Métodos de purificación de biomoléculas basados en cromatografía
En Bioquímica, se emplean métodos basados en cromatografía de purificación para aislar compuestos de una mezcla compleja. Dos tales métodos utilizados…
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"Cromatografía" se refiere a una amplia gama de métodos utilizados para aislar un componente de una mezcla compleja, un paso esencial antes de que se puedan determinar las propiedades y actividades de una biomolécula. Cada técnica cromatográfica tiene un mecanismo de separación diferente, dependiendo de la matriz de la muestra y del compuesto objetivo. Este vídeo se centrará en los principios y el funcionamiento de dos métodos comunes a la bioquímica: la exclusión por tamaño y la cromatografía de afinidad.
La cromatografía de exclusión por tamaño o SEC se basa en el tamaño de los compuestos de la muestra. Una fase móvil que contiene la muestra se añade a una columna con un material poroso: la fase estacionaria. Las moléculas de la muestra se clasifican en 1 de 3 categorías.
Las moléculas demasiado grandes para entrar en los poros recorren la distancia más corta a través de la columna. Cualquier especie con un peso molecular por encima de este "límite de exclusión" saldrá de la columna al mismo tiempo. Las moléculas lo suficientemente pequeñas como para entrar libremente en los poros serán las que más tiempo se retengan y saldrán juntas de la columna. El peso molecular que permite la entrada completa de los poros es el "límite de permeación".
Solo las moléculas entre estos límites se separarán entre sí, ya que pasan diferentes cantidades de tiempo difundiéndose dentro y fuera de los poros. Las moléculas más pequeñas se retienen más tiempo en la columna porque pasan más tiempo en la fase estacionaria, mientras que las moléculas más grandes dentro de estos límites salen antes.
Los pesos moleculares de 1 a 2 órdenes de magnitud se encuentran dentro de estos límites. Las columnas se eligen teniendo esto en cuenta, o se pueden usar varias columnas en serie si hay una amplia gama de compuestos deseados.
Ahora que has visto la teoría de la SEC, veamos cómo se lleva a cabo.
Para comenzar el procedimiento SEC, la columna debe equilibrarse con agua desionizada y tampón de cromatografía. Una vez preparado, el tampón que contiene la muestra se inyecta en la columna. A continuación, el tampón se empuja a través de él a un caudal bajo. Un detector monitorea lo que sale de la columna para determinar la presencia del analito deseado. Las moléculas grandes con pesos moleculares por encima del límite de exclusión salen de la columna al mismo tiempo. Las fracciones pequeñas de la columna se recogen en tubos. Cada fracción se somete a pruebas de calidad de la molécula objetivo mediante electroforesis en gel u otras técnicas analíticas.
Ahora echemos un vistazo a la cromatografía de afinidad o AC, una de las formas más eficientes de purificar proteínas. Muchas biomoléculas se unen selectivamente a ciertos ligandos, una propiedad que AC utiliza al adherir un ligando específico del objetivo a la fase estacionaria.
Cuando la mezcla fluye a través de la columna, las moléculas objetivo se unen al ligando y el resto fluye a través de él. Una vez que la mezcla ha pasado a través de la columna, la molécula objetivo se puede recolectar a través de uno de los dos métodos de elución basados en la especificidad.
Se puede decir que la elución bioespecífica tiene un papel "normal" o "inverso". En la elución bioespecífica de función normal, se añade un agente que compite con el ligando adherido para unirse a la biomolécula objetivo.
En la elución bioespecífica de papel inverso, un agente compite con el objetivo para unirse al ligando adherido. El segundo tipo de elución, la elución no específica, reduce la unión del objetivo al ligando al cambiar el pH, la fuerza iónica o la polaridad de la solución. Si una proteína no se une a un ligando que puede ser inmovilizado, la proteína puede expresarse conteniendo una "etiqueta": secuencias cortas de péptidos diseñadas para unirse al ligando.
Una variedad es la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, "IMAC" para abreviar, en la que un ligando metálico adherido, como el níquel o el cobalto, se une a los residuos de histidina de la proteína modificada. A través de técnicas de biología molecular, las proteínas objetivo se generan con residuos de histidina que se repiten, llamados polihistidina-marca, que se unen al metal a través de la cadena lateral de imidazol en la histidina. Una vez unida, la proteína puede recolectarse con imidazol libre a través de elución específica de función inversa y luego usarse en una amplia variedad de aplicaciones posteriores. Ahora que has visto la teoría de la cromatografía de afinidad, veamos un procedimiento IMAC en el laboratorio.
