Name: Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprende a detectar Mycobacterium tuberculosis en ratones mediante imagen con reportero enzima fluorescencia. Este protocolo permite estudios longitudinales que mejoran el poder estadístico en investigación de patogénesis, terapéutica y vacunas.

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Estudios en animales se realizaron conforme a los lineamientos y regulaciones establecidas por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de Texas A & M University. Revisión y aprobación de un oficial de seguridad de sustancias biopeligrosas o Comité en su institución pueden ser necesarios.
PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos requieren contención BSL3. El personal se requiere usar equipo de protección personal en todo momento. Todas las manipulaciones se realizan dentro del gabinete de seguridad de la biotecnología (BSC) y los sostenidos se desechan en contenedores de objetos punzantes. Las superficies de trabajo y BSC se limpian con etanol tamponado de fenol y el 70% antes de iniciar el trabajo y después del trabajo. Procedimientos normalmente se haría en el nivel de bioseguridad 3 con Mycobacterium tuberculosis, pero para ilustración o filmación, los autores demuestran estos procedimientos en el nivel de bioseguridad 2 con bacterias menos virulentas.
1. las cepas y condiciones de la cultura
Nota: Cepa de M. tuberculosis CDC1551 se utiliza en este estudio, pero cualquier cepa de M. tuberculosis puede utilizarse de la misma manera.
<ol><li>Crecen las bacterias en M-OADC-TW (7H 9 caldo suplementado con 0.5% de glicerol, el ácido oleico 10% dextrosa complejo sin catalasa y 0.05% Tween-80) medio pie a 37 ° C a un OD600 de 0.5 (~ 0,2 x 107 CFU).</li>
	<li>Diluir la cultura en M-OADC-TW (serie de la 1:10 diluciones de las bacterias). Las diluciones de las bacterias de la placa (105106107108) por triplicado en placas de selectivo 7 H 11 para permitir la determinación de UFC.</li>
	<li>Incubar las placas durante cuatro semanas a 37 ° C o hasta que las colonias pueden ser contadas con precisión.</li>
	<li>Centrifugue el inóculo bacteriano a 8.534 x g durante 5 min obtener un pellet. Lavar el precipitado una vez con 10 mL de solución salina (0,9% NaCl) y resuspender la pastilla en 15 mL de solución salina (0,9% NaCl).</li>
</ol>2. infección aerosol de ratones usando un compartimiento de Madison
<ol><li>Permiten ratones se adapte a los nuevos alrededores durante una semana.</li>
	<li>Peso de los ratones antes de cargar en la cámara.</li>
	<li>Conectar tres cables a la regleta: el poder de la cámara principal, la bomba de vacío y compresor de aire, en ese orden.</li>
	<li>Desenrosque con cuidado el tarro de cristal. Al gabinete de seguridad de la biotecnología la jarra y añadir el inóculo de desafío suspendido en 15 mL de solución salina (0,9% NaCl) para lograr ~ 104 - 106 UFC de bacterias en los pulmones.</li>
	<li>Cierre la tapa de la jarra en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Coloque la jarra en la unidad nebulizadora y ajustar el tubo vertical de acero inoxidable para que el extremo inferior (aspiración) es alrededor de un cuarto de pulgada por debajo del nivel del líquido en la jarra.</li>
	<li>Todos los animales necesarios para el experimento (la cámara puede contener hasta 90 ratones) en la cámara de carga y cierre todos los pestillos de la puerta.</li>
	<li>Compruebe el principal (sala) medidor de flujo de aire. Asegúrese de que el centro del flotador (pelota) corre unos 50 L/min medido en la escala de la izquierda.</li>
	<li>Presione el botón Start en el panel de control de la cámara. Establecer la tasa de flujo de aire a través del medidor de flujo de aire de compresor (el medidor más pequeño en la izquierda) 4 L/min en la escala. Verifique visualmente que el inóculo de desafío es ser nebulizado.</li>
	<li>Después de 15 minutos, cuando aparece la luz roja en la parte frontal del panel de control y una señal acústica indica el final de la carrera, pulsa el botón de Reset en la esquina inferior derecha del panel de control para restablecer los temporizadores.</li>
	<li>Mantenga pulsado el botón rojo pequeño en la puerta de la cámara para liberar el vacío.</li>
	<li>Abrir la puerta y retirar los animales. Coloque el ratón en sus jaulas.</li>
	<li>Retire el frasco nebulizador de vidrio y coloque en un contenedor de transporte sellados, a prueba de fugas. Colocar el recipiente dentro del gabinete de seguridad biológica y desechar la suspensión del desafío en un contenedor de residuos designado.</li>
	<li>Coloca el frasco nebulizador usado dentro de una bolsa de biohazard y selle el bolso para el transporte a la autoclave.</li>
	<li>Al final del procedimiento la infección, rocíe el interior de la cámara con tampón fenol y 70% etanol y permitir a la cámara por 10 minutos.</li>
	<li>Luego, limpie todas las superficies internas accesibles muy a fondo. Dispone de todas las toallas de papel contaminadas, etcetera. en la basura de biohazard. Autoclave de la basura, recipiente para residuos y utiliza frascos de nebulizador.</li>
	<li>Vuelva a colocar los animales en la sala de contención hasta el punto de tiempo de proyección de imagen.</li>
	<li>En el día de la proyección de imagen, transferencia de los animales en un contenedor secundario a la sala de proyección de imagen.</li>
</ol>3. animal anestesia
<ol><li>Anestesiar los ratones con isoflurano utilizando un sistema de anestesia de gas modificado para requisitos particulares.</li>
	<li>Pesar cada uno de los dos cartucho de filtro de carbón situado encima de la unidad de anestesia.</li>
	<li>Reemplace con un nuevo envase si el peso es de 50 g por encima del peso inicial.</li>
	<li>Revise la unidad vaporizador para asegurar suficiente isoflurano para el procedimiento.</li>
	<li>Coloque el soporte del cono de nariz dentro de la cámara de proyección de imagen. Coloque el número de vástagos requeridos para el procedimiento y las aberturas restantes con los bloqueadores del cono de nariz.</li>
	<li>Encienda el suministro de oxígeno de la botella de alta presión y ajuste de 55 psi.</li>
	<li>Encienda la bomba de evacuación situada en frente de la unidad de anestesia y establezca en 8 L/min.</li>
