Name: Una novela In Vitro de la herida curativa ensayo para evaluar la migración de la célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende un ensayo in vitro novedoso para evaluar la migración celular en células epiteliales bronquiales usando péptidos antimicrobianos. Este método ofrece datos cuantitativos rápidos y reproducibles sobre la cicatrización de heridas.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad la Sapienza de Roma y la Fundación italiana de investigación de Fibrosis Quística (proyecto FFC #11/2014 aprobada por delegaciones de FFC de Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny y Pavía). Parte de este trabajo fue apoyado también por FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Agradecemos al Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italia) para proporcionar a las células epiteliales bronquiales.

1. preparación de la célula
<ol><li>Semilla de 2.5x106 células en 10 mL del mínimo esencial Medium (MEM) suplementado con glutamina 2 mM (MEMg), más 10% de suero bovino fetal (FBS), antibióticos (0,1 mg/mL de penicilina y estreptomicina) y puromicina (0,5 μg/mL para la selección y mantenimiento de la línea de la célula) en un matraz T75. Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO2 durante 2 días. Antes de comenzar el experimento, comprobar la confluencia de las células bajo un microscopio invertido. Nota: Las células utilizadas para el experimento son las células epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas transduced con un vector lentivirales que confiere resistencia a puromicina. Estable expresan CFTR funcional14,15.</li>
	<li>Una vez alcanzada la confluencia de las células 90-100%, Aspire el medio del frasco y deséchela en una botella de residuos bajo una clase gabinete de seguridad biológica II. Lavar las células con 6 mL de tampón fosfato salino sin calcio y magnesio (CMF-PBS). Suavemente el matraz de la roca manualmente y deseche CMF-PBS. Nota: Tenga cuidado de no tocar la monocapa de células con la pipeta.</li>
	<li>Añadir 10 mL de PBS de CMF e Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO2 durante 10 minutos.</li>
	<li>Aspire CMF-PBS y deséchela. Luego agregar 2 mL de tripsina/EDTA al matraz.</li>
	<li>Muévalo suavemente el matraz, permitiendo que la solución completamente las células de la capa, y se Incube el frasco a 37 ° C y 5% de CO2 durante 10 minutos hasta que las células son separadas visiblemente bajo el microscopio. Nota: Al final de la incubación, las células deben aparecen redondeados y no adheridos a la superficie de plástico. Si las células no están bien separadas, agitación manual puede ser necesario.</li>
	<li>Añadir 10 mL de MEMg plus 10% FBS para inactivar tripsina y recoger las células por el fondo del matraz de lavado. Transferir el volumen a un tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 80 x g.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 6 mL de MEMg plus 10% FBS. Pipeta varias veces para dispersar cualquier grumos.</li>
	<li>Extraiga 10 μl de suspensión celular con una micropipeta e inyectar el volumen bajo la cubierta de vidrio puesto anteriormente sobre una cámara de Bürker, Neubauer.</li>
	<li>Contar el número de celular.</li>
</ol>2. siembra en el cultivo de célula inserta
<ol><li>En cada pocillo de una placa de 12 pozos, transferencia de la inserción de la cultura con una pinza estéril (figura 1). Use pinzas para presionar a lo largo de los bordes de insertos para fijar a la superficie de la placa. Nota: Los insertos tienen un superficie inferior pegajoso que permite la adherencia.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg"> Figura 1 : Representación esquemática de los insertos de silicona cultura, bien poner en pocillos de una placa de la pozo 12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2"><li>Diluir correctamente la suspensión celular en MEMg plus 10% FBS. Llene cada compartimento del parte movible con 70 μl de suspensión celular (aproximadamente 3.5x104 células/cámara). Nota: La densidad de células en cada compartimiento depende del tipo de células. Se recomienda utilizar una densidad celular que conduce a completar la confluencia dentro de 24 h.</li>
	<li>Bajo el microscopio, comprobar que las células no son fugas de los compartimentos de insertar e incuban la placa de la pozo de 12 por 24 h a 37 ° C y 5% CO2.</li>
