Name: Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a analizar la unión de ADN a partículas magnéticas mediante dispersión de luz dinámica y electroforética. Este método permite evaluar cambios en tamaño, polidispersidad y potencial zeta para aplicaciones en biotecnología.

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1. síntesis de nanopartículas magnéticas <ol><li>síntesis de nanopartículas magnéticas estabilizan con citrato (MNPs) <ol><li>Añadir 20 mmol de FECLAS 3 &#8729; 6 H 2 O (5,406 g) y 10 mmol de FECLAS 2 &#8729; 4 H 2 O (1,988 g) en 20 mL de agua bidestilada desoxigenada (agua de ddd). Revuelva obtenida la solución vigorosamente en vaso bajo atmósfera de N 2 con un agitador mecánico hasta obtener una solución transparente.</li>
		<li>Bajo agitación mecánica rápida, añadir 150 mL de 1 M NH 4 OH, gota a gota con embudo (tomar 1 h o más si es necesario). Transferir la solución en un vaso screwable después de agregar todos los NH 4 OH. Tornillo de la solución del recipiente y el calor a 75 ° C durante 30 minutos 
		PRECAUCIÓN: NH 4 OH está clasificado como corrosivo y peligroso para el medio ambiente. 
		Nota: Preparar NH 4 OH solución de alto grado 28% NH 4 OH en agua usando agua desoxigenada.</li>
		<li>Recoger el precipitado negro con imán y lavado con 100 mL de agua de ddd. Repita 3 veces. Añadir 50 mL de 0,5 M tri-sodio citrato dihidrato para precipitar. Tornillo de la nave. 
		Nota: Utilizar solución desoxigenada de tri-sodio citrato dihidrato.</li>
		<li>Volver a dispersar el precipitado mediante sonicación (35 kHz, amplitud del 100%) y un recipiente de calor a 80 ° C por 1 h. 
		Nota: Es necesario un sonicador de suficiente potencia.</li>
		<li>Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Recoger el precipitado usando un imán y eliminar el sobrenadante. Volver a dispersar a barro negro en 50 mL de agua de ddd con sonicador (35 Hz, amplitud de 100%).</li>
		<li>Transferir alícuotas (~ 25 mL) en tubos de centrífuga de 50 mL y agregar 20 mL de acetona. Centrifugue a 2400 x g durante 10 min y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Volver a dispersar precipitado y dializo solución contra agua con dispositivo de diálisis de corte de bajo peso molecular (500-1.000 Da) de volumen adecuado para 24 h. 
		Nota: Prepare el dispositivo de diálisis según fabricante &#39; requisitos de s.</li>
	</ol></li> <li>Síntesis de nanopartículas magnéticas modificadas con polietilenimina ramificado (MNPs_PEI) <ol><li>añadir 2 mL de la solución obtenida de MNPs (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Añadir 38 mL de agua de ddd y someter a ultrasonidos (35 Hz, amplitud de 100%) la suspensión (10 min).</li>
		<li>Bajo agitación mecánica rápida, añadir 10 mL de 10% ramificado polietilenimina (promedio 25 kDa). Agitar la solución para posteriores 3 h</li>
		<li>Recoger precipita con imán y eliminar el sobrenadante. Volver a dispersar precipitado en 20 mL de agua de ddd. Repita 5 veces y luego someter a ultrasonidos la suspensión final (35 Hz, amplitud de 100%).</li>
	</ol></li> <li>Síntesis de nanopartículas magnéticas de partículas modificación con silicona (MNPs_TEOS) <ol><li>añadir 10 mL de la solución obtenida de MNPs (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Añadir 60 mL de agua y 130 mL de etanol. Someter a ultrasonidos solución y agregar 6 mL de 28% NH 4 OH.</li>
		<li>Bajo agitación mecánica rápida, añadir 1 mL de Tetraetilo ortosilicato. Agitar la solución para la posterior h. 12</li>
		<li>Recoger el precipitado negro con imán y lave con 50 mL de etanol (3 veces) y 50 mL de agua (3 veces). Volver a dispersar las partículas en 10 mL de ddd de agua y someter a ultrasonidos la suspensión (35 Hz, amplitud de 100%).</li>
	</ol></li> <li>Síntesis de nanopartículas magnéticas, modificadas con grupos amino (MNPs_APTES) <ol><li>añadir 5 mL de la solución obtenida de MNPs_TEOS (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Agregar 45 mL de agua y 50 mL de etanol. Someter a ultrasonidos solución (35 Hz, amplitud de 100%).</li>