	<li>Gire la palanca de oxígeno situada en frente de la unidad de anestesia.</li>
	<li>Encender el flujo de gas a la cámara de inducción de la anestesia para activar el flujo de gas a 1,5 L/min a su vez el flujo de gas.</li>
	<li>Encender el flujo de gas a la cámara de proyección de imagen para activar el flujo de gas en 0.25 L/min a su vez el flujo de gas.</li>
	<li>Encienda el vaporizador de isoflurano y ajuste de 2-2.5%. Ajustar el nivel de isoflurano según el número y peso de los animales siendo utilizados para el experimento girando el dial en el vaporizador de isoflurano (2-2.5% para un ratón de 20 g de peso; 4% para un conejillo de Indias con 300 g de peso).</li>
	<li>Colocar el ratón en la cámara de anestesia y cierre la tapa. Encender el flujo de gas a la cámara de inducción de la anestesia.</li>
	<li>Deja los ratones en la cámara de inducción de anestesia para 5-10 min hasta que totalmente anestesiados.</li>
	<li>Una vez que los ratones son anestesiados, aplique un ungüento óptico a los ojos para protegerlos durante la proyección de imagen.</li>
	<li>Colocar los ratones en recumbency ventral o esternal que sus narices se colocan en el cono de nariz para facilitar la anestesia de los ratones durante el procedimiento de proyección de imagen.</li>
</ol>4. reportero enzima fluorescencia (REF) la proyección de imagen
<ol><li>Inyectar el sustrato (20 μm, 2.5 μl/g de peso) por inyección intraperitoneal en el infectado, así como los ratones de control. Los ratones son bajo anestesia dentro de la cámara de proyección de imagen de menos de 1 minuto.</li>
	<li>Iniciar el sistema de proyección de imagen.</li>
	<li>Inicializar el sistema haciendo clic en inicializar. Espere hasta que la barra de temperatura se convierte en verde. Nota: La sala de proyección de imagen consiste en una plataforma calentada para mantener la temperatura corporal del animal mientras que la proyección de imagen.</li>
	<li>Valor de adquisición de imágenes, seleccione fluorescente | Trans-iluminación para el animal entero o Epi-iluminación para los tejidos del pulmón, estructura y recubrimiento en Panel de Control de adquisición.</li>
	<li>Establecer campo de vista B ratón y lámpara a alta.</li>
	<li>Establecer tiempo de exposición en auto, medio binning, 2-3 f/stop y filtro de la excitación a los filtros de 745 nm y de emisión de 780 nm a 840 nm.</li>
	<li>Para la configuración de la secuencia, haga clic en configuración de la secuencia, seleccione puntos de Trans-iluminación de 9-12 en el área pulmonar.</li>
	<li>Haga clic en adquirir para la adquisición de la imagen.</li>
	<li>Coloque el ratón en la imagen de la jaula.</li>
	<li>Controlar los ratones hasta que se recuperó completamente o sacrificio para la cuantificación de UFC si la proyección de imagen en un momento del experimento. Realizar una cuenta de Karnofsky modificada para supervisar el bienestar de la proyección de imagen de ratones.</li>
</ol>5. Análisis de la proyección de imagen de REF
<ol><li>Abra el software de imágenes.</li>
	<li>Cargar archivos de imagen haciendo clic en el icono de navegación.</li>
	<li>Para unmixing espectral, haga clic en Unmixing espectral en la paleta de herramientas y haga clic en los espectros necesarios para separar. Haga clic en Inicio idear.</li>
	<li>Reconstrucción óptica de la superficie, haga clic en la topografía de la superficie.</li>
	<li>Seleccione orientación a dorsal, a ratón de pelaje y, haga clic en generar superficie.</li>
	<li>Draw recortar imagen e imagen de umbral para una región de interés. Haga clic en terminado.</li>
	<li>Para el registro del órgano, ir a la ficha de inscripción en menú herramientas ópticas 3D.</li>
	<li>Registro de órganos de interés en un atlas de órgano.</li>
	<li>Ajuste el tamaño del órgano o lugar a la topografía de la superficie generada utilizando la herramienta de transformación de encendido/apagado situada en las herramientas del panel de registro.</li>
	<li>Ir a fluorescente tomografía de reconstrucción 3D (FLIT), y seleccione analiza tabla seleccionar las imágenes a ser incluidos para el análisis, tipo a la eficacia de la fluorescencia de transmisión normalizado (NTF) de imagen, haga clic en Inicio.</li>
	<li>Verifica en seleccionar todos y reconstruir en la pestaña vista previa de datos.</li>
	<li>Para la cuantificación de la fluorescencia, ir a herramientas de la región de interés (ROI), añadir cubo ROI en el órgano de interés y ajustar el tamaño del cubo: para cubrir el órgano de interés. Haga clic en medir ROIs 3D.</li>
	<li>En la ventana de mediciones del ROI, ir a mediciones de ROI 3D, seleccione el tipo de datos a la unidad de voxels y mediciones de fuente a pmolM-1cm-1.</li>
	<li>Guardar o exportar el resultado del análisis de reconstrucción 3D de revoloteo en un archivo de datos o figura.</li>
</ol>6. cuantificación de bacterias por UFC
<ol><li>Eutanasia por inyección intraperitoneal de 0,1 mL pentobarbital sódico (390 mg/mL) a los ratones.</li>
	<li>Busque el reflejo pedal apretando las almohadillas de las patas de los ratones para asegurar que no es ninguna reacción refleja.</li>
	<li>Explante el tejido del pulmón de los ratones usando tijeras y pinzas estériles. Homogeneizar el tejido pulmonar en 1 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Hacen diluciones seriadas 10 veces del homogeneizado de pulmón estéril de 1 x PBS.</li>
	<li>Para planchado, punto tres alícuotas de 20 μl de la dilución correspondiente en la placa de agar.</li>
	<li>Incubar las placas en una incubadora a 37 ° C y monitor para crecimiento bacteriano.</li>
	<li>Contar las colonias en cada punto después del tiempo de incubación y expresan como UFC / mL mediante la corrección para el volumen y dilución utilizando la siguiente ecuación: UFC / mL = (V/C) x M Donde C = recuentos de colonias por punto, V = volumen de muestra inoculado en cada placa (mL) y M = factor de multiplicación (recíproco de la dilución utilizada). Nota: Si se cuentan las 11 colonias en un punto determinado para un volumen de muestra de 0,002 mL en una dilución de la muestra de 10-4, utilizando la ecuación, el recuento de colonias se calculará como (11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 UFC / mL</li>
</ol>

