Evaluación del esperma de pescado utilizando Software y equipos de refrigeración

El objetivo principal de este procedimiento es analizar la calidad del esperma de los peces en función de la motilidad de los espermatozoides con el fin de contribuir al éxito de la fertilización artificial. Soy el Dr. Carles Soler, catedrático de la Universitat de València y director científico de PROiSER I+D. Soy Carina Caldeira, becaria de Impress Project.

La tecnología CASA se desarrolló hace algunas décadas para el análisis de semen de especies de mamíferos mediante el uso de un análisis de semen asistido por computadora. En el caso de los peces, hay que tener en cuenta dos cosas. El primero de ellos, es el hecho de que estos animales normalmente están fecundando a bajas temperaturas, en torno a los cuatro grados, y por este motivo, no es posible analizar el semen a temperatura domiciliaria, pero es necesario desarrollar herramientas específicas para refrigerar las muestras.

El otro problema, es que la motilidad disminuye muy rápido después de la activación, y es necesario analizar este hecho, para definir cuál es un buen momento para el análisis de la calidad, o de la calidad del semen. Por lo tanto, vamos a mostrar el análisis de esperma de pez, y este protocolo será una modificación del protocolo de mamíferos, e incluirá el análisis de motilidad usando Entonces, comencemos. Los peces se anestesian para inyectar hormonas y se recogen muestras de esperma 24 horas después.

Se limpia la zona genital para evitar la contaminación. Los espermatozoides se recogen aplicando una presión suave. Las muestras de esperma se mantienen a cuatro grados, hasta que se realizan análisis de motilidad.

El diluyente y el activador se preparan de antemano. Ajuste el bloque enfriador a cuatro grados para mantener las muestras a una temperatura constante. Espera hasta que se estabilice.

Diluir las muestras de semen utilizando el diluyente específico para cada especie. En el caso de la anguila europea, el esperma se diluye en el medio P1, con una proporción de 1:50. Prepare 500 microlitros de esperma diluido, agregando 450 microlitros de P1 y 50 microlitros de muestra de esperma fresco.

Mezclar bien. Tome un cuarto de solución activadora y colóquelo en el bloque enfriador. Ajuste la etapa de enfriamiento a cuatro grados.

Espera hasta que se estabilice. Seleccione el módulo de motilidad y, si es necesario, utilice un nombre y una contraseña. Elija propiedades.

Haga clic en especies y seleccione peces. Seleccione los fotogramas por segundo y el número de imágenes que desea utilizar. Es obligatorio el uso de contraste negativo.

Seleccione la cámara de conteo y la báscula correspondientes. Para cada especie, adapte el área de partículas y la conectividad. En el caso de la anguila europea, el área mínima de partículas debe ser de dos y la conectividad de siete.

Guarde la configuración. Captura abierta. Tome cuatro microlitros de solución activadora y colóquelos en la cámara.

Homogeneizar bien los espermatozoides diluidos. Tomar 5 microlitros de espermatozoide y mezclar con el activador. Coloque la tapa.

Enfoque la muestra y encuentre la mejor área visual. Seleccione capturar video para obtener huellas de espermatazos, que se separan según la velocidad. Se pueden capturar más campos.

Seleccione capturar y proceda como antes. Haga clic en salir para obtener una vista general de todos los campos. Las capturas de espermatozoides se tomaron en intervalos de tiempo específicos después de la activación.

Sin embargo, se realizó análisis de espermatozoides para cada intervalo de tiempo replicado. El informe parcial para cada intervalo de tiempo se puede obtener seleccionando campos y haciendo clic en parcial. La hoja de Excel proporciona valores medios de datos parciales, gráficos e imágenes de las huellas de espermatozoides.

Repita el mismo procedimiento para otros campos. La otra opción son los datos generales. Estos datos proporcionan valores cinéticos para los espermatozoides individuales de todos los campos.

Con el informe parcial, el porcentaje de motilidad y progresividad para los diferentes tiempos se puede comparar inmediatamente, utilizando gráficos circulares. Los datos generales dan la opción de obtener varios análisis estadísticos utilizando los parámetros cinéticos. Las huellas de los espermatozoides dan tres parámetros.

VCL, velocidad curvilineral, VSL, velocidad progresiva y VAP, velocidad de trayectoria. VCL es el parámetro más importante y cambia con el número de fotogramas por segundo. Al aumentar el número de fotogramas, también aumenta la VCL, lo que permite un análisis de pista casi perfecto.

La mejor velocidad de fotogramas puede variar según la especie. El objetivo es encontrar el valor más alto de VCL, después de lo cual se pueden observar las posibles diferencias con otras herramientas, como las cámaras de recuento. En la actualidad, el análisis de subpoblaciones es un importante análisis estadístico que proporciona más información sobre la muestra de espermatozoides.

Este es un ejemplo de muestras de esperma de salmón del Atlántico. Se pueden observar diferentes subpoblaciones de espermatozoides en diferentes generaciones producidas en cautiverio. Hemos mostrado cómo utilizar un sistema informático para el análisis de esperma de pez, y también cómo optimizar aspectos técnicos y metodológicos como la cámara de conteo, la temperatura y la velocidad de fotogramas.

Entonces, con estos datos, podemos hacer muchos análisis en diferentes campos, como la cría de peces, no solo para la acuicultura, sino también para programas de conservación, estudios filogenéticos o para aumentar el conocimiento sobre la población de espermatozoides. Así que espero que este protocolo te ayude en tus estudios.