		<li>Bajo agitación mecánica rápida, Añadir 0,5 mL de trietoxisilano (3-aminopropil). Agitar la solución para posteriores 3 h</li>
		<li>Recoger el precipitado negro con imán y lave con 50 mL de etanol (3 veces) y 50 mL de agua (3 veces). Volver a dispersar las partículas en 5 mL de ddd de agua y someter a ultrasonidos la suspensión (35 Hz, amplitud de 100%).</li>
	</ol></li></ol> 2. Síntesis de micropartículas magnéticas <ol><li>síntesis de micropartículas magnéticas estabilizan con citrato (MMPs) <ol><li>añadir 25 mL de 2 M 3 de KNO, 12,5 mL de 1 M de KOH y 205,875 mL de ddd agua en un vaso screwable. Añadir 6,675 mL de 1 M de FeSO 4 durante la agitación magnética. Inmediatamente transferencia buque a un baño de agua precalentada (90 ° C) durante 2 h. 
		Nota: Preparar soluciones KOH en ddd y KNO 3 agua.</li>
		<li>Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Recoger el precipitado negro con imán y lavado con 50 mL de agua de ddd (5 veces). Añadir 50 mL de 0,5 M tri-sodio citrato dihidrato para precipitar. Tornillo de la nave.</li>
		<li>Redisperse el precipitado mediante sonicación (35 kHz, amplitud del 100%) y un recipiente de calor a 80 ° C para precipitado negro recoge 1 h. con imán y lavado con 50 mL de agua de ddd (10 veces).</li>
		<li>Modificar MMP con polietilenimina ramificado (MMPs_PEI), sílice (MMPs_TEOS) y grupos amino (MMPs_APTES) similares al Protocolo de MNPs. Consulte las secciones 2.2, 2.3 y 2.4, respectivamente para más detalles.</li>
	</ol></li> <li>Síntesis de micropartículas magnéticas modificadas con polietilenimina ramificado (MMPs_PEI) <ol><li>añadir 5 mL de solución de MMPs (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Añadir 38 mL de agua de ddd y someter a ultrasonidos la solución (35 Hz, amplitud del 100%, 10 min). Bajo agitación mecánica rápida agregar 10 mL de 10% ramificado polietilenimina (promedio 25 kDa). Agitar la solución para posteriores 3 h</li>
		<li>Recoger el precipitado usando un imán y eliminar el sobrenadante. Redisperse precipitado 20 ml de agua bidestilada. Repita 5 veces y luego someter a ultrasonidos la solución final (35 Hz, amplitud de 100%).</li>
	</ol></li> <li>Síntesis de micropartículas magnéticas modificada con silicona (MMPs_TEOS) <ol><li>añadir 5 mL de solución de MMPs (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Añadir 60 mL de agua y 130 mL de etanol. Someter a ultrasonidos suspensión (35 Hz, amplitud de 100%) y añadir 6 mL de 28% NH 4 OH.</li>
		<li>Bajo agitación mecánica rápida, añadir 1 mL de Tetraetilo ortosilicato. Agitar la solución para la posterior h. 12</li>
		<li>Recoger el precipitado negro usando un imán y lave con 50 mL de etanol (3 veces) y 50 mL de agua (3 veces). Redisperse partículas en 5 mL de agua de ddd y someter a ultrasonidos la suspensión (35 Hz, amplitud de 100%).</li>
	</ol></li> <li>Síntesis de micropartículas magnéticas modificado con grupos amino (MMPs_APTES) <ol><li>añadir 3 mL de solución de MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) en un vaso de vidrio. Agregar 45 mL de agua y 50 mL de etanol. Someter a ultrasonidos la suspensión (35 Hz, amplitud de 100%).</li>
		<li>Bajo agitación mecánica rápida, Añadir 0,5 mL de trietoxisilano (3-aminopropil). Agitar la solución para posteriores 3 h</li>
		<li>Recoger el precipitado negro con imán y lave con 50 mL de etanol (3 veces) y 50 mL de agua (tiempo 3). Redisperse partículas en 3 mL de agua de ddd y someter a ultrasonidos la suspensión (35 Hz, amplitud de 100%).</li>
	</ol></li></ol> 3. Magnética partícula tamaño análisis utilizando DLS <ol><li>tamaño de partícula en agua <ol><li>uso un DLS instrumento que se aplica un posterior dispersión detector de ángulo (173 °) y una longitud de onda del haz de 633 nm. 