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Al usar técnicas de imagen, como referencia, hay estrategias claves que permitan la generación de datos robustos y consistente. La proyección de imagen óptica produce luz dispersada en tejidos que puede afectar la profundidad de penetración, ya que es difícil de capturar la luz emitida en todas direcciones. Uso de un fluoróforo de infrarrojo cercano (NIR) sustrato para referencia la proyección de imagen con una longitud de onda de excitación y emisión en el Querange de 700-900 nm facilita absorción mínima de la señal fluorescente por los tejidos mamíferos. El sustrato personalizado diseñado fue construido uniendo un fluoróforo NIR, IRDye 800Cw a un extintor, IRDye QC-1, por un anillo de lactama permitiendo que energía de fluorescencia resonancia basada en transferencia apagando. IRDye tiene penetración excelente del tejido y las características de dispersión de luz y no tiene ningún efecto perjudicial evidente en mamíferos36, se despejó de la sangre y órganos por 24 h. fluorescencia señal significativamente aumenta comenzando 4 horas después de Administración de sustrato, alcanzando máximos niveles 6 h después de la administración.
La dosis infecciosa bacteriana, modo de administración de la dosis infectiva y el sustrato, así como momentos de post infección de imagen mediante la realización de estudios piloto deben estandarizarse antes de embarcarse en experimentos grandes y complejos. Estudios piloto pueden reducir tiempo y costo cuando proyección de imagen un gran número de animales porque un procedimiento estándar puede optimizarse antes de hacer el experimento clave. Cargas bacterianas deben determinarse en los órganos/tejidos de interés tras la proyección de imagen de cuerpo entero con trans-iluminación y ex vivo lung proyección de imagen usando epi-iluminación para validar la fuente de la señal y determinar la calidad de la correlación con números bacteriana presente8. Estudios piloto proporcionan la penetración en el umbral de detección, rango dinámico de la técnica, así como determinación de las condiciones experimentales óptimas para la proyección de imagen.
Las principales ventajas de la utilización de imágenes como referencia en comparación con otras estrategias fluorescentes y bioluminiscentes son su alta sensibilidad y capacidad para obtener imágenes naturales de M. tuberculosis cepas. REFERENCIA la proyección de imagen utiliza la robusta catalítico enzima BlaC que se conserva en todos los aislamientos clínicos de M. tuberculosis y cepas del complejo tuberculosis. La gran sensibilidad de la proyección de imagen de referencia es debido a la rápida tasa catalítica de BlaC en combinación con la retención del producto fluorescente hendido por la célula huésped. Señal aumenta continuamente siempre y cuando el sustrato está disponible dando por resultado la acumulación casi ilimitada de la señal dentro de las células infectadas y los tejidos. Este aumento de la sensibilidad de referencia la proyección de imagen en comparación con alternativas de proyección de imagen permite detección específica de M. tuberculosis tanto en vitro y en vivo8,23,24, 29.
REFERENCIA la proyección de imagen puede utilizarse para la detección de bacteria sin modificaciones genéticas, lo que permite su aplicación directa a cualquier modelo de infección, ya sea laboratorio animales8,37 o materiales clínicos humanos29,38 . REF puede utilizarse para detectar y una amplia gama de patógenos39,40, de la imagen desde sustratos fluorógenos pueden ser convertidos para numerosos objetivos enzimáticos distintos BlaC como proteasas, quinasas, ureases y β-galactosidases. Sin embargo, cuidadosa se debe reflexionar en el destino con el fin de asegurar muestra características óptimas para la proyección de imagen. BlaC representa una enzima buen modelo de características que aseguren la aplicación exitosa de esta estrategia. REF la proyección de imagen proporciona una lectura inmediata en la carga bacteriana presente en los pulmones durante las infecciones, que acelera mucho progreso en el estudio de la patogenia de la tuberculosis, ya que la determinación del número de bacteria normalmente requiere tres a seis semanas, pero incluso en más organismos de crecimiento rápido este enfoque permitirá ahorrar mucho tiempo. REF también podría ser utilizado para diferenciar carcinomas de tuberculosis, un problema clave en el diagnóstico de lesiones nodulares en pacientes41,42. REF sirve como una novedosa herramienta para acelerar la proyección de imagen de tuberculosis traslacional y se puede aplicar incluso a los seres humanos, potencialmente permitiendo rápida predicción de resultados terapéuticos.

