Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

El objetivo general de este procedimiento es identificar qué regiones del ARNm se traducen en proteínas, medir cuantitativamente la traducción de proteínas en levaduras en ciernes saccharomyces cerevisiae a nivel de todo el genoma. El perfil de ribosomas se puede utilizar para controlar la tasa de proteínas y enfermedades y para estudiar los mecanismos de regulación de la traducción. La principal ventaja de esta técnica es que añade una sensibilidad mucho mayor en comparación con otros métodos, y de ellos, la medición de proteínas y enfermedades in vivo a la resolución de un solo contacto.

Aunque este protocolo es específico para la levadura en ciernes, también es útil para los investigadores que intentan establecer el perfil de los ribosomas en otros sistemas modelo, como las células y los tejidos de mamíferos. Los extractos se prepararán a partir de células de levadura cultivadas hasta la fase logarítmica media. Utilice un conjunto de filtro con soporte de vidrio para filtrar el cultivo a través de filtros de micromembrana de 0,45.

Raspe el pellet con la espátula, congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados centígrados. Coloque tres perlas de acero cromado de 3,2 milímetros en un tubo de acero inoxidable de 1,8 mililitros y enfríe previamente el tubo en nitrógeno líquido. Agregue los gránulos congelados y cubra el tubo de acero con una tapa de goma de silicona.

Homogeneizar la muestra mediante criomolienda durante 10 segundos a 4200 rpm. Para mantener las muestras congeladas durante todo el procedimiento de molienda, es fundamental enfriar el tubo en nitrógeno líquido durante al menos 10 segundos entre cada molienda. Una vez finalizada la homogeneización, añadir a la muestra un mililitro de tampón de lisis que contenga cicloheximida.

Mezcle bien pipeteando y transfiera la muestra a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar a 20.000 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.

Transfiera 100 microlitros de lisado a otro tubo nuevo de 1,5 mililitros para el aislamiento de poli(A)mRNA. Congele rápidamente los tubos con las muestras de ARNm en el resto del lisado, que se utilizarán para la extracción de huellas en nitrógeno líquido, y almacene a menos 80 grados centígrados. En la noche anterior a la extracción de la huella, se descongelan gradientes de sacarosa previamente preparados a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, descongele el lisado celular en hielo. Transfiera una alícuota de lisado celular que contenga 50 unidades OD260 a un nuevo tubo de 1,5 mililitros, agregue tampón de lisis fresco hasta un mililitro y 10 microlitros de RNasa uno. Incube a temperatura ambiente con una rotación suave en un rotador de cabeza sobre talones durante una hora.

A continuación, coloque suavemente la muestra de lisado sobre un gradiente de sacarosa del 10% al 50% en tubos de polímero. Utilizando un rotor SW41 ti, ultracentrífuga a 35.000 rpm a cuatro grados centígrados durante tres horas. Durante la ultra cetrifugación, configure el sistema de fraccionamiento en gradiente.

Encienda los componentes y deje que el monitor UV se caliente durante al menos 30 minutos. Llene la jeringa con solución de persecución y elimine las burbujas de aire dentro de la jeringa y la cánula. Cuando se complete la ultracentrifugación, instale y perfore el tubo de ultracentrífuga que contiene el gradiente de sacarosa.

Ponga en marcha la bomba de jeringa a un mililitro por minuto y recoja fracciones de un mililitro mientras controla los valores A254. Se recogen y agrupan las fracciones que representan el pico del monosoma ADS. Filtre las fracciones a través de filtros centrífugos de 0,5 mililitros a 12.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos, deseche el flujo y repita hasta que el volumen sea inferior a 100 microlitros.

A 400 microlitros de tampón de liberación mezclado por pipeteo e incubado en hielo durante 10 minutos, transfiera la unidad a un nuevo tubo de recolección y centrifuga a 12.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Recoja el flujo continuo. Posteriormente, purifique los fragmentos de la huella y precipite las muestras utilizando precipitación de etanol como se describe en el protocolo de texto.

Para comenzar este procedimiento, centrifugar la huella precipitada y las muestras de ARNm fragmentadas a 20.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después de eliminar el etanol y secar al aire los pellets, suspendemos cada pellet en 7,75 microlitros de agua. A cada gránulo, agregue un microlitro de tampón de polinucleótido quinasa 10XT4, un microlitro de polinucleótido quinasa T4 y 0,25 microlitros de inhibidor de ARNasa.

Incubar a 37 grados centígrados durante una hora. Agregue 10 microlitros de tampón de muestra de urea 2X TBE a 10 microlitros de cada huella y muestra de ARNm. Incubar las muestras y los controles apropiados a 75 grados centígrados durante tres minutos, centrifugar y poner en hielo durante un minuto.

Cargue cada muestra en dos pocillos de un gel de urea al 15% TBE y separe los fragmentos de ARN mediante electroforesis en gel a 180 voltios durante una hora. Teñir el gel con un tinte de gel de ácido nucleico, protegido de la luz durante cinco minutos. Mientras visualiza el gel bajo un transiluminador de luz azul, elimine la banda adecuada entre 28 y 32 nucleótidos para muestras de huellas y alrededor de 50 a 70 nucleótidos para muestras de ARNm.

