínea de la infección. Este es un ensayo in vitro que mide la destrucción de glóbulos rojos infectados por linfocitos citotóxicos.

In vitro Ensayo de destrucción de glóbulos rojos infectados con plasmodio por linfocitos citotóxicos

Aprende a detectar y cuantificar Plasmodium falciparum en glóbulos rojos mediante espectroscopia ATR-FTIR y análisis multivariante. Este método portátil mejora el diagnóstico rápido de malaria.

Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes (Video) | JoVE Journal

Detección y cuantificación de Plasmodium falciparum en acuosa glóbulos rojos por espectroscopia infrarroja de atenuada Total reflexión y análisis de datos multivariantes

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