El lento crecimiento de M. tuberculosis es un importante obstáculo en el diagnóstico rápido de tuberculosis1,2,3. Mientras que cultura base diagnóstico toma semanas para producir resultados, citología ácido-rápida tiene limitaciones diagnóstico4 en niños5 y en pacientes coinfectados con virus de inmunodeficiencia humana6,7. Tecnologías ópticas de proyección de imagen han sido reconocidos recientemente como una alternativa a los tradicionales métodos de diagnóstico para tuberculosis8,9. Bioluminiscencia y fluorescencia permite imagen ópticamente de M. tuberculosis en animales vivos en tiempo real10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imágenes ópticas tiene el beneficio de una evaluación rápida y específica de una infección con M. tuberculosis20,21,22.
Describiremos los datos de proyección de imagen óptica de M. tuberculosis en ratones vivos usando a REF. Este método es muy específico y sensible23,24 y, similar a otros métodos ópticos, es menos costoso que otros métodos de la tuberculosis (TB)25, incluyendo la tomografía computada (CT)26, magnética de la proyección de imagen resonancia por imágenes (MRI)27y F-fluorodeoxyglucose tomografía por emisión de positrones/TC (F-FDG PET/CT)28. REF utiliza sustratos fluorescentes o bioluminiscentes personalizados que al escote de una enzima bacteriana, producen un producto fluorescente8,29. Por lo tanto, tiene la ventaja de no requerir un reportero micobacterias recombinante cepa30,31. El sustrato de traste que se describe está compuesto por un fluorocromo y un extintor conectado por un anillo β-lactámico que es hidrolizado por BlaC (β-lactamasa), naturalmente expresada constitutivamente complejo tuberculosis Mycobacterium8, 32. las bacterias directamente generan señal debido a la actividad catalítica de referencia que permite la amplificación por muchos órdenes de magnitud y sensibilidad detección de M. tuberculosis.
El sustrato de referencia utilizado en este estudio tiene penetración excelente del tejido en los animales vivos y reducido de fondo debido a su longitud de onda larga. Con este sustrato de larga longitud de onda es posible alcanzar un umbral de detección de M. tuberculosis de cerca de 100 colonias formando unidades (UFC) en vitro y < 1000 UFC en los pulmones de ratones in vivo la (todo animal)8, 33. REF puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico para Esputo, materiales clínicos y aún directamente en pacientes con micro sistemas endoscópicos16,32,33,34 debido a su alta sensibilidad y especificidad. REF puede aplicarse a cualquier cepa clínica de tuberculosis, ya que utiliza una enzima bacteriana naturalmente producido, BlaC, para la detección en todas las cepas. Estas características hacen REF imagen una herramienta valiosa en la investigación preclínica de la tuberculosis en general para facilitar la terapéutica y evaluación de la vacuna así como análisis de patogénesis, pero pueden aplicarse también en última instancia a la diagnosis de la tuberculosis pacientes.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td> Solución Fatal Plus <td>sintetizada</td><td></td><td></td>a medida</tr><tr><td></td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Caldo de Middlebrook</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Enriquecimiento de Middlebrook</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Esporcidina</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Agar</td><td>Middlebrook BD 212203</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de Madison</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectro IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8 gas Sistema de anestesia</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Software de imagen</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conos de nariz transparentes</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. tuberculosis cepa CDC1551</td><td>ratones BALB</td>/C hembra ATCC<td></td><td></td></tr><tr><td>, 5-7 semanas</td><td>Laboratorio</td><td></td><td></td> Jackson</tr></tbody></table>