		Nota: Back scattering DLS es adecuado para muestras concentradas donde puede evitarse la dispersión múltiple. Dispersión lateral (ángulo 90° de detector) y dispersión hacia delante (15° de ángulo del detector) DLS son convenientes para las partículas más pequeñas y mezcladas partículas, respectivamente.</li>
		<li>Previo a la medición en el agua, someter a ultrasonidos partículas por 3 minutos 
		Nota: Utilizar una solución diluida de las partículas. Para ello, mezcla 9,6 μl de partículas con 96 μl de agua.</li>
		<li>Cuidadosamente pipetee 50 μl de solución de la partícula en látex poliestireno cubetas y evitar formación de burbujas de. 
		Nota: Para cada muestra usar cubeta desechable (véase la tabla de materiales).</li>
		<li>En cuenta la claridad de la cubeta y la dirección del haz de luz. Insertar la celda en el porta muestra y cerrar la cámara de.</li>
		<li>Utiliza los siguientes parámetros de medición: temperatura: 25 ° C, índice de refracción de la fase dispersa (hierro): 2.344; índice de refracción del medio dispersivo (agua): 1,333 
		Nota: Realizar la medida del índice de refracción utilizando un refractómetro para obtener resultados más precisos, especialmente cuando el desarrollo de materiales de la novela o el híbrido.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparación de Stock de ADN, partículas magnéticas y tampón de Binding <ol><li>stock de ADN <ol><li>uso tampón de 10 mM Tris-HCL (pH = 8) para la dilución y almacenamiento de ADN. Utilizar una muestra de ADN estándar que puede ser amplificada específicamente con un protocolo PCR directo en el laboratorio (consulte la sección 5.2 para las condiciones y parámetros de reacción). Para amplificar 498 par base (bp) del gene de xis de control de bacteriófago λ, utilice los siguientes iniciadores. Adelante la cartilla: 5 &#39; - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Revertir la cartilla: 5 &#39; - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 &#39;</li> <li>producto de PCR de purificar mediante kit de purificación de ADN comercial. 
		Nota: Producción de kits comerciales mediante procedimiento basado en la columna de sílice &#62; purificado de 100 ng/μl ADN.</li>
		<li>Medida de concentración de ADN mediante el método espectrofotométrico (absorbancia a 260 nm). Diluir el stock de ADN de 10 11 copias/μl como se indica arriba a soluciones de trabajo de 10 10 10 9 10 8 y 10 7 copias/μl. 
		Nota: El número de copias del producto de PCR se puede calcular según la siguiente ecuación, asumiendo el peso molecular promedio es de 650 Da para cada bp: copias/μl de ADN = (cantidad en ng/μl * 6.022x10 23 copias/mol) / (498 bp * 650 g/mol de bp * 1 x 10 9 ng/g)</li></ol></li> <li>partículas magnéticas <ol><li>permite las partículas de sedimento sin el imán y eliminar el sobrenadante. Mezcla de 1:20 ratio v/v de partículas magnéticas con ddd agua (partículas: agua). 
		Nota: Enfoque basado en el volumen se utiliza para describir cantidades de partículas magnéticas, ya que eran fácilmente difíciles comparar masas iguales de MNPs y MMPs.</li>
	</ol></li> <li>Binding buffer <ol><li>para la preparación rápida de solución de HCL de acetato de sodio de 0.75 M (pH = 6), mezclar 1 mL de acetato de sodio de 3 M con 3 mL de ácido clorhídrico de 1 mM. 
		Nota: Todas las soluciones utilizadas en encuadernación pueden almacenarse a 4 ° C. Nota que baja temperatura aumenta significativamente la Unión particular en el caso de solución de etanol. Controlar la temperatura de las soluciones para la mejor reproducibilidad y exactitud de la detección.</li>
	</ol></li></ol> 5. Pruebas de eficiencia de ADN aislamiento utilizando PCR cuantitativa <ol><li>aislamiento de ADN modificado MMPs o MNPs <ol><li>utilizar una placa de 96 pocillos y un imán personalizado para placa de 96 pocillos para experimentos de pequeño volumen.</li>
		<li>Use el siguiente enlace solución mezcla: 8 μl modificado MMPs o MNPs, 10 μl sodio acetato-HCl (0.75 M, pH = 6), 60 μL de etanol al 85%, 10 μl de DNA (solución de copias de 10 10).</li>
