Name: Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Aprende a cuantificar la traducción proteica en Saccharomyces cerevisiae mediante ribosome profiling a nivel del genoma completo. Este método de alta sensibilidad permite estudiar la regulación traduccional in vivo.

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Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de becas en salud AG040191 y AG054566 a VML. Esta investigación se llevó a cabo mientras VML recibió una beca de investigación lejos de la American Federation for Aging Research.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
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<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
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<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

El enfoque de Ribo-Seq ha emergido como una tecnología de gran alcance para el análisis de mRNA traducción en vivo en el nivel 3de todo el genoma. Estudios con este enfoque, que permite el control de traducción con codón solo resolución, ha contribuido a nuestra comprensión de la regulación traduccional. A pesar de sus ventajas, Ribo-Seq tiene varias limitaciones. Fragmentos de ARN ribosómico (ARNr) son siempre Co purificados durante el aislamiento de huellas protegido ribosoma disminuyen...

traducción del mRNA es uno de los procesos fundamentales en la célula, que desempeña un papel importante en la regulación de la expresión de la proteína. Por lo tanto, traducción del mRNA es firmemente controlada en respuesta a diferentes estímulos fisiológicos internos y externos 1,2. Sin embargo, los mecanismos de regulación traduccional siendo estudiados. Aquí, describimos el protocolo para la cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por ribosome profiling. El objetivo general de la técnica de generación de perfiles de ribosoma es estudiar y cuantificar la traducción de mRNAs específicos bajo condiciones celulares diferentes. Esta técnica utiliza la secuenciación de próxima generación para analizar cuantitativamente la ocupación del ribosoma a lo largo del genoma y permite el control de la tasa de proteína síntesis en vivo en el codón solo resolución 3,4. Actualmente, este método proporciona los medios más avanzados de medición de los niveles de la traducción de la proteína y ha demostrado para ser una herramienta de descubrimiento útil proporcionar información que no puede ser revelado por otras técnicas actualmente disponibles, por ejemplo a microarrays o traducción en estado matriz análisis (TSAA) 5. Como perfiles de informes sobre los cambios combinados en los niveles de transcripción y traslación salida del ribosoma, también proporciona mucha mayor sensibilidad en comparación con otros métodos.
Este enfoque se basa en profunda secuenciación de fragmentos de ARNm ribosoma protegido 3. Durante la traducción de proteínas, los ribosomas protegen ~ 28 porciones del nt de los mRNA (llamado huellas) 6. Mediante la determinación de la secuencia de los fragmentos protegidos por el ribosoma, Ribo-Seq puede mapa la posición del ribosoma sobre el ARNm traducidos e identificar qué regiones del mRNA están probables que activamente ser traducido en proteína 3,7. Además, podemos medir cuantitativamente la traducción del mRNA contando el número de huellas que se alinean a una transcripción de mRNA dado.
Para aislar los fragmentos protegidos por el ribosoma, lysates de la célula son inicialmente tratados con un inhibidor de la traducción para atascar los ribosomas seguidos por digestión de la ribonucleasa. Mientras que libres mRNA y porciones de mRNAs traducido no protegidos por los ribosomas son degradadas por la ribonucleasa, los fragmentos de ARNm ribosoma protegidos pueden ser recuperados por purificación complejos ribosoma-huella intacta. Estas huellas de mRNA son entonces convertidas en biblioteca del cDNA y analizaron por secuenciación profunda (figura 1). En paralelo a ribosome profiling, mRNA intacto es extraído de la misma muestra y ordenados. Al comparar el nivel de traducción identificado por Ribo-Seq con mediciones de abundancia del mRNA, podemos identificar los genes que son específicamente para arriba o abajo-regulados a nivel de la traducción y calcular la eficiencia de traducción de mRNA en el nivel de todo el genoma. Mientras que el protocolo descrito en este artículo es específico para la levadura, debe ser también útil para los investigadores que tratan de establecer el protocolo de Ribo-Seq en otros sistemas.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; Filtros de membrana</td><td>M Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL filtros centrífugos (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 a 4 grados; C)</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X Tampón TBE</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% TBE-urea gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-urea</td><td>gel Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X TBE-urea tampón de muestra</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc, pH 5.5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenylasa (10 U/&mu; L)</td><td>Epicentro</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Tampón de carga de muestras de ácido nucleico</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8% TBE gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Ácido-Fenol:Cloroformo, pH 4.5 (con IAA, 125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de cromo-acero, 3,2 mm</td><td>Productos BioSpec</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>Criomolinillo Producto</td><td>Biospec</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de datos</td><td>DATAQ Instruments</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de fraccionamiento en gradiente</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa de alta fidelidad (2.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>Suministrado con 5X Phusion HF</td></tr><tr><td>Buffer Kit de cuantificación de biblioteca de secuenciación de última generación</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de gel de ácido nucleico</td><td>Ultracentrífuga Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARNm Poly(A)</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J exonucleasa (10 U/&mu; L)</td><td>Epicentro</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>transcriptasa inversa (200 U/&mu; L)</td> <td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>suministrado con tampón de primera cadena 5X y tampón de fragmentación de ARN DTT de 0,1 M</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNasa I (100 U/&mu; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la RNasa (20 U/&mu; L)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Tapas de caucho de silicona</td><td>BioSpec Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA ligasa (100 U/&mu; L)</td><td>Epicentro</td><td>CL9021K</td><td>Suministrado con tampón CircLigase II 10X y microviales de acero inoxidable de 50 mM 2</td></tr><tr><td>, 1,8 mL</td><td>Productos BioSpec</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Rotor Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>bomba de jeringa</td><td>New Era Sistemas de bombeo</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleótido quinasa T4 (10.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Suministrado con 10X T4 tampón de polinucleótido</td></tr><tr><td>quinasa T4 ARN ligasa 2 truncado KQ (200.000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>Suministrado con tampón de ARN ligasa T4 10X y 50% PEG8000</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polialómero de pared delgada, 13,2 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Monitor UV</td><td>Bio-Rad</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por ribosome profiling