proyección de imagen de tuberculosis del mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Fluorescencia de enzima Reporter (REF) utiliza sustratos específicos para enzimas presentes en los organismos blanco de interés para la proyección de imagen o la detección por fluorescencia o bioluminiscencia. Utilizamos BlaC, una enzima expresada constitutivamente por todas las cepas de M. tuberculosis . REF permite la cuantificación rápida de bacterias en los pulmones de ratones infectados. El mismo grupo de ratones puede ser reflejado en muchos momentos, grandemente reducir costos, la enumeración de las bacterias más rápidamente, permitiendo observaciones novela en interacciones huésped-patógeno y aumentar el poder estadístico, puesto que fácilmente se mantienen más animales por grupo . REF es extremadamente sensible debido a la naturaleza catalítica de la reportera enzimática BlaC y específicos debido a la transferencia de energía de resonancia medida de fluorescencia (FRET) o sustratos fluorógenos utilizados. REF no requiere cepas recombinantes, asegurando la normal relación huésped-patógeno. Describimos la proyección de imagen de M. tuberculosis infección usando un substrato de traste con emisión máxima a 800 nm. La longitud de onda del sustrato permite proyección de imagen sensible tejido profundo en mamíferos. Se esbozarán infección por aerosol de ratones con M. tuberculosis, anestesia de los ratones, la administración del substrato REF y la proyección de imagen óptica. Este método se ha aplicado con éxito para evaluar interacciones huésped-patógeno y eficacia de los antibióticos contra M. tuberculosis.