		<li>Mezcla bien mediante pipeteo y coloca la placa sobre el imán durante 3 minutos. Mientras que la placa está en el imán, retirar la solución y añadir 100 μl de etanol al 85% para el lavado.</li>
		<li>Quitar etanol. 
		Nota: Deje que el etanol se seque durante unos segundos pero no deje que las partículas demasiado seco o mostrar grietas. Si las partículas se secan demasiado será difíciles de disolver con solución de elución.</li>
		<li>Extraiga la placa del imán y agregar 40 μl de solución de elución. Mezclar por pipeteo. Coloque la placa en el imán y recoger ADN eluída (~ 37 μL). Almacenar eluyente a-20 ° C hasta análisis.</li>
	</ol></li> <li>PCR cuantitativa <ol><li>utilizar los iniciadores que se utilizaron para preparar stock ADN en el paso 4.1.1 cuantificar copias del gen xis, según el Protocolo por Haddad et al. 10</li> <li>mix master la solución según la cantidad de muestras a ensayar, a continuación, distribuir la mezcla en tubos PCR o una placa de 96 pocillos de fondo blanco.</li>
		<li>Utilizar las siguientes cantidades para un volumen total de la mezcla PCR de 20 μl: 10 polimerasa μl / intercalando mezcla de tinte (véase tabla de materiales), 2 μl de muestra de ADN, primer avance 2 μl (10 μm), primer revés de 2 μl (10 μm)</li>
		<li>Configurar el termociclador según el siguiente programa: 95 ° C por 120 s, 40 ciclos (95 ° C por 15 s, 64 ° C por 15 s, 68 ° C por 45 s), 68 ° C por 5 min</li>
		<li>Triplicado usando estándares y muestras, calcular el umbral de ciclo y construir una curva estándar para estimar el número de copias de ADN obtenido en cada muestra. El instrumento utilizado aquí realiza esto automáticamente.</li>
		<li>, El número de copias de ADN se estima para el volumen de elución total (~ 40 μL). Porcentaje de ADN obtenido corresponde a la cantidad original añadida obligatorio solución (totalmente 10 11 copias) puede variar más allá del intervalo de 0 a 100.</li>
	</ol></li></ol> 6. Utilizando DLS de obligatorio análisis de ADN magnético partículas experimentos <ol><li>Atascamiento de la DNA <ol><li>de gran volumen (en tubo de 1,5 mL), utilizar la siguiente mezcla de solución vinculante: 96 μl modificado MMPs o MNPs, 120 μl sodio acetato-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 μl de etanol al 85%, 120 μl ADN (solución de copias de 10 10) o 120 μl de tampón Tris-HCL (10 mM, pH = 8) para el control de.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de potenciales zeta <ol><li>Prepare dos soluciones de enlace, uno con el ADN y otro con tampón Tris-HCL para control como se indica en el paso 6.1.1. Para evitar formación de burbujas, cuidadosamente pipetear 800 μl de la mezcla obligatoria en una celda disponible. 
		Nota: Use cubeta desechable para medición de potencial zeta superficial (véase la tabla de materiales).</li>
	</ol></li> <li>Utilice los siguientes parámetros para la medición en el instrumento DLS: modelo de Smoluchowski con una F(ka) de 1.5, temperatura: 25 ° C, índice de refracción de la fase dispersa (hierro): 2.344, índice de refracción del medio dispersivo (agua): 1,333. 
	Nota: La tasa de interacción partícula magnética de ADN afecta directamente a la medición de repeticiones. Una sola medición en el instrumento toma s 60-70. Aquí, el instrumento se le ordenó tomar 10 medidas con 1 min de intervalos de retardo. Para simplificar, los resultados se mostrarán en tiempo = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 minutos de la primera lectura.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el presente Protocolo, los principios teóricos que explican la Unión de ADN a las partículas magnéticas vía potencial zeta estaban bajo pregunta. El protocolo describe la síntesis y modificación de nanopartículas magnéticas y micropartículas. También se describen el método para la preparación de la solución de control y enlace de ADN. Aquí se muestran dos estrategias para la detección de interacciones de partículas de ADN: PCR cuantitativa y DLS se acerca. DLS ofrece tres indicadores de cambios fisicoquímicos en las p...

