Desarrollo de un ensayo In Vitro para cuantificar Progenitor y vástago hematopoyética células (HSPCs) en el desarrollo de embriones de pez cebra
30 de noviembre de 2017
Aquí, presentamos un método simple para cuantificar madre y progenitoras células hematopoyéticas (HSPCs) en el pez cebra embrionario. HSPCs de pez cebra disociado se platean en metilcelulosa con factores de apoyo, diferenciando en sangre madura. Esto permite la detección de sangre defectos y permite para realizarse fácilmente de detección de drogas.
El objetivo general de este ensayo es enumerar y examinar la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas en el embrión de pez cebra en desarrollo. Este método puede ayudar a responder algunas preguntas realmente importantes en el campo hematopoyético, como por ejemplo, cuántas células madre y progenitoras hay realmente en un embrión de pez cebra en desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, es relativamente barata y es fácil de realizar.
Aunque este método puede proporcionar información sobre el número de progenitores presentes en el pez cebra en desarrollo, también permite a los investigadores medir el efecto funcional que un fármaco o una mutación genética tiene en la formación de progenitores sanguíneos. Tuvimos la idea de este método, cuando estábamos derribando genes que hipotetizábamos que eran cruciales para el desarrollo de la sangre. Predijimos que con este ensayo seríamos capaces de medir la diferencia entre los embriones que se desarrollaban normalmente y los que eran morfantes.
Para blanquear los embriones de pez cebra, use recipientes de plástico para crear tres estaciones de lavado, con una que contenga un mililitro de lejía al cinco por ciento por litro de E3 y dos estaciones que contengan E3 estéril. Con una pipeta de transferencia, coloque los embriones en un colador de té y sumérjalos en la estación de lavado número uno durante cinco minutos. A continuación, transfiera el colador de té con los embriones a la estación de lavado número dos durante cinco minutos. Repita para la estación de lavado número tres durante los últimos cinco minutos.
Después del último lavado, retire los embriones del colador de té dándole la vuelta sobre una placa de Petri limpia de 10 centímetros y use una pipeta de transferencia y E3 estéril para enjuagar suavemente los embriones del colador. Para descorionar los embriones, utilice una pipeta de transferencia para eliminar y desechar la mayor cantidad posible de E3 de la placa de Petri. A continuación, añadir 500 microlitros de prodeas de decorionación a los embriones e incubarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, golpee suavemente el costado de la placa de Petri para eliminar completamente los coriones. A continuación, con una pipeta serológica, añadir 20 mililitros de E3 estéril para diluir las prodeas. Permita que los embriones se asienten y use una pipeta para eliminar el E3. Repita este paso de lavado tres veces para eliminar todos los rastros de las prodeas de descorionación.
Para preparar muestras de embriones, utilice una pipeta para colocar 10 embriones en un único tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. A continuación, pipetea con cuidado el E3 y deséchalo. Transfiera las muestras a una campana de flujo laminar y lave los embriones agregando un mililitro de E3 estéril, permitiendo que los embriones se asienten en el fondo del tubo.
A continuación, utilice una pipeta P1000 para eliminar el sobrenadante. Repita durante un total de tres lavados. Después del último lavado, retire el E3 y deséchelo.
A continuación, añade un mililitro de DTT de 10 milimolares en E3 para eliminar la capa de moco y las esporas, levaduras o bacterias que puedan quedar atrapadas en ella alrededor de los embriones. Ahora, coloque el tubo de microcentrífuga horizontalmente e incube a temperatura ambiente durante 25 minutos. Para disociar los embriones, use un mililitro de DPBS estéril para lavar la muestra tres veces.
Después del último lavado, añadir 500 microlitros de DPBS con calcio y magnesio y cinco microlitros de prodeas de disociación de cinco miligramos por mililitro. Incubar las muestras a 37 grados centígrados en un agitador orbital horizontal a 180 rpm durante 60 minutos. A continuación, coloque las muestras y la campana de flujo laminar y utilice un P1000 para triturar los embriones hasta que las muestras estén completamente disociadas.
Tenga cuidado y revise los embriones periódicamente para determinar cuándo están disociados. Es conveniente que haya algo de tejido. Es posible digerir en exceso los embriones, lo que destruirá las células progenitoras.