</ol>3. pseudo-herida curativo ensayo
<ol><li>Después de la incubación visualizar las células bajo el microscopio invertido para verificar que se han formado las monocapas confluentes de células.</li>
	<li>Vuelva a suspender los compuestos de prueba (e.g., amperios) en 1 mL de MEMg. Nota: Preparar frescas diluciones de AMPs a partir de la solución stock almacenada a-20 ° C.</li>
	<li>Suavemente Quite los insertos pinzas estériles. Tenga cuidado de no romper las monocapas de células. La transferencia de los rellenos sobre papel absorbente. Nota: Para volver a usar los insertos de la misma, esterilizarlas en etanol al 70% durante al menos 3 horas. Se recomienda desecharlos luego.</li>
	<li>Para eliminar las células no adherentes, añadir 1 mL de MEMg por bien utilizando una micropipeta. Cerrar la placa y suavemente la roca. Nota: No agregue medio directamente sobre monocapas de células para evitar su interrupción.</li>
	<li>Aspire el medio y sustituirlo con 1 mL de MEMg por pozo. Cerrar la placa y visualizar los espacios acelulares (creados por los insertos) bajo el microscopio invertido con 4 aumentos, equipada con una cámara de vídeo. Adquisición de imágenes en el tiempo cero (T0) y guardarlas en formato jpg.</li>
	<li>Retire el medio de los pozos de lavado con 1 mL de PBS y deséchela.</li>
	<li>Agregue los compuestos de prueba (preparados en el punto 3.2) a los pocillos. Para las muestras control sin tratar, añadir 1 mL de MEMg. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>Después de 15, 20 y 24 h tratamiento, observar la migración de la célula al microscopio con aumentos de 4 y adquirir imágenes. Nota: Durante este paso, trata de plasmar imágenes en las mismas áreas en cuanto a T0. La elección de los intervalos de tiempo en el cual se capturan imágenes depende de la velocidad de migración celular.</li>
	<li>Para estudiar el efecto de algunos inhibidores selectivos, es decir, AG1478, en la migración celular, aspirar el medio de cada compartimiento de inserción antes de quitar partes movibles.<ol>
<li>Lavado de cada compartimento con MEMg fresco y llenar con 70 μl de MEMg suplementado con AG1478.</li>
		<li>Después de 30 min de incubación a 37 ° C y 5% CO2, proceda como se describe desde el punto 3.3. Nota: Durante el paso de lavado y tratamiento previo de monocapas de células con los inhibidores específicos, tenga cuidado de no quitar los insertos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de la imagen
<ol><li>Al finalizar el experimento, seleccionar imágenes de las muestras más representativas de los diferentes grupos experimentales y crear un archivo zip que contiene imágenes en h T0, T15, T20 y T24. Nota: Imágenes estan tomadas a intervalos de tiempo seleccionados para todas las muestras. Ejecute triplicados para cada experimento, que se repite al menos tres veces. Al final, para grupos todo experimentales, un mínimo de 3 imágenes ("a", "b", "c", etc., derivadas de cada experimento independiente) en cada momento son analizados.</li>
	<li>Subir el archivo zip en el software de análisis de imagen que proporciona automáticamente por correo electrónico un archivo Resumen de hoja de cálculo que contiene los datos experimentales de áreas cubiertas de la célula y del rasguño (en porcentaje) en los puntos de tiempo seleccionado. Nota: El reconocimiento de la vanguardia y el gap se basa en el método de detección de borde (dirigido a identificar los puntos en que el brillo de la imagen cambia abruptamente).</li>
	<li>Guardar los datos y recogerlos. Normalizar todos los datos con respecto al valor promedio en el tiempo cero. Calcular el valor promedio de los datos normalizados de todas las repeticiones en cada punto del tiempo y el error estándar relativo (SEM). Mediante el uso de dos vías de análisis de varianza (ANOVA), realizar análisis estadísticos con un software estadístico apropiado. Diferencias entre los grupos tratados con péptido y grupos de control en diferentes intervalos de tiempo son consideradas estadísticamente significativa para un p&lt; 0.05.</li>
	<li>Representar los datos obtenidos en un gráfico como un histograma, que muestra el porcentaje de área cubierta de la célula de todos muestra grupos versus los intervalos de tiempo seleccionados.</li>
</ol>