Extracción de ADN es uno de los pasos más esenciales en biología molecular. El desarrollo de métodos de extracción de ácidos nucleicos tiene gran impacto en los campos emergentes de la genómica, la metagenómica, la epigenética y la transcriptómica. Hay una amplia gama de aplicaciones biotecnológicas para el aislamiento de la DNA incluyendo médicos (herramientas forenses y diagnóstico y pronóstico) y aplicaciones medioambientales (diversidad biológica de la metagenómica, prevalencia del patógeno y vigilancia). Ha habido una creciente demanda para purificar y aislar ADN de diversos materiales y en diferentes escalas como sangre, orina, tierra, madera y otros tipos de muestras. 1 , 2 , 3 , 4
Partículas de tamaño nano y micro son convenientes para el aislamiento de ADN debido a su alta área superficial y, en particular cuando puede ser inmovilizados por un campo magnético. Propiedades fisicoquímicas de las partículas, tales como tamaño o carga, pueden influir mucho su capacidad objetivo biomoléculas. 5 para mejorar aún más la Unión de biomoléculas y estabilizar las partículas, se pueden utilizar diferentes modificaciones químicas (capas superficiales). Las muchas estrategias diferentes para el atascamiento se clasifican según las interacciones covalentes y no covalentes. 6 el tamaño de las partículas afecta directamente a sus propiedades de magnetización, considerando que la composición de partículas puede ser adaptado por la incorporación de metal, aleación u otros materiales que pueden influir en su densidad, porosidad y superficie. 7 hay no hay manera confiable para medir la carga superficial de las partículas pequeñas. En cambio, se puede medir potencial eléctrico en el plano de deslizamiento (lejos de superficie de nanopartículas). 8 este valor se llama zeta potencial y es una potente herramienta que se utiliza generalmente para la evaluación de estabilidad de nano y micropartículas por DLS. 9 puesto que su valor depende no sólo el pH y fuerza iónica del medio dispersivo, sino también en las características superficiales de las partículas, puede también probar los cambios en esta superficie causado por la interacción entre el partículas y moléculas de interés. 10
Por otra parte, estructura del ADN en condiciones deshidratado (forma A-ADN) exposiciones conformaciones compactada que facilitan su precipitación (agregación) en comparación a comúnmente ocurriendo forma de B-DNA. Electrostática (iónico y el enlace H) son las principales fuerzas controlando el atascamiento de la DNA a otros materiales debido a su accesible sterically fosfato y nitrógeno bases (sobre todo guanina). 7 , 10
En este trabajo se analizan tres modificaciones químicas representativas de nanopartículas magnéticas y micropartículas (figura 1A). Se describen el método de síntesis y modificación química de nanopartículas y micropartículas. Una solución vinculante, acuerdos de principios teóricos de la precipitación de ADN (pH, fuerza iónica y deshidratación) se utiliza para evaluar la elución y atascamiento de la DNA. PCR cuantitativa se utiliza para evaluar la eficacia de la elución de la DNA de la representante de nanopartículas y micropartículas (figura 1B). Granulometría, índice de polidispersidad y potencial zeta son parámetros importantes que se utilizan para visualizar los cambios fisicoquímicos que ocurren en la superficie de la partícula (figura 1). Es importante destacar en la caracterización química de la superficie de la partícula magnética. Mientras que este paso era más allá del alcance de este protocolo, pueden aplicarse varias técnicas modernas para investigar la eficacia de modificaciones químicas. 11 , 12 , 13 , 14 espectroscopia de infrarrojo de transformación de Fourier (FTIR) puede utilizarse para evaluar el espectro infrarrojo de la superficie de la partícula y se compara con el espectro de modificadores químicos gratis. Espectroscopía de fotoelectrones de rayos x (XPS) es otra técnica que puede utilizarse para identificar la composición elemental de la superficie del material. Pueden utilizar otros métodos electroquímicos, microscópicas y espectroscópicas para arrojar luz sobre la calidad de síntesis de partículas. Este trabajo pone de relieve una nueva perspectiva para el análisis de ADN magnético interacciones de partículas a través de DLS.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de hierro (III) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207926</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (II) tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Sulfato de hierro (II) heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Penta</td><td>10060-11000 Síntesis de</td><td>partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Citrato de sodio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Ortosilicato de tetraetilo</td><td>Sigma-Aldrich 131903</td><td></td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr> <tr><td>(3-aminopropil)trietoxisilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Polietilenimina, ramificada, promedio Mw ~25,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228-M&nbsp;</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Penta</td><td>71250-11000</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Nitrato</td><td>de potasio Sigma-Aldrich</td><td>P6083</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05012</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>membrana de corte de peso molecular (Mw = 1 kDa)</td><td>Laboratorios de espectro</td><td>G235063</td><td>Síntesis</td></tr> <tr><td>de partículas magnéticasAgitador de techo</td><td>con Labortechnik GmbH</td><td>DH. WOS01035</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Memmert GmbH + Co.</td><td>84198998</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>795</td><td>Síntesis de partículas magnéticas</td></tr><tr><td>MARCA Cubeta UV micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759200-100EA</td><td>Cubeta para medición de tamaño</td></tr><tr><td>Tapón de MARCA para cubeta UV micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759240-100EA</td><td>Tapones de cubeta para medición de tamaño</td></tr><tr><td>Capilar Plegado Zeta Cell Malvern</td><td></td><td>DTS1070</td><td>Cubeta para la medición del potencial zeta</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>Dispositivo para la medición del tamaño y el potencial zeta</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO NanoQuant instrumento</td><td>Tecan</td><td>396 227 V1.0, 04-2010</td><td>dispositivo para la medición de la concentración de ADN</td></tr><tr><td>SYBR Green Kit RT-PCR Cuantitativo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QR0100</td><td>Kit de PCR</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S instrumento</td><td>Eppendorf</td><td>6325 000.013</td><td>Termociclador</td></tr><tr><td>Kit MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Kit de purificación de ADN</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td>Unión de ADN</td></tr></tbody></table>