En IMAC, la fase estacionaria se puede añadir directamente a la mezcla de fase móvil y muestra, lo que permite la unión de la proteína marcada con his. A continuación, este lodo se vierte en la columna, donde los compuestos no unidos gotean en los residuos, mientras que el lodo permanece. El contenedor de lodo se enjuaga para recoger la resina residual y la muestra, que se añade a la columna.
La resina se agita para garantizar que los componentes no unidos fluyan libremente. El tampón de lavado agregado ayuda a eliminarlos. Una vez que se han eliminado todos los componentes no unidos, los desechos se reemplazan con un contenedor para recolectar la proteína objetivo.
Se añade un tampón que contiene imidazol, se agita y se deja reposar para desaglutinar la molécula objetivo. El imidazol se une al metal, reemplazando y liberando la proteína marcada. Se recoge la proteína liberada y se repite el paso de imidazol para garantizar la recolección total. Para purificar aún más la muestra, se puede ejecutar SEC en la muestra antes del análisis.
Ahora que hemos visto la teoría y el procedimiento de estas dos técnicas, veamos algunas de las formas en que se aplican en el campo bioquímico.
Una razón común para purificar proteínas es estudiar su papel en la enfermedad. La fibrosis quística es causada por defectos en la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística, o CFTR. Después de cultivar la proteína con un his-tag en levadura, tanto la cromatografía de afinidad como la de exclusión por tamaño permiten el aislamiento de la proteína, seguido del estudio de su función.
En algunos casos, la presencia de una etiqueta de polihistidina puede cambiar la estructura de una proteína, afectando así su función. Otra etiqueta común es la proteína de unión a maltosa o MBP, que se unirá a la amilosa unida en una columna. A continuación, se utiliza maltosa para liberar el complejo. A continuación, el MBP puede escindirse y eliminarse con SEC para producir la proteína pura deseada.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la exclusión de tamaño y la cromatografía de afinidad. Cubrió la teoría de las técnicas, repasó los procedimientos generales y cubrió algunos de los usos de las técnicas.
¡Gracias por mirar!
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Q1: How does size-exclusion chromatography separate molecules in a mixture?
Size-exclusion chromatography separates molecules based on their size using a column packed with porous material. Large molecules cannot enter the pores and exit first, while small molecules enter the pores and exit last. Only molecules between the exclusion and permeation limits are separated from one another as they spend varying amounts of time diffusing in and out of the pores.
Q2: What are the three molecular weight categories in size-exclusion chromatography?
Molecules fall into three categories: those above the exclusion limit that cannot enter pores and exit together first; those below the permeation limit that freely enter pores and exit together last; and those between these limits that separate based on varying retention times. Molecular weights across one to two orders of magnitude typically fall within the separation range.
Q3: How does affinity chromatography use ligands to purify target proteins?
Affinity chromatography attaches target-specific ligands to the stationary phase. When a mixture flows through the column, target molecules selectively bind to the ligands while other components pass through. The target protein is then collected through elution methods that either compete with the ligand or change solution conditions like pH or ionic strength.
Q4: What is a polyhistidine tag and how is it used in immobilized metal affinity chromatography?
A polyhistidine tag is a short peptide sequence of repeating histidine residues engineered onto target proteins. In immobilized metal affinity chromatography, these tags bind to adhered metal ligands like nickel or cobalt via the imidazole side chain on histidine. The tagged protein is then released using free imidazole via reverse-role specific elution.
Q5: What steps are involved in the immobilized metal affinity chromatography procedure?
The IMAC procedure involves adding the stationary phase directly to the sample mixture to allow his-tagged protein binding. The slurry is poured into a column where unbound compounds drain to waste. After washing to remove unbound components, imidazole buffer is added to release the target protein by competing with the metal ligand.
Q6: Why might researchers combine size-exclusion and affinity chromatography in protein purification?
Researchers combine these techniques to achieve higher purity levels. After affinity chromatography isolates the target protein using ligand binding, size-exclusion chromatography can further purify the sample by separating based on molecular size. This sequential approach is particularly useful when protein tags like polyhistidine may affect protein structure or function.
Q7: How is gel electrophoresis used to evaluate fractions collected from size-exclusion chromatography?
After fractions are collected from the size-exclusion column, gel electrophoresis and other analytical techniques are used to test the quality and identity of the target molecule in each fraction. This verification step ensures that the desired biomolecule has been successfully isolated and separated from other components in the mixture.