Pipetea los 10 embriones disociados en el depósito superior de un tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros con un tapón de filtro de células de 35 micrómetros. Con una pipeta y PBS estéril, enjuague el tubo embrionario y transfiera la solución al tubo de poliestireno de cinco mililitros que contiene las células filtradas. Repita el enjuague hasta que haya cuatro mililitros de líquido en el tubo.
Centrifugar los tubos a 300 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para palear la muestra de células homogeneizadas. Con una pipeta, retire y deseche el sobrenadante del tubo inferior redondo, teniendo cuidado de no alterar las células peletizadas en el fondo. Luego use 100 microlitros de PBS para volver a suspender las células.
Prepare una solución madre de metilcelulosa completa X y use jeringas de tres mililitros y agujas de calibre 16 para agregar 2,5 mililitros de tubos estériles de 14 mililitros de fondo redondo. Use un tubo para cada condición evaluada. Para la diferenciación mieloide, agregue un uno por ciento de suero de carpa y 0,3 miligramos por mililitro de factor estimulante de colonias de granulocitos de pez cebra recombinante o GCSF al medio de metilcelulosa.
Para la diferenciación eritroide, agregue un uno por ciento de suero de carpa y 0,1 miligramos por mililitro de eritropoyetina o EPO de pez cebra recombinante al medio de metilcelulosa. Para examinar los progenitores de varios linajes, agregue EPO y GCSF. Con una pipeta, agregue 100 microlitros de los 10 embriones disociados a la superficie de la metilcelulosa preparada con las citocinas recombinantes en el suero de carpa.
Tape la tapa y realice un vórtice suave para homogeneizar completamente la muestra. Cada tubo debe contener ahora el tejido disociado de 10 embriones. Usando jeringas de tres mililitros y agujas de calibre 16, alícuota un mililitro de muestra en dos placas de Petri separadas de 35 milímetros.
Asegúrese de que la muestra esté completamente dispersa por toda la placa de Petri. Repita para cada muestra. Coloque las placas de Petri de 35 milímetros con células y metilcelulosa en una placa de Petri de 15 centímetros.
A cada plato grande, agregue un plato de 35 milímetros con cinco mililitros de agua estéril para humidificar las muestras. Incuba los platos a 32 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante siete a 10 días. Finalmente, visualice las unidades formadoras de colonias de acuerdo con el protocolo de texto.
Después de siete días en cultivo con factores de soporte hematopoyéticos, se contaron y tomaron imágenes de los progenitores de 48 embriones de pez cebra HPF. Es importante destacar que la cantidad de CF utilizada se correlaciona directamente con el número de embriones plateados. El siembra de cuatro u ocho embriones por mililitro, que se correlaciona con comenzar con 10 o 20 embriones, al comienzo del experimento, produce aproximadamente 1200 o 2400 UFC respectivamente.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas y media si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no hay que digerir demasiado los embriones, ya que esto destruirá las células progenitoras. Con este procedimiento, puede comparar el número de progenitores presentes en diferentes puntos de tiempo.
Puede comparar animales mutantes con animales de tipo salvaje, así como probar el efecto de los medicamentos en el desarrollo de la sangre. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de metilcelulosa para enumerar los progenitores hematopoyéticos del pez cebra. Puede modificar este procedimiento para que se adapte a sus necesidades experimentales específicas, como probar citocinas específicas.
No olvide que trabajar con sangre y agujas de vertebrados puede ser extremadamente peligroso y siempre se debe tener cuidado al realizar este ensayo.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo presenta un método para cuantificar células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) en pez cebra embrionario. La técnica permite la detección de defectos sanguíneos y facilita la selección de fármacos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología hematopoyética
- Desarrollo embrionario
- Tamizaje de fármacos
Antecedentes
- Comprender la dinámica de las células madre y progenitoras hematopoyéticas es fundamental para la biología del desarrollo.
- El pez cebra sirve como organismo modelo para estudiar el desarrollo sanguíneo.
- Los métodos existentes pueden carecer de eficiencia y accesibilidad.
- Este método tiene como objetivo proporcionar un enfoque rápido y rentable.
Objetivo del estudio
- Enumerar las células progenitoras hematopoyéticas en embriones de pez cebra en desarrollo.
- Evaluar el impacto de mutaciones genéticas y fármacos sobre la formación de progenitores sanguíneos.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos del desarrollo sanguíneo.