partícula magnética de adn vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Aislamiento de ADN utilizando partículas magnéticas es un campo de gran importancia en la investigación de biotecnología y biología molecular. Este protocolo describe la evaluación de las partículas magnéticas de DNA de enlace vía dispersión ligera dinámica (DLS) y dispersión de la luz electroforética (ELS). Análisis por DLS ofrece valiosa información sobre las propiedades fisicoquímicas de las partículas incluyendo tamaño de partícula, polidispersidad y potencial zeta. Este último describe la carga superficial de la partícula que juega papel importante en la Unión electrostática de materiales como el ADN. Aquí, un análisis comparativo explota tres modificaciones químicas de nanopartículas y micropartículas y sus efectos sobre la Unión de ADN y elución. Modificaciones químicas por ramificaron polietilenimina, Tetraetilo ortosilicato y (3-aminopropil) trietoxisilano son investigados. Puesto que el ADN exhibe una carga negativa, se espera que potencial zeta de superficie de la partícula disminuye al atascamiento de la DNA. Formación de clusters debe afectar también a tamaño de partícula. Para investigar la eficacia de estas partículas en el aislamiento y la elución de la DNA, las partículas se mezclan con el ADN en pH bajo (~ 6), la alta fuerza iónica y el ambiente de la deshidratación. Se lavan las partículas de imán y luego ADN es eluido por tampón Tris-HCl (pH = 8). Número de copias de ADN se estima usando la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (PCR). Tamaño de partícula, potencial zeta y datos cuantitativos de PCR, polidispersidad se evaluó y se comparó. DLS es una perspicaz y método de análisis que agrega una nueva perspectiva para el proceso de proyección de partículas de ADN de apoyo.