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<li>Bebok, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+cAMP+agonists+to+activate+rescued+deltaF508+CFTR+in+CFBE41o-+airway+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers.</a> J Physiol. 569, 601-615 (2005).</li>
<li>Trinh, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+defective+cystic+fibrosis+airway+epithelial+wound+repair+after+CFTR+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue.</a> Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).</li>
<li>Gan, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+tyrosine+kinase+inhibitor+AG1478+increases+the+formation+of+inactive+untethered+EGFR+dimers.+Implications+for+combination+therapy+with+monoclonal+antibody+806%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li>
<li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li>
<li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li>
<li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Migración celular es un proceso esencial en muchos eventos fisiológicos y patológicos, incluyendo la cicatrización de heridas, desarrollo embrionario y metástasis del cáncer. El procedimiento básico para el estudio de la migración de la célula en vitro implica: (i) la creación de una monocapa de células, (ii) la producción de una pseudo-herida en la capa confluente de células, (iii) la captura de imágenes en diferentes intervalos de tiempo hasta que la herida cierre se alcanza y (iv) el análisis de la secuencia ...

En gran parte es conocido que la cicatrización de heridas en los animales es un proceso fundamental para restablecer la integridad y la función normal de las capas de tejido después de la lesión1. A pesar de superficies epiteliales expuestas al medio externo (por ejemplo, la piel, vías respiratoria y tracto gastrointestinal) forman una barrera protectora de insultos físicos y químicos, la formación de heridas puede ocurrir fácilmente, especialmente después cirugía o infecciones microbianas2. Por ejemplo, la colonización del tejido pulmonar por el bacteriano patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa, sobre todo en enfermos de fibrosis quística (FQ), lleva a daño del epitelio de las vías aéreas con la consecuente insuficiencia respiratoria3, 4. La cicatrización es un mecanismo de reparación de host complejo para restaurar la arquitectura normal de un tejido lesionado5. Se caracteriza por la inflamación inicial, seguida de un período de regeneración abarca epithelialization, angiogénesis y remodelación tisular con la producción de colágeno y de la célula diferenciación6,7,8 . Para asegurar la integridad epitelial y para controlar la proliferación microbiana, todos los organismos vivos producen moléculas de defensa, incluyendo péptidos antimicrobianos (AMPs)9,10. El proceso de cicatrización es muy difícil simular en vitro debido a la falta de restos celulares y las interacciones complejas entre diferentes tipos de células. Sin embargo, la capacidad en vitro de un péptido para acelerar el cierre de una herida pseudo estimulando la migración de células epiteliales es indicativa de su capacidad para sanar un epitelio comprometido. De hecho, migración celular es un evento de limitación de velocidad en la cicatrización de heridas, y estudiar los factores que pueden afectar la migración celular ayudará a terapias objetivo para mejorar la cicatrización.
Aquí, un ensayo experimental altamente reproducible se proporciona basado en silicona especial cultura insertos para evaluar la migración de células in vitro. Se basa en la creación de un espacio μm 500 (pseudo-herida) sobre una monocapa celular confluente. Las células en el borde del campo artificial "herido" comenzará a migrar a la zona libre de células, formando nuevos contactos célula-célula. La inserción de la cultura representa una nueva herramienta para experimentos de cicatrización rápida. Se proporcionan dos depósitos separados por una pared μm 500, y pueden ser colocados correctamente en una placa de 3 cm plato o en el pozo de una placa de 12 pozos. Llena cada compartimiento del parte movible con una suspensión permite a las células crecer en cada área designada hasta confluencia, mientras que la extracción del inserto generará un espacio libre de células de aproximadamente 500 μm (el mismo ancho que el muro de separación). Un medio de cultivo celular adecuada complementado con un compuesto de prueba puede añadirse al plato placa/bien. Luego, el cierre de la brecha puede ser visualizado en diferentes intervalos de tiempo bajo un microscopio invertido, preferiblemente uno equipado con una cámara de vídeo para la adquisición de la imagen. Por último, medición de los cambios en el área de célula cubierta por el programa de análisis de imagen automatizado basado en web permite la cuantificación de la velocidad de la herida cierre y migración celular. En general, este método es un paso adelante en relación con el análisis clásico, donde un cero se hizo manualmente mediante la incisión de monocapas confluentes de células con una aguja estéril o pipeta tip11. De hecho, el último procedimiento puede destruir el plástico inferior del plato placa/pozo y el revestimiento de la superficie, creando arrugas. Además, el área de "herido" no tiene un ancho bien definido a lo largo de toda la longitud de la brecha, como esto depende altamente de la presión aplicada por los investigadores a la punta de aguja. Además, las células desalojadas pueden formar cúmulos de células vivas y muertas en los bordes del scratch; por otra parte, la propagación de las células vivas en el área de "herido" puede interferir con la velocidad de migración de la célula, generando resultados no reproducibles12.
Además, gracias a una plataforma de análisis de imagen cero, los usuarios pueden rápidamente recibir (en minutos) datos cuantitativos sobre el comportamiento migratorio de las celdas seleccionadas sin necesidad de adquirir software adicional. Esta plataforma es capaz de analizar imágenes de microscopía de contraste de fase de baja (~ 5 X), mediana (~ 10 X) y aumento alto (~ 20 X). Después de subir un archivo zip de imágenes (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, formato *.tiff) automáticamente se realizaron el análisis para generar un archivo de resumen que muestra el porcentaje de zonas cubiertas de células y zonas cero, así como la velocidad de la célula migración, a intervalos de tiempo distintos.
En este trabajo, mediante el uso de un amplificador-derivado de la piel de rana, es decir, Esc(1-21) y su diastereomer Esc(1-21) - 1 c13y una línea de células bronquiales expresando el funcional CF conductancia transmembrana (CFTR) del regulador14,15, se proporciona un ejemplo de la migración celular inducida por el péptido en comparación con las muestras sin tratamiento (control). Tenga en cuenta que el epitelio de las vías respiratorias y el CFTR desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la función pulmonar y16de la reparación de la herida. Además, mediante inhibidores selectivos (por ejemplo, AG1478)17 de receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE), evidencia que la migración de las células bronquiales inducida por los péptidos mencionados implica activación de EGFR12, 18 se divulga.
En Resumen, el objetivo de este procedimiento es mostrar cómo el uso de estos rellenos de silicona cultura representa un ensayo rápido y de fácil acceso para determinar con precisión la migración de células adherentes (p. ej., células epiteliales bronquiales) y molecular mecanismos que controlan este tipo de eventos.