Congele las piezas de gel de poliacrilamida extirpadas a menos 80 grados centígrados durante al menos 10 minutos antes de extraer el ARN del gel de poliacrilamida. Antes de la transcripción inversa, realice la ligadura de tres adaptadores principales y precipite las muestras como se describe en el protocolo de texto. Vuelva a suspender cada pellet en 11,5 microlitros de agua libre de nucleasas.

A continuación, añada 0,5 microlitros de ocho cebadores de transcripción inversa micromolares y un microlitro de mezcla dNTP. Incubar a 65 grados centígrados durante cinco minutos y luego colocar en hielo. A cada muestra, agregue cuatro microlitros de tampón de primera cadena 5x, dos microlitros de DTT 0,1 molar, 0,5 microlitros de inhibidor de RNasa y 0,5 microlitros de transcriptasa inversa.

Incube a 48 grados centígrados durante 30 minutos, a 65 grados centígrados durante un minuto y a 80 grados centígrados durante cinco minutos. Proceda inmediatamente a la hidrólisis del ARN añadiendo 0,8 microlitros de hidróxido de sodio dos molares a cada muestra e incubando a 98 grados centígrados durante 30 minutos. Añadir 0,8 microlitros de cloruro de hidrógeno de dos molares para neutralizar la reacción.

Después de precipitar las muestras como se describe en el protocolo de texto, vuelva a suspender cada pellet en cinco microlitros de agua libre de nucleasas y agregue cinco microlitros de tampón de muestra de urea TBE 2x. Incubar a 75 grados centígrados durante tres minutos, centrifugar y congelar durante un minuto. Cargue la muestra en un pocillo de un gel de urea al 10% TBE.

Separar los productos de la reacción de transcripción inversa por electroforesis en gel a 180 voltios durante 50 minutos. Tiñe el gel con un tinte de gel de ácido nucleico protegido de la luz durante cinco minutos. Usando un transiluminador de luz azul, extirpe la banda alrededor de 128 nucleótidos y más.

Congele las piezas de gel de poliacrilamida a menos 80 grados centígrados durante al menos 10 minutos antes de extraer el ADN del gel de poliacrilamida. Para circularizar el ADN, vuelva a suspender cada gránulo de ADN en 16,75 microlitros de agua libre de nucleasas. Agregue dos microlitros de tampón de ADN ligasa monocatenario 10x, un microlitro de cloruro de manganeso de 50 milimolares y 0,25 microlitros de ADN ligasa monocatenario.

Incubar a 60 grados centígrados durante una hora, seguido de 80 grados centígrados durante 10 minutos. Sin precipitar, almacene el producto de la reacción de ligadura de ADN monocatenario a menos 20 grados centígrados. Posteriormente, realice la amplificación de la biblioteca de PCR seguida de la cuantificación de la biblioteca y la secuenciación de alto rendimiento como se describe en el protocolo de texto.

Se muestran los perfiles representativos de los bioanalizadores de la biblioteca de huellas amplificadas por PCR y la biblioteca de secuenciación obtenida para las muestras de ARNm. El tamaño promedio esperado de la biblioteca de huellas es de 148 a 152 nucleótidos, y el tamaño esperado de la biblioteca de ARNm es de 170 a 190 nucleótidos. Este gráfico muestra el número combinado de lecturas de ARNm, huella y ARNr obtenidas para dos réplicas biológicas independientes de una muestra de tipo salvaje y el mutante de deleción hbs1.

el 50% y el 60% de todas las lecturas secuenciadas en las bibliotecas de huellas correspondían a fragmentos de huellas protegidos por ribosomas. Por el contrario, solo se observó el 3% de los fragmentos de ARNr en las bibliotecas de ARNm, lo que demuestra que el aislamiento de poli(A)ARNm permite la eliminación efectiva de las lecturas de ARNr. Tanto las bibliotecas de muestras de huella como las de ARNm muestran una buena reproducibilidad, como lo indica un coeficiente de correlación de Pearson de aproximadamente 0,99 entre muestras emparejadas.

Cuando se combina con las mediciones de abundancia de ARNm, el perfil de ribosomas permite medir los cambios en la eficiencia de traducción entre condiciones experimentales. Los genes significativamente regulados al alza y a la baja en el mutante de deleción hbs1 se agrupan de acuerdo con si se ven afectados por un cambio en la transcripción del ARNm, la eficiencia de la traducción o por un efecto común. Una vez dominado, todo el protocolo se puede realizar en aproximadamente 11 días.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar guantes y realizar todos los pasos utilizando reactivos y consumibles libres de ARNasa para evitar la contaminación por ARNasa y reducir el riesgo de degradación del ARN en las muestras. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo generar huellas de ribosoma mediante la digestión de nucleasas, aislar complejos de huellas de ribosoma intactos mediante fraccionamiento en gradiente de sacarosa y preparar bibliotecas de ADN para la secuenciación profunda. No olvide que trabajar con nitrógeno líquido puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas de seguridad y guantes criogénicos al manipular materiales extremadamente fríos.