Proyección de imagen funcional de fábricas de transcripción Viral mediante microscopia de fluorescencia 3D

El objetivo general de combinar el ARN-FISH naciente con la tinción de aminoácidos de proteínas latentes virales es visualizar la transcripción activa acoplada a la formación de fábricas de transcripción viral. Este método se puede utilizar para ayudar a responder preguntas clave en los campos de la genética, la biología celular, la virología y la virología de la biología celular. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un modelo de minicromosoma viral inducible para estudiar los detalles moleculares detrás de las alteraciones arquitectónicas genómicas.

Recoja las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar las celdas durante dos minutos a una gravedad de 200 voltios. Lave las células tres veces con un mililitro de DEPC PBS estéril.

A continuación, vuelva a suspender las celdas en 1,2 mililitros de DEPC PBS. Coloque los deslizadores de la tapa en el fondo de una placa de seis pocillos. Pipetee 200 microlitros de la mezcla de células DEPC PBS en cada cubreobjetos.

Después de que las células se hayan asentado durante dos minutos, aspire el exceso de DEPC PBS, dejando solo una capa delgada de células. Agregue con cuidado un mililitro de solución de fijación a cada cubreobjetos. Deje que las celdas se fijen durante 10 minutos.

Lave las fundas tres veces con DEPC PBS. Después del lavado, agregue cuidadosamente un mililitro de glicina DEPC PBS a una concentración final de glicina de 100 milimolar en cada cubreobjetos. Deje que las células se apaguen durante cinco minutos.

Agregue 1,5 mililitros de DEPC PBS y colóquelo en una coctelera durante cinco minutos, y agite firme pero suavemente con la mano durante un minuto. Aspire el exceso de DEPC PBS y tenga cuidado de no alterar las células. Agregue con cuidado un mililitro de solución permeable a cada cubreobjetos.

Deje que las células se permeabilicen durante 15 minutos. Añade 1,5 mililitros de DEPC PBS. Coloque las células en una coctelera durante cinco minutos y agite firme pero suavemente con la mano durante un minuto.

Aspire el exceso de DEPC PBS y tenga cuidado de no alterar las células. Etiquete los portaobjetos del microscopio y humedezca una toalla de papel, luego forre el fondo de un recipiente de plástico hermético con la toalla. A continuación, prepare la solución de anticuerpos primarios y multiplique la receta por cada cubreobjetos presente.

Coloque 30 microlitros de solución de anticuerpo primario en cada portaobjetos de microscopio marcado. Asegúrese de que la concentración primaria de anticuerpos sea correcta sosteniendo la esquina del cubreobjetos y agitándolo suavemente. Además, la esquina de un pañuelo se puede utilizar para absorber el exceso de humedad.

A continuación, coloque el cubreobjetos sobre los portaobjetos del microscopio etiquetados, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Cubra el exterior del recipiente con una envoltura de plástico. Mueva el recipiente a una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora.

Durante la incubación, prepare los reactivos necesarios. Después de la incubación, lave las células tres veces con DEPC PBS en una placa de seis pocillos durante cinco minutos cada una. A continuación, lave las células con el tampón de lavado FISH tres veces durante cinco minutos cada una.

Y mantenga el cubreobjetos en el tampón de lavado FISH hasta que se haya preparado el anticuerpo secundario, una mezcla de sonda de intrones. A continuación, limpie los portaobjetos de vidrio para la incubación primaria de anticuerpos para la hibridación con agua jabonosa. Una vez que estén secos, límpialos con etanol y un pañuelo de laboratorio.

Coloque 40 microlitros del anticuerpo secundario y la sonda de intrón FISH con solución en cada portaobjetos de vidrio. Coloque los cubreobjetos con las celdas en los portaobjetos con el lado de las celdas hacia abajo en la parte superior del tampón. Y ten cuidado de no introducir burbujas.

Coloque los portaobjetos en un recipiente de plástico con una toalla de papel húmeda en el fondo. Envuelva el recipiente de plástico primero en una envoltura de plástico y luego en papel de aluminio. E incubar el recipiente con los portaobjetos.

Después de la incubación, deslice con cuidado el cubreobjetos desde el borde del portaobjetos de vidrio y vuelva a colocarlo en placas de seis pocillos, boca arriba. Lave las células con el tampón de lavado FISH tres veces en una placa de seis pocillos durante cinco minutos cada una. A continuación, lave las células dos veces con SSC de dos pliegues.

Agregue DAPI a una concentración de uno a 1000 en el SSC doble y deje reposar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lave las células dos veces con SSC doble. Limpie los portaobjetos de vidrio utilizados para la hibridación y agregue 10 microlitros de solución de montaje en los portaobjetos de vidrio.

Coloque los deslizadores de la cubierta boca abajo sobre la solución de montaje. Con un pañuelo de laboratorio, retire suavemente el exceso de solución de montaje, teniendo cuidado de no aplastar las células. Con esmalte de uñas, aplique una capa abundante alrededor del borde de los cubreobjetos y deje que el esmalte se seque.

La muestra ya está lista para la microscopía de fluorescencia. Las células BCBL-1 se tiñeron para el ARN LANA y K-Rta para examinar dónde se encuentran los episomas virales que transcriben activamente y la heterogeneidad de la respuesta a los estímulos de reactivación del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi o KSHV. La fluorescencia distintiva de K-Rta en regiones que coinciden estrechamente con la distribución de los episomas virales es evidencia de que la transcripción activa tiene lugar cerca de los genomas de KSHV.

En la misma muestra, se pueden observar células que exhiben una fluorescencia de K-Rta mucho más débil y difusa que no se superpone significativamente con LANA, lo que ilustra la considerable variación y el grado de respuesta a los estímulos de reactivación dentro de una población de células. A continuación, se examinó la eficacia de la sincronización de la timidina mediante la visualización de la expresión de la proteína viral, lo que demostró claramente que las células sincronizadas respondían más a los estímulos de reactivación que la población no sincronizada. La tinción DAPI puede cumplir varias funciones, este ejemplo muestra claramente que hay tres células separadas en lugar de una.

La microscopía 3D junto con esta técnica reveló estructuras PII de ARN en forma de anillo observadas con genomas de KSHV salpicados en la periferia. Con su desarrollo, el mini cromosoma viral proporcionaría herramientas únicas para que los investigadores exploren la organización temporal especial de la expresión génica y la regresión del núcleo celular.