Métodos Utilizados
- Disociación de embriones de pez cebra para aislar CPHs.
- Siembra de células en metilcelulosa con factores de soporte.
- Observación de la diferenciación en células sanguíneas maduras.
- Comparación entre embriones normales y genéticamente modificados.
Resultados principales
- El método permite la cuantificación de las CPH en un embrión en desarrollo.
- Los investigadores pueden detectar diferencias en la formación de progenitores sanguíneos debidas a modificaciones genéticas.
- El cribado de fármacos puede realizarse de manera efectiva utilizando esta técnica.
- Se obtienen conocimientos sobre el papel de genes específicos en el desarrollo sanguíneo.
Conclusiones
- Este ensayo es una herramienta valiosa para estudiar el desarrollo hematopoyético.
- Proporciona un método rápido y económico para los investigadores.
- La técnica mejora la comprensión de la dinámica de las células progenitoras sanguíneas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La enumeración cuantitativa de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en embriones de pez cebra aborda un cuello de botella crítico en las primeras etapas del descubrimiento para la validación de fármacos y dianas genéticas hematopoyéticas. Este ensayo in vitro permite una evaluación funcional rápida y rentable de intervenciones candidatas, apoyando la confianza predictiva y la reducción de riesgos mecanicistas en la fase preclínica. El enfoque agiliza la selección de carteras al proporcionar datos escalables y reproducibles sobre la biología de las HSPC relevantes para el desarrollo sanguíneo y la modelización de enfermedades.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la cuantificación directa de las CPH para investigar hipótesis terapéuticas en la hematopoyesis.
- Apoya la validación funcional de dianas genéticas e intervenciones en vías en un modelo vertebrado.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos al distinguir los efectos de mutaciones o compuestos en la formación de progenitores.
- Proporciona datos accionables para priorizar dianas con potencial traslacional en trastornos sanguíneos.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona una plataforma estandarizada y reproducible para evaluar los efectos de fármacos o genéticos sobre la proliferación y diferenciación de CPH.
- Genera resultados cuantitativos de unidades formadoras de colonias (UFC) para comparaciones robustas entre condiciones experimentales.
- Reduce las barreras técnicas y los costos, facilitando una adopción más amplia en iniciativas de cribado de alto rendimiento.
- Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo de cribado mecanicista o fenotípico de etapas posteriores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con la biología hematopoyética relevante para la enfermedad, facilitando la exploración de biomarcadores traslacionales.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica, al posibilitar lecturas funcionales en un sistema vertebrado.
- Ofrece una plataforma para tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo en las etapas de desarrollo de fármacos hematopoyéticos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este ensayo in vitro de PCSH de pez cebra se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, conectando la validación temprana de objetivos, la selección y la investigación traslacional para programas hematopoyéticos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar las respuestas de las células progenitoras a perturbaciones genéticas o químicas.
- Selección: Ofrece mediciones cuantitativas y reproducibles de UFC para evaluar la preparación de ensayos y compuestos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de los resultados de PSHC en condiciones de tipo silvestre, mutantes y tratadas con fármacos.
- Investigación Traducional: Proporciona datos funcionales relevantes para la hematopoyesis en vertebrados y la modelización de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de ensayo escalable y adaptable para diversas necesidades de investigación y selección hematopoyética.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos hematopoyéticos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad para su adopción entre diferentes equipos.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos rápidos y accionables.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de los programas hematopoyéticos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de pez cebra, disociación de embriones y técnicas estériles.
- Necesita acceso a infraestructura para cultivo celular y equipos de imagen para la cuantificación de UFC.
- Exige una estandarización entre equipos en las densidades de siembra y las condiciones de citocinas para garantizar la reproducibilidad.
- Es adaptable a diferentes fondos genéticos o paneles de citocinas según las preguntas de investigación específicas.
- Se requiere una optimización cuidadosa para evitar una digestión excesiva y la pérdida de células progenitoras.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Bleach and Dechorionate 48 hpf Zebrafish Embryos
3:19
Embryos for Dissociation
5:15
Preparation of Dissociated Embryos
6:21
Preparation of Methylcellulose
7:30
Addition of Dissociated Embryos to Methylcellulose
8:53
Results: Quantitation of Zebrafish Embryonic Hematopoietic Stem and Progenitor Cells
9:32
Conclusion