REFERENCIA la proyección de imagen de ratones infectados con M. tuberculosis junto con ratón de control no infectados se muestran en la figura 1A. Los ratones infectados producen un significativamente (P = 0.0057) señal de fluorescencia más alta de los pulmones en la infección después de 6 semanas en comparación con el control sobre la administración del substrato. Un curso de tiempo típico para el estudio de la eficacia terapéutica contra M. tuberculosis usando REF podría ser la proyección de imagen en semana 1, 2, 4, 6, 15, 24 post-infección. Intensidad de la fluorescencia se cuantifica usando epi-iluminación para tejidos pulmonares (figura 1B). La señal constantemente cada vez mayor de la semana 2 a semana 6 en pulmones de ratones infectados sugiere que REF con éxito capaces de detectar M. tuberculosis in vivo. Una caída en la señal de fondo de los ratones de control en un momento de tiempo posterior (figura 1B) podría atribuirse al aumento de cuerpo masa y volumen de los ratones durante un período de 6 semanas, reduciendo la penetración de la longitud de onda de excitación. Reconstrucción 3D del REVOLOTEO de las fuentes de fluorescencia en ratones infectados con M. tuberculosis está representada en la figura 2A. Las secuencias de imágenes se adquieren en varios puntos de trans-iluminación en ratón usando la misma excitación y serie de filtros de emisión. Estas secuencias de imágenes se utilizan entonces para reconstrucción 3D de revoloteo para distribución de código fuente fluorescente dentro del tema animal. Figura 2 A-D muestra las diversas direcciones (coronal, sagital y transaxial) de tomografía de ratón con registro de órgano pulmón. Eficiencia NTF mapas para comprobar la calidad de la reconstrucción están representados en la figura 2E. NTF permite restar la salida de luz de fondo de imágenes trans-iluminación a través de una imagen adicional capturada con filtro de densidad neutra. La imagen tomada con el filtro de la excitación específica (figura 2E-medido) está normalizada a la imagen de transmisión medida con el mismo filtro de emisión y un filtro de excitación abierto (figura 2E simulado) para dar la señal producida por el sustrato solo. El similar medido y simulado NTF Perfil de eficacia en tanto la horizontal (figura 2F) y perfiles (figura 2G) con casi 0% porcentaje error (figura 2E % error) proporciona evidencia de una reconstrucción 3D de buena calidad con reducción de artefactos y localización de señal mejorada y sensibilidad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Figura 1 . Proyección de imagen de M. tuberculosis con Ref (A) en vivo la proyección de imagen de ratones no infectados e infectados con M. tuberculosis en 2, 4 y la infección después de 6 semanas. La barra de color representa la intensidad de la señal fluorescente en fotones por segundo por cm2 de baja (amarillo) a alta (rojo). (B) cuantificación de la intensidad de la fluorescencia de ratones infectados con M. tuberculosis. Valores de fluorescencia para el control de ambos (negro) e infectado (rojo) se representa junto con el error estándar para cada punto del tiempo. La importancia de los resultados se determinó por los estudiantes t-test, valores de p de &lt; 0,05 se consideraron significativos. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Figura 2 . Reconstrucción 3D del REVOLOTEO de las fuentes de fluorescencia en ratones infectados con M. tuberculosis. Tomografía de ratón en distintas direcciones; A) coronal, B) sagital y C) transaxial con registro de órgano D) pulmonar. La región 3D de interés (ROI) se representa como un cubo rojo en el pulmón para las mediciones de la fuente. (E) eficiencia NTF mapas de medido y simulado para comprobar la calidad de la reconstrucción. Se comparó el perfil de eficacia NTF medido y simulado, proporcionando buena calidad de la reconstrucción 3D (similar medida y simulada NTF eficiencia). Señal vertical Horizontal F) y G) perfiles representando a medida (azul) y simula la curva de eficiencia NTF (roja). Las barras rojas horizontales y verticales indican la posición de la fuente. La barra de color representa la intensidad de la señal fluorescente en fotones por segundo por cm2 de baja (azul) a alta (rojo). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Describimos la proyección de imagen óptica de ratones infectados con Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) mediante fluorescencia de enzima reporter (REF). Este protocolo facilita la detección sensible y específica de M. tuberculosis en modelos animales preclínicos para la investigación de la patogenia, terapéutica y vacunas.

Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

El objetivo general de este procedimiento de imagen de fluorescencia enzimática reportera es facilitar la detección sensible y específica de Mycobacterium tuberculosis en modelos animales preclínicos para la patogénesis, la terapéutica y la investigación de vacunas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la tuberculosis, incluidos los mecanismos de virulencia de las especies bacterianas, así como a crear terapias y comprender las vacunas. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es que permite obtener imágenes del mismo grupo de animales en múltiples puntos temporales.Esto reduce en gran medida el costo, nos permite estudiar las interacciones huésped-patógeno y también aumenta el poder estadístico porque se puede mantener un mayor número de animales fácilmente al mismo tiempo. Para empezar, cultive cualquier bacteria M. tuberculosis en medio MOADCTW a 37 grados Celsius hasta una densidad óptica de 0,5 medida a 600 nanómetros. Todos los procedimientos que impliquen la manipulación de materiales infecciosos deben realizarse dentro de cabinas de bioseguridad u otros dispositivos de contención física aprobados.Una vez listo, hacer una serie de una a 10 diluciones del cultivo en el mismo medio. A continuación, coloque las diluciones por triplicado en placas selectivas 7H11 para realizar una determinación precisa de la UFC. Incubar las placas durante cuatro semanas a 37 grados centígrados o hasta que las colonias puedan contarse con precisión para determinar la UFC.Antes de configurar una inoculación, asegúrese siempre de que la campana de bioseguridad esté fluyendo aire a 50 litros por minuto. Para preparar un inóculo que pueda infectar hasta 90 ratones, mida la UFC deseada en un tubo de halcón de 15 mililitros. Por lo general, se utilizan entre 10.000 y 1 millón de UFC.A continuación, granule las bacterias. A continuación, lave las bacterias una vez con 10 mililitros de solución salina. Luego suspenderlos en 15 milímetros de solución salina.Luego, en un gabinete de bioseguridad, cargue el inóculo en un frasco de vidrio que pueda conectarse a un nebulizador. A continuación, conecte la unidad nebulizadora y ajuste el tubo vertical de acero inoxidable de modo que el extremo inferior quede aproximadamente un cuarto de pulgada por debajo del menisco de la suspensión. Ahora transfiera el conjunto a la cámara de inoculación en un contenedor de transporte a prueba de fugas.Para continuar, cargue los animales de peso conocido en la cámara de inoculación encendida. En la cámara caben hasta 90 ratones. A continuación, cierre todos los pestillos de la puerta.A continuación, conecte el nebulizador con una abrazadera de acero. Luego presione el botón de inicio en la cámara. Y ajuste el caudal de aire entre tres y cinco litros por minuto.El aire comprimido fluirá a una velocidad de aproximadamente 22 a 26 libras por pulgada cuadrada y, lo que es más importante, debería ser posible ver la niebla de inóculo en la cámara. Después de 15 minutos, aparecerá una luz roja en la parte frontal del panel de control y una señal audible indicará el final de la carrera. Luego presione el botón de reinicio para reiniciar los temporizadores.Para liberar el vacío, presione el pequeño botón rojo en la puerta de la cámara. Luego abra la puerta de la cámara y devuelva los ratones a sus jaulas de origen. En el futuro, mantenga a los animales en la sala de contención.A continuación, regrese el frasco y el contenedor de transporte al gabinete de bioseguridad. Allí, deseche la suspensión bacteriana restante en un contenedor de desechos designado. A continuación, coloque el frasco de nebulizador usado dentro de una bolsa de riesgo biológico y selle la bolsa para transportarla al autoclave.Para limpiar la cámara, rocíe las superficies interiores con fenol tamponado y etanol al 70%. Permita que estas soluciones reaccionen en esas superficies durante 10 minutos. A continuación, límpialos a fondo.Deseche todas las toallitas en la basura de riesgo biológico. A continuación, autoclave la basura, el contenedor de residuos y los tarros de nebulizador usados. Transfiera a los animales a la sala de imágenes.Allí, anestesiar a un animal según el protocolo de texto e inyectarle sustrato de contraste mediante inyección intraperitoneal. En el software de sistemas de imágenes, inicialice el sistema y continúe cuando la barra de temperatura se vuelva verde. Después de inicializar el sistema, coloque el mouse en la cámara de imágenes.Asegúrese de que sus fosas nasales estén dentro del cono de la nariz para que reciba anestesia durante la toma de imágenes. Ahora regrese a la computadora. En el panel de control de adquisición, seleccione fluorescencia, transiluminación, para la visualización de animales completos, o epiiluminación para ver los tejidos pulmonares.Para un solo ratón, establezca el campo de visión en B y el nivel de la lámpara en alto. Para la exposición, utilice el tiempo automático, el agrupamiento medio y dos o tres para el F/Stop. A continuación, ajuste el filtro de excitación a 745 nanómetros y los filtros de emisión de 780 a 840 nanómetros.A continuación, vaya a la configuración de la secuencia y seleccione de nueve a 12 puntos de transiluminación en el área de interés. Ahora presione el botón adquirir para recopilar imágenes. El análisis de imágenes se trata en el protocolo de texto.Para analizar el alcance de la infección, se debe sacrificar al ratón con pentobarbital sódico. Asegúrese de verificar si hay un reflejo de pedal para asegurarse de que el animal sea sacrificado. Y luego explantar los pulmones usando una disección estándar.A continuación, homogeneizar el tejido pulmonar en un mililitro de PBS. A continuación, realice una dilución en serie diez veces mayor de la homogenenia utilizando PBS. Coloque la homogeneidad diluida por triplicado e incube la placa a 37 grados centígrados hasta que se puedan contar las colonias.A continuación, utilice la puntuación de la UFC para medir la gravedad de la infección. Los ratones fueron tratados como se describe. Se utilizó un sustrato REF para ver la progresión de M. tuberculosis.La fluorescencia se cuantificó mediante transiluminación. Y aumentó de la semana dos a la semana seis en los ratones infectados. La ligera caída de la señal en los ratones de control podría atribuirse al aumento de la masa corporal y el volumen durante el período de seis semanas.La reconstrucción 3D FLIT de fuentes de fluorescencia se realizó a partir de múltiples puntos de transiluminación utilizando la misma excitación y serie de filtros de emisión. Se elaboraron mapas de eficiencia NTF para comprobar la calidad de la reconstrucción. La imagen tomada del filtro de excitación específico se normalizó a la imagen de transmisión realizada con el mismo filtro de emisión y un filtro de excitación abierto.Esto proporciona una señal producida solo por el sustrato. Casi no hubo errores en la reconstrucción. El examen de la eficiencia NTF de los datos tanto en la vista horizontal como en la vertical mostró una estrecha correlación.Por lo tanto, la reconstrucción 3D tuvo pocos artefactos, mejoró la localización de la señal y mejoró la sensibilidad en comparación con otros métodos. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la tuberculosis exploraran la eficacia terapéutica de los fármacos contra Mycobacterium tuberculosis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo infectar ratones a través de la ruta de aerosol con Mycobacterium tuberculosis con imágenes ópticas de seguimiento utilizando el sustrato REF.