Utilizando el protocolo descrito aquí para síntesis química y la modificación de las partículas magnéticas, seis partículas magnéticas se sintetiza y se analizaron para el atascamiento de la DNA. Un resumen del análisis se muestra en la tabla 1. Comparando el tamaño de las partículas en el agua y en la solución de Unión, es claro que todas las partículas de agregaron en enlace solución por pliegues 2-22. Algunas partículas más agregan a más pliegues en la presencia de ADN...

Este protocolo describe la síntesis de partículas magnéticas y evaluación de sus propiedades de unión al ADN mediante dispersión de luz dinámica y electroforética. Este método se centra en monitorear los cambios en el tamaño de las partículas, su polidispersidad y potencial zeta de superficie de la partícula que juegan importante papel en el atascamiento de materiales como el ADN.

Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

El objetivo general de este experimento es analizar la unión del ADN y las partículas magnéticas a través de la dispersión dinámica y electroforética de la luz. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biotecnología, como qué tan rápida y fuerte es la unión entre el ácido nucleico y las partículas magnéticas. La principal ventaja de esta técnica es la visualización de cambios físico-químicos en las partículas como el tamaño, la polidispersidad o el potencial zeta. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico molecular debido a la creciente demanda de un aislamiento rápido y sensible del ADN. En este procedimiento, agregue 20 milimoles de cloruro férrico y diez milimoles de cloruro ferroso en 20 mililitros de agua desoxigenada doblemente destilada. A continuación, agite vigorosamente la solución obtenida en un vaso de precipitados bajo una atmósfera de gas nitrógeno utilizando un agitador mecánico hasta obtener una solución transparente. Luego, bajo agitación mecánica rápida, agregue 150 mililitros de un molar de amoníaco acuoso gota a gota usando un embudo de goteo durante una hora. Luego, transfiera la solución a un recipiente a

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Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

En este artículo, un simple, cuantitativo, la afinidad de la fase líquida ensayo de captura se presenta. Es una técnica fiable basado en la interacción entre partículas magnéticas y las proteínas marcadas (por ejemplo nanocuerpos) en una mano y la afinidad entre la proteína marcados y una segunda proteína, con la etiqueta (por ejemplo, virus de la polio) en el otro.