<table><tbody><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM)&nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB2071L</td><td>Warm en 37 &deg; C baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino Inactivado por Calor (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180DH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>Euroclon</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA 1X en PBS</td><td>Euroclon</td><td>ECB3052D</td><td>Calentar a temperatura ambiente antes</td></tr><tr><td>de usar DPBS sin calcio y magnesio (CMF-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DPBS con calcio y magnesio (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Culture-Inserto 2 pocillos</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>Wimasis Análisis de Imagen</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>30002</td><td></td></tr><tr><td>Software PRISM&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>versión 6.0</td><td></td></tr></tbody></table>

una novela in vitro de la herida curativa ensayo para evaluar la migración de la célula

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

El objetivo de este trabajo es mostrar un nuevo método para evaluar la capacidad de algunas moléculas inmunomoduladoras, como péptidos antimicrobianos (AMPs), para estimular la migración celular. Lo importante, migración celular es un evento de limitación de velocidad durante el proceso de cicatrización para restablecer la integridad y la función normal de las capas de tejido después de la lesión. La ventaja de este método sobre el análisis clásico, que se basa en un rasguño hecho manualmente en una monocapa de células, es que el uso de la cultura de silicona especial inserta proporcionando dos compartimientos para crear un campo de pseudo-herido libre con un ancho bien definido (500 μm ). Además, debido a una plataforma de análisis de imagen automatizado, es posible obtener rápidamente datos cuantitativos sobre la velocidad de la herida cierre y migración celular. Más precisamente, se mostrará el efecto de dos amplificadores de piel de rana en la migración de células epiteliales bronquiales. Además, el tratamiento previo de estas células con inhibidores específicos proporcionará información sobre los mecanismos moleculares subyacentes a este tipo de eventos.

Este protocolo se utilizó para determinar el efecto de Esc(1-21) y Esc(1-21) - 1 c en términos de actividad de la migración celular inducida en las células epiteliales bronquiales expresando la CFTR funcional de cicatrización. En este ensayo, cultura insertos fueron colocadas en los pocillos de una placa de 12 pozos, y cada compartimiento fue sembrado con 35.000 células en MEMg suplementado con 10% FBS. Las células alcanzaron confluencia completa dentro de 24 horas después, se generó un v...

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar el efecto de péptidos sobre la migración de células epiteliales bronquiales. Este método permite la obtención de datos cuantitativos sobre la velocidad de cierre herida de migración celular rápida y altamente reproducible.