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Traducción de mRNA en las proteínas es un proceso complejo que involucra varias capas de regulación. A menudo se asume que cambios en la transcripción del mRNA reflejan cambios en la síntesis de proteínas, pero se han observado muchas excepciones. Recientemente, una técnica llamada ribosoma perfiles (o Ribo-Seq) ha surgido como un método eficaz que permite la identificación, con gran precisión, que las regiones de ARNm se traducen en proteínas y cuantificación de la traducción a nivel de todo el genoma. Aquí, presentamos un protocolo generalizado para la cuantificación del genoma de la traducción con Ribo-Seq en levadura de florecimiento. Además, combinando datos de Ribo-Seq con mediciones de abundancia de ARNm permite al mismo tiempo cuantificar la eficiencia de la traducción de miles de transcripciones del mRNA en la misma muestra y comparar cambios en estos parámetros en respuesta a experimental manipulaciones o en los diferentes Estados fisiológicos. Se describe un protocolo detallado para la generación de huellas de ribosoma mediante digestión de nucleasa, aislamiento de complejos ribosoma-huella intacta vía fraccionamiento gradiente de sacarosa y la preparación de las bibliotecas de ADN para secuenciación profunda junto con el apropiado controles de calidad necesarios para asegurar un análisis preciso de la traducción en vivo .

Tuberías detalladas para el análisis Bioinformático de ribosome profiling datos han sido descritos 8,9. Además, varios grupos de investigación han desarrollado herramientas bioinformáticas para el análisis de expresión génica diferencial y tratamiento de los datos de la secuencia, que son específicos para ribosome profiling método 10,11,12 </su...

Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar qué regiones del ARNm se traducen en proteínas, medir cuantitativamente la traducción de proteínas en levaduras en ciernes saccharomyces cerevisiae a nivel de todo el genoma. El perfil de ribosomas se puede utilizar para controlar la tasa de proteínas y enfermedades y para estudiar los mecanismos de regulación de la traducción. La principal ventaja de esta técnica es que añade una sensibilidad mucho mayor en comparación con otros métodos, y de ellos, la medición de proteínas y enfermedades in vivo a la resolución de un solo contacto.Aunque este protocolo es específico para la levadura en ciernes, también es útil para los investigadores que intentan establecer el perfil de los ribosomas en otros sistemas modelo, como las células y los tejidos de mamíferos. Los extractos se prepararán a partir de células de levadura cultivadas hasta la fase logarítmica media. Utilice un conjunto de filtro con soporte de vidrio para filtrar el cultivo a través de filtros de micromembrana de 0,45.Raspe el pellet con la espátula, congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados centígrados. Coloque tres perlas de acero cromado de 3,2 milímetros en un tubo de acero inoxidable de 1,8 mililitros y enfríe previamente el tubo en nitrógeno líquido. Agregue los gránulos congelados y cubra el tubo de acero con una tapa de goma de silicona.Homogeneizar la muestra mediante criomolienda durante 10 segundos a 4200 rpm. Para mantener las muestras congeladas durante todo el procedimiento de molienda, es fundamental enfriar el tubo en nitrógeno líquido durante al menos 10 segundos entre cada molienda. Una vez finalizada la homogeneización, añadir a la muestra un mililitro de tampón de lisis que contenga cicloheximida.Mezcle bien pipeteando y transfiera la muestra a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar a 20.000 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.Transfiera 100 microlitros de lisado a otro tubo nuevo de 1,5 mililitros para el aislamiento de poli(A)mRNA. Congele rápidamente los tubos con las muestras de ARNm en el resto del lisado, que se utilizarán para la extracción de huellas en nitrógeno líquido, y almacene a menos 80 grados centígrados. En la noche anterior a la extracción de la huella, se descongelan gradientes de sacarosa previamente preparados a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, descongele el lisado celular en hielo. Transfiera una alícuota de lisado celular que contenga 50 unidades OD260 a un nuevo tubo de 1,5 mililitros, agregue tampón de lisis fresco hasta un mililitro y 10 microlitros de RNasa uno. Incube a temperatura ambiente con una rotación suave en un rotador de cabeza sobre talones durante una hora.A continuación, coloque suavemente la muestra de lisado sobre un gradiente de sacarosa del 10% al 50% en tubos de polímero. Utilizando un rotor SW41 ti, ultracentrífuga a 35.000 rpm a cuatro grados centígrados durante tres horas. Durante la ultra cetrifugación, configure el sistema de fraccionamiento en gradiente.Encienda los componentes y deje que el monitor UV se caliente durante al menos 30 minutos. Llene la jeringa con solución de persecución y elimine las burbujas de aire dentro de la jeringa y la cánula. Cuando se complete la ultracentrifugación, instale y perfore el tubo de ultracentrífuga que contiene el gradiente de sacarosa.Ponga en marcha la bomba de jeringa a un mililitro por minuto y recoja fracciones de un mililitro mientras controla los valores A254. Se recogen y agrupan las fracciones que representan el pico del monosoma ADS. Filtre las fracciones a través de filtros centrífugos de 0,5 mililitros a 12.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos, deseche el flujo y repita hasta que el volumen sea inferior a 100 microlitros.A 400 microlitros de tampón de liberación mezclado por pipeteo e incubado en hielo durante 10 minutos, transfiera la unidad a un nuevo tubo de recolección y centrifuga a 12.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Recoja el flujo continuo. Posteriormente, purifique los fragmentos de la huella y precipite las muestras utilizando precipitación de etanol como se describe en el protocolo de texto.Para comenzar este procedimiento, centrifugar la huella precipitada y las muestras de ARNm fragmentadas a 20.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después de eliminar el etanol y secar al aire los pellets, suspendemos cada pellet en 7,75 microlitros de agua. A cada gránulo, agregue un microlitro de tampón de polinucleótido quinasa 10XT4, un microlitro de polinucleótido quinasa T4 y 0,25 microlitros de inhibidor de ARNasa.Incubar a 37 grados centígrados durante una hora. Agregue 10 microlitros de tampón de muestra de urea 2X TBE a 10 microlitros de cada huella y muestra de ARNm. Incubar las muestras y los controles apropiados a 75 grados centígrados durante tres minutos, centrifugar y poner en hielo durante un minuto.Cargue cada muestra en dos pocillos de un gel de urea al 15% TBE y separe los fragmentos de ARN mediante electroforesis en gel a 180 voltios durante una hora. Teñir el gel con un tinte de gel de ácido nucleico, protegido de la luz durante cinco minutos. Mientras visualiza el gel