Una afinidad líquido fase de captura de ensayo utilizando partículas magnéticas para estudiar la interacción proteína-proteína: el ejemplo de poliomyelits-Nanobodies

Un escáner para obtener imágenes de partículas magnéticas en muestras planas se ha desarrollado utilizando la técnica de mezcla de detección magnética de frecuencia plana. La respuesta producto de intermodulación magnético de la magnetización nonhysteretic no lineal de las partículas se registra a una excitación de dos frecuencias. Se puede utilizar para tomar imágenes en 2D de muestras biológicas delgadas.

Frecuencia de mezcla escáner de detección magnética para obtener imágenes de partículas magnéticas en muestras planas

Presentamos un plan estratégico y un protocolo para identificar variantes genéticas no codificantes que afectan la unión al ADN del factor de transcripción (TF). Se proporciona un protocolo experimental detallado para el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA) de la unión al ADN TF dependiente del genotipo.

La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

Aquí, presentamos un protocolo para la producción y purificación de proteínas que están marcados con isótopos estables y posterior caracterización de las interacciones de la proteína-proteína usando la espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Los experimentos de Thermophoresis (MST).

Medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Thermophoresis (MST)

Se presenta un protocolo para la aplicación de espectroscopía de RMN de mejora de la relajación paramagnética para detectar interacciones inter e intramoleculares débiles y transitorias en proteínas intrínsecamente desordenadas.

Mejora de la relajación paramagnética para detectar y caracterizar las autoasociaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Aquí, describimos una configuración de pinza magnética de alta velocidad que realiza mediciones nanomecánicas en biomoléculas sensibles a la fuerza a la velocidad máxima de 1.2 kHz. Introducimos su aplicación a horquillas de ADN y complejos SNARE como sistemas modelo, pero también será aplicable a otras moléculas involucradas en eventos mecanobiológicos.

Pinzas magnéticas de alta velocidad para mediciones nanomecánicas en elementos sensibles a la fuerza

Informamos de un ensayo híbrido de conjunto y de una sola molécula para obtener imágenes directas y cuantificar el movimiento de la helicasa Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) totalmente reconstituida y marcada con fluorescencia en moléculas de ADN lineales mantenidas en su lugar en una trampa óptica.

Ensayo híbrido de conjunto y molécula única para obtener imágenes del movimiento de la CMG totalmente reconstituida

Las proteínas anticongelante (AFP) se unen a planos específicos de hielo para prevenir o retardar el crecimiento del hielo. El análisis de afinidad de plano de hielo basado en fluorescencia (FIPA) es una modificación del método original de grabado en hielo para la determinación de planos de hielo unidos a AFP. Las AFP están etiquetadas fluorescentemente, incorporadas en cristales de hielo macroscópicos individuales y visualizadas bajo luz UV.

La Determinación De Los Planos De Unión Al Hielo De Las Proteínas Anticongelante Por La Afinidad De Plano De Hielo Basado En Fluorescencia

La nanoscopía de sonda coloidal se puede utilizar en una variedad de campos para obtener información sobre la estabilidad física y la cinética de coagulación de los sistemas coloidales y ayudar en el descubrimiento de fármacos y las ciencias de formulación utilizando sistemas biológicos. El método descrito en este documento proporciona un medio cuantitativo y cualitativo para estudiar dichos sistemas.

El examen cuantitativo y cualitativo de las interacciones entre partículas Uso coloidal Sonda Nanoscopia

Se describe un protocolo para la generación de luz catalizada de peróxido de hidrógeno - un cofactor para las transformaciones oxidativas.

Impulsada por la luz enzimática descarboxilación

Aprende a analizar la unión de ADN a partículas magnéticas mediante dispersión de luz dinámica y electroforética. Este método permite evaluar cambios en tamaño, polidispersidad y potencial zeta para aplicaciones en biotecnología.

Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética

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