Una novela In Vitro de la herida curativa ensayo para evaluar la migración de la célula

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

El objetivo de este procedimiento es mostrar cómo evaluar la capacidad de algunas moléculas inmunomoduladoras, como los antimicropéptidos, para estimular la migración celular, que es un evento limitante de la velocidad durante el proceso de cicatrización de heridas. En términos generales, el procedimiento básico para estudiar la migración celular in vitro implica la creación de una monocapa celular, la producción de pseudoheridas, la captura de imágenes en diferentes intervalos de tiempo hasta llegar al cierre de la herida y el análisis de la secuencia de imágenes para cuantificar la migración celular. Ahora bien, la ventaja de este método sobre el ensayo clásico, que se basa en un rasguño hecho manualmente, se debe al uso de insertos especiales de cultivo de silicona para crear el campo de pseudo-heridas, que está completamente libre de células y con un ancho muy bien definido, 500 micrómetros.Además, gracias a un programa de análisis de imágenes automatizado basado en la web, es posible recibir rápidamente en cuestión de minutos datos cuantitativos sobre la velocidad de cierre de la herida y la migración celular. Por lo tanto, en general, se trata de una técnica experimental fiable que puede aplicarse a cualquier tipo de células adherentes con una reproducibilidad de los datos muy alta. Aquí, se proporciona, a modo de ejemplo, el efecto de un antimicropéptido de piel de rana en la migración de las células epiteliales bronquiales y cómo el pretratamiento de estas células con inhibidores específicos puede proporcionar información sobre el mecanismo molecular que subyace a tales eventos.Más precisamente, se mostrará cómo la migración celular inducida por péptidos implica la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico. Para comenzar el experimento, retire el matraz que contiene células de la incubadora de cultivos celulares y verifique la circunferencia en un microscopio invertido equipado con un sistema automático de adquisición de imágenes. Si se alcanza el 90% de la confluencia completa, cambie a una campana de bioseguridad y aspire cuidadosamente el medio de cultivo con una pipeta de plástico de 10 mililitros en condiciones estériles y deseche suavemente el medio en la botella de desecho.Lavar las células con seis mililitros de PBS sin calcio y magnesio, es decir, CMF. Agite suavemente el matraz manualmente y deseche el CMF. Luego, agregue otros CMF de 10 mililitros para eliminar aún más los desechos celulares y las celdas no adheridas.En este punto, cierre el matraz y vuelva a colocarlo en la incubadora de cultivos celulares durante 10 minutos. Saque el matraz, deseche el CMF y agregue suavemente dos mililitros de tripsina-EDTA para separar las células de la superficie de plástico. Agite suavemente el matraz manualmente, permitiendo que la solución cubra completamente las células, e incube el matraz durante 10 minutos adicionales.A continuación, retire el matraz de la incubadora y compruebe si el proceso de adición de tripsina se ha completado. Si este es el caso, las células estarán en suspensión y aparecerán redondeadas bajo el microscopio. Para inactivar la tripsina, añadir 10 mililitros de medio de cultivo suplementado con suero bovino inactivado al 10% por calor y lavar cuidadosamente el matraz.Recoja la suspensión celular, transfiera este volumen a un tubo cónico de 50 mililitros y centrifugue la muestra. Después de la centrifugación, verifique la formación de gránulos, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en un medio de cultivo de seis mililitros complementado con suero. Pipetea la suspensión de la célula hacia arriba y hacia abajo varias veces para romper cualquier formación de grumos.Este proceso puede tardar algunos minutos. A continuación, saque 10 microlitros con una punta de micropipeta e inyecte el volumen bajo la cubierta del cristal de una cámara Burker o Neubauer y cuente el número de células. En cada pocillo de una placa de 12 pocillos, coloque el inserto de cultivo con la ayuda de pinzas estériles.Cada inserto está provisto de dos compartimentos separados por una pared de 500 micrómetros, y hay una parte inferior pegajosa para permitir la adhesión. Sin embargo, con pinzas, aplique algo de presión a lo largo de los bordes del inserto para fijarlos a la superficie de la placa. Llene cada compartimento del inserto con 70 microlitros de suspensión de celdas que contengan aproximadamente 3,5 por 10 a cuatro celdas por cámara.Es importante destacar que la concentración de células aplicadas en cada compartimento depende del tipo