bajo un transiluminador de luz azul, elimine la banda adecuada entre 28 y 32 nucleótidos para muestras de huellas y alrededor de 50 a 70 nucleótidos para muestras de ARNm.Congele las piezas de gel de poliacrilamida extirpadas a menos 80 grados centígrados durante al menos 10 minutos antes de extraer el ARN del gel de poliacrilamida. Antes de la transcripción inversa, realice la ligadura de tres adaptadores principales y precipite las muestras como se describe en el protocolo de texto. Vuelva a suspender cada pellet en 11,5 microlitros de agua libre de nucleasas.A continuación, añada 0,5 microlitros de ocho cebadores de transcripción inversa micromolares y un microlitro de mezcla dNTP. Incubar a 65 grados centígrados durante cinco minutos y luego colocar en hielo. A cada muestra, agregue cuatro microlitros de tampón de primera cadena 5x, dos microlitros de DTT 0,1 molar, 0,5 microlitros de inhibidor de RNasa y 0,5 microlitros de transcriptasa inversa.Incube a 48 grados centígrados durante 30 minutos, a 65 grados centígrados durante un minuto y a 80 grados centígrados durante cinco minutos. Proceda inmediatamente a la hidrólisis del ARN añadiendo 0,8 microlitros de hidróxido de sodio dos molares a cada muestra e incubando a 98 grados centígrados durante 30 minutos. Añadir 0,8 microlitros de cloruro de hidrógeno de dos molares para neutralizar la reacción.Después de precipitar las muestras como se describe en el protocolo de texto, vuelva a suspender cada pellet en cinco microlitros de agua libre de nucleasas y agregue cinco microlitros de tampón de muestra de urea TBE 2x. Incubar a 75 grados centígrados durante tres minutos, centrifugar y congelar durante un minuto. Cargue la muestra en un pocillo de un gel de urea al 10% TBE.Separar los productos de la reacción de transcripción inversa por electroforesis en gel a 180 voltios durante 50 minutos. Tiñe el gel con un tinte de gel de ácido nucleico protegido de la luz durante cinco minutos. Usando un transiluminador de luz azul, extirpe la banda alrededor de 128 nucleótidos y más.Congele las piezas de gel de poliacrilamida a menos 80 grados centígrados durante al menos 10 minutos antes de extraer el ADN del gel de poliacrilamida. Para circularizar el ADN, vuelva a suspender cada gránulo de ADN en 16,75 microlitros de agua libre de nucleasas. Agregue dos microlitros de tampón de ADN ligasa monocatenario 10x, un microlitro de cloruro de manganeso de 50 milimolares y 0,25 microlitros de ADN ligasa monocatenario.Incubar a 60 grados centígrados durante una hora, seguido de 80 grados centígrados durante 10 minutos. Sin precipitar, almacene el producto de la reacción de ligadura de ADN monocatenario a menos 20 grados centígrados. Posteriormente, realice la amplificación de la biblioteca de PCR seguida de la cuantificación de la biblioteca y la secuenciación de alto rendimiento como se describe en el protocolo de texto.Se muestran los perfiles representativos de los bioanalizadores de la biblioteca de huellas amplificadas por PCR y la biblioteca de secuenciación obtenida para las muestras de ARNm. El tamaño promedio esperado de la biblioteca de huellas es de 148 a 152 nucleótidos, y el tamaño esperado de la biblioteca de ARNm es de 170 a 190 nucleótidos. Este gráfico muestra el número combinado de lecturas de ARNm, huella y ARNr obtenidas para dos réplicas biológicas independientes de una muestra de tipo salvaje y el mutante de deleción hbs1.Entre el 50% y el 60% de todas las lecturas secuenciadas en las bibliotecas de huellas correspondían a fragmentos de huellas protegidos por ribosomas. Por el contrario, solo se observó el 3% de los fragmentos de ARNr en las bibliotecas de ARNm, lo que demuestra que el aislamiento de poli(A)ARNm permite la eliminación efectiva de las lecturas de ARNr. Tanto las bibliotecas de muestras de huella como las de ARNm muestran una buena reproducibilidad, como lo indica un coeficiente de correlación de Pearson de aproximadamente 0,99 entre muestras emparejadas.Cuando se combina con las mediciones de abundancia de ARNm, el perfil de ribosomas permite medir los cambios en la eficiencia de traducción entre condiciones experimentales. Los genes significativamente regulados al alza y a la baja en el mutante de deleción hbs1 se agrupan de acuerdo con si se ven afectados por un cambio en la transcripción del ARNm, la eficiencia de la traducción o por un efecto común. Una vez dominado, todo el protocolo se puede realizar en aproximadamente 11 días.Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar guantes y realizar todos los pasos utilizando reactivos y consumibles libres de ARNasa para evitar la contaminación por ARNasa y reducir el riesgo de degradación del ARN en las muestras. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo generar huellas de ribosoma mediante la digestión de nucleasas, aislar complejos de huellas de ribosoma intactos mediante fraccionamiento en gradiente de sacarosa y preparar bibliotecas de ADN para la secuenciación profunda. No olvide que trabajar con nitrógeno líquido puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas de seguridad y guantes criogénicos al manipular materiales extremadamente fríos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