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Métodos para obtener imágenes de bioluminiscencia de las infecciones bacterianas en los animales vivos se describen. Los patógenos son modificadas para expresar luciferasa permitiendo imágenes ópticas de todo el cuerpo de las infecciones en los animales vivos. Los modelos animales pueden ser infectados con agentes patógenos que expresan luciferasa y el curso de la enfermedad como resultado visualizado en tiempo real de imágenes de bioluminiscencia.

Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Fuente: de Vries, C. R., et al., Un modelo de inoculación retardada de infección crónica de heridas por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demuestra una técnica de imagen bioluminiscente para monitorizar la progresión de la infección bacteriana en un modelo murino vivo. Las bacterias patógenas diseñadas con el sistema reportero luxABCDE emiten luz en el lugar de la infección, permitiendo la visualización de bacterias metabólicamente activas. Al imaginar el ratón a lo largo...

Imagen bioluminiscente de infecciones bacterianas en ratones

Fuente: Valentine, M. E., et al., Generación de mutantes de deleción génica en cuadro en Pseudomonas aeruginosa y pruebas de atenuación de virulencia en un modelo simple de infección en ratón. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra el uso de un enfoque de imagen basado en bioluminiscencia para monitorizar la infección bacteriana en un modelo de ratón vivo. La imagen secuencial bioluminiscente y de rayos X permite la visualización en tiempo real y la localización anatómica de la infección...

Imagen en tiempo real de infección bacteriana en un modelo murino utilizando bioluminiscencia

Fuente: Behera, R. K., et al. Un método basado en fluorescencia para estudiar la regulación génica bacteriana en tejidos infectados. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo muestra un método para preparar tejido renal infectado de ratón, teñir ADN y detectar la expresión génica bacteriana utilizando dos reporteros fluorescentes. El rojo marca todas las bacterias y el verde resalta las células sensibles a la infección.

Imagen por fluorescencia de la colonización bacteriana en tejido renal de ratón

Este video muestra las imágenes de fluorescencia de enzimas reporteras (REF) para la detección in vivo de la infección por Mycobacterium tuberculosis. A los ratones infectados se les inyecta intraperitonealmente un sustrato para la obtención de imágenes REF. Al ser hidrolizado por la enzima bacteriana β-lactamasa, el sustrato emite fluorescencia, cuya detección ayuda a la evaluación de la infección.

Imágenes de fluorescencia enzimática reportera para el seguimiento in vivo de infecciones bacterianas

Este video muestra un método para rastrear infecciones virales en modelos de ratón utilizando un virus de influenza A bi-reportero que expresa luciferasa y proteínas de fluorescencia. Este método permite realizar estudios tanto in vivo como ex vivo, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la dinámica viral y los efectos de las intervenciones.

Un virus de la influenza indicador fluorescente de luciferasa para rastrear infecciones virales

Imágenes multimodalidad es un enfoque valioso para el estudio de la colonización bacteriana en los modelos animales pequeños. Este protocolo describe la infección de ratones con...

4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

Combinado de imágenes ópticas y μCT en un modelo de ratón de infección implante ortopédico, la utilización de una cepa bioluminiscente ingeniería de Staphylococcus aureus, siempre que la capacidad de supervisar de forma no invasiva y longitudinalmente la dinámica de la infección bacteriana, así como la respuesta inflamatoria correspondiente y cambios anatómicos en la hueso.

Combinado<em&gt; En vivo</em&gt; Óptica y μCT imágenes para vigilar la infección, inflamación y Hueso anatomía en una infección de implantes ortopédicos en ratones

Se describe aquí es un método para el análisis de expresión génica bacteriana en los tejidos animales a nivel celular. Este método proporciona un recurso para el estudio de la diversidad fenotípica que ocurre dentro de una población bacteriana en respuesta al ambiente de tejido durante una infección.

Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

Los virus de la gripe A son patógenos respiratorios contagiosos que causan epidemias anuales y pandemias ocasionales. Aquí, describimos un protocolo para rastrear infecciones virales in vivo usando una nueva luciferasa recombinante y bi-reportero expreso de fluorescencia IAV (BIRFLU). Este enfoque proporciona a los investigadores una excelente herramienta para estudiar IAV in vivo.

Un virus de la gripe Reportero fluorescente de Luciferase para imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprende a detectar Mycobacterium tuberculosis en ratones mediante imagen con reportero enzima fluorescencia. Este protocolo permite estudios longitudinales que mejoran el poder estadístico en investigación de patogénesis, terapéutica y vacunas.

Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

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