de células. Se recomienda utilizar una densidad celular que conduzca a una confluencia completa dentro de las 24 horas. Bajo el microscopio con un aumento cuádruple, verifique que las células no se escapen de los compartimentos de inserción y luego incube la placa durante 24 horas.Después de la incubación, retire suavemente los insertos con pinzas estériles sin romper las monocapas celulares y transfiera el inserto a papel absorbente. Lave las células agregando un mililitro de medio por pocillo. Tenga cuidado de no agregar el medio directamente sobre las monocapas celulares, para evitar su interrupción.Cierre el plato y muévalo suavemente manualmente. Aspire el medio y reemplácelo con un mililitro de medio fresco por pocillo. Visualice los espacios libres de células bajo el microscopio y adquiera imágenes en el tiempo cero.Retire los medios de los pocillos y agregue PBS suplementado con calcio y magnesio. Agite el plato, retire el PBS y, finalmente, agregue los compuestos de prueba a los pocillos. Para las muestras de control no tratadas, se utiliza un medio de un milímetro.Incuba la placa. Para cada muestra, observe la migración celular bajo el microscopio con un aumento de cuatro veces y adquiera imágenes después de 15, 20 y 24 horas de incubación. Durante este paso, intente capturar imágenes en las mismas áreas que para el tiempo cero.La elección de los intervalos de tiempo en los que se capturan las imágenes depende de la velocidad de migración de las celdas seleccionadas. Una vez finalizado el experimento, seleccione imágenes para cada muestra en los diferentes intervalos de tiempo y cree un archivo zip. Es importante tener al menos tres réplicas para cada muestra en cada intervalo de tiempo.Abra el programa automatizado Image Analysis Wimasis y cargue el archivo zip con el aumento más bajo. El programa proporcionará automáticamente por correo electrónico un archivo de resumen que contiene los datos experimentales del área cubierta de células y las áreas de arañazo como porcentajes de cada muestra, por ejemplo, las muestras 1a y 2a, en los puntos de tiempo seleccionados. Calcule un valor medio de todas las muestras en el tiempo cero.Normalice todos los datos con respecto al valor medio en el tiempo cero. Calcule un valor medio de todas las muestras en cada punto de tiempo y el error estándar relativo. Mediante el uso de la prueba de ANOVA de dos vías, realice un análisis estadístico.Los datos obtenidos se pueden trazar en un gráfico como un histograma que muestra el porcentaje de área cubierta de celdas en diferentes puntos de tiempo para diferentes grupos de muestras. Estos histogramas muestran el cierre de la herida obtenido después de 15, 20 y 24 horas de tratamiento de las células bronquiales con diferentes concentraciones del antimicropéptido escuretina 1-21-1c o escuretina 1-21 en comparación con el control. Como se señala en los histogramas y algunas micrografías representativas, la esculentina 1-21-1c es más eficiente para promover la reepitelización de la pseudoherida en las células bronquiales inducida en el cierre casi completo del campo de la herida en aproximadamente 20 horas en un micromolar, mientras que se necesita una concentración más alta para la esculentina 1-21, es decir, 10 micromolares.Para estudiar el papel de algunos receptores, como el receptor del factor de crecimiento epidérmico, en la migración celular, se pretratan las monocapas celulares con un inhibidor específico, por ejemplo, el compuesto AG1478. Para ello, antes de retirar el inserto, aspire el medio en cada compartimento, lávelo una vez y añada 70 microlitros de medio complementado con cinco micromolares AG1478. Incubar la placa durante 30 minutos.Luego, retire el inserto con pinzas y proceda como se describió anteriormente. Estos son los últimos datos que muestran que la migración celular inducida por péptidos implica la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico. De hecho, después del pretratamiento con el inhibidor AG1478, el porcentaje de área cubierta de células se reduce significativamente en todos los intervalos de tiempo en comparación con los resultados encontrados cuando las células no se incuban previamente con AG1478 antes de agregar el péptido.En conclusión, el método descrito tiene un alto potencial para mejorar significativamente la comprensión de las características migratorias de los diferentes tipos de células, así como la selección de los promotores y/o inhibidores de la cicatrización de heridas más prometedores, en poco tiempo y con una alta precisión.

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Investigación

JoVE Journal

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