La capacidad de las células para adaptarse al estrés es crucial para su supervivencia. La regulación de la traducción del ARNm es una de esas estrategias de adaptación, que proporciona una regulación rápida del proteoma. Aquí, proporcionamos un protocolo estandarizado de perfiles de polisomas para identificar ARNm específicos que se traducen selectivamente en condiciones de estrés.

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

Este manuscrito describe un método para visualizar y cuantificar eventos traducción localizada en compartimientos subcelulares. El enfoque propuesto en este manuscrito requiere un sistema de proyección de imagen confocal básico y reactivos y es rápida y rentable.

La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción

El protocolo aquí descrito se basa en la cuantificación del genoma de mRNA recién sintetizada purificada de células de levadura con 4-tiouracilo. Este método permite para medir la síntesis de mRNA desacoplado del decaimiento del mRNA y por lo tanto, proporciona una medida exacta de la transcripción del RNA polimerasa II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Aquí se describen las etapas de la recolección de muestras y la preparación de RIBO-seq en bacterias. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con estas directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es simple, utiliza equipos de laboratorio estándar y tarda siete días desde la lisis hasta la obtención de bibliotecas.

RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

La traducción de ribosomas decodifica tres nucleótidos por codón en péptidos. Su movimiento a lo largo del ARNm, capturado por el perfil de ribosomas, produce las huellas que exhiben una periodicidad de triplete característica. Este protocolo describe cómo usar RiboCode para descifrar esta característica prominente a partir de los datos de perfiles de ribosomas para identificar marcos de lectura abiertos traducidos activamente a nivel de transcriptoma completo.

De novo Identificación de marcos de lectura abiertos traducidos activamente con datos de perfil de ribosomas

Aprende a cuantificar la traducción proteica en Saccharomyces cerevisiae mediante ribosome profiling a nivel del genoma completo. Este método de alta sensibilidad permite estudiar la regulación traduccional in vivo.

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

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