Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

El objetivo general de este protocolo es aumentar la cantidad de ADN bicatenario aislado y las posteriores bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento a partir de especímenes de herbario, maximizando su utilidad en estudios filogenómicos. Este método libera el potencial de especímenes de herbario que, de otro modo, no serían útiles para proyectos de secuenciación como secuencias genómicas debido a la extensa degradación de la muestra. La principal ventaja de esta técnica es que es lo suficientemente robusta como para que se puedan utilizar especímenes de herbario raros e históricamente significativos sin necesidad de un muestreo destructivo extenso.

Esta técnica amplía la profundidad del muestreo de taxones en proyectos sistemáticos espaciados. La adquisición de especies es un paso limitante, pero con este protocolo, las colecciones históricas se pueden utilizar fácilmente en estos estudios. Agregue nitrógeno líquido y de 30 a 50 miligramos de arena esterilizada para moler un centímetro cuadrado de tejido de herbario preseleccionado hasta convertirlo en polvo fino en mortero preenfriado.

La molienda adecuada es esencial para el éxito del aislamiento del ADN. Y se debe tener cuidado de que la muestra esté completamente pulverizada. A continuación, agregue el polvo congelado a dos tubos de dos mililitros, llenando no más de la mitad del volumen del tubo.

Luego agregue 600 microlitros de solución tibia de CTAB a cada tubo. Mezcle bien el polvo invirtiendo y en vórtice. A continuación, incubar las muestras en un baño de agua mantenido a 65 grados centígrados durante una a 1,5 horas.

Mientras tanto, vórtice cada 15 minutos. A continuación, centrifugar las muestras a 10.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, transfiera aproximadamente 500 microlitros del sobrenadante a un nuevo juego de tubos marcados.

Al sobrenadante, agregue cuatro microlitros de 10 miligramos por mililitro de RNasa A a cada melodía. A continuación, mezcle el contenido del tubo invirtiendo o pipeteando. Incubar las muestras en un bloque de calor o baño de agua mantenido a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Una vez que los tubos hayan alcanzado la temperatura ambiente, agregue aproximadamente 500 microlitros de mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico 25:24:1 a las muestras. A continuación, mezcle el contenido de los tubos invirtiendo o pipeteando repetidamente. A continuación, centrifugar las muestras a 12.000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Transfiera la capa acuosa superior, que es de aproximadamente 400 microlitros, a un nuevo juego de tubos etiquetados. A la capa acuosa de cada tubo, agregue aproximadamente 400 microlitros de mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico 24:1. Mezcle bien la muestra mediante pipeteo repetido o inversión.

A continuación, centrifugar los tubos a 12.000 g durante cinco minutos y transferir aproximadamente 300 microlitros de capa acuosa superior a tubos preenfriados y etiquetados. A continuación, agregue 300 microlitros de isopropanol preenfriado y 12 microlitros de acetato de sodio de 2,5 molares. A continuación, incubar los tubos a 20 grados centígrados bajo cero durante 30 a 60 minutos.

Después de la incubación, retire las muestras del congelador. A continuación, centrifugar las muestras a 12.000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, lave el pellet con aproximadamente 300 a 500 microlitros de etanol al 70%.

De nuevo, centrifugar los tubos a 12.000 g durante 10 minutos. Luego, sin alterar el pellet, retire con cuidado el sobrenadante. A continuación, seque al aire los gránulos y disuelva el ADN en 50 microlitros de tampón Tris-EDTA 1X.

Agregue de uno a 16 microlitros de ADN aislado y dos microlitros de tampón de reacción de fragmentación en un tubo de reacción en cadena de la polimerasa de 0,2 mililitros. Ajustar el volumen final a 18 microlitros con agua libre de nucleasas. A continuación, agregue dos microlitros de enzima de fragmentación de ADN de doble cadena y agite la mezcla brevemente durante unos segundos.

A continuación, incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 8,5 minutos en el termociclador. Después de la incubación, agregue cinco microlitros de EDTA 0.5 molar a los tubos. Agregue 25 microlitros de agua libre de nucleasas para ajustar el volumen total del ADN cortado a 50 microlitros.

A continuación, añada 45 microlitros de perlas SPRI mantenidas a temperatura ambiente a 50 microlitros de ADN cortado y mezcle bien las dos pipeteándolas hacia arriba y hacia abajo. Deje la muestra que contiene los tubos durante cinco minutos. A continuación, transfiera los tubos a una placa magnética y espere otros cinco minutos.

Expulsa con cuidado el sobrenadante. A continuación, añada 200 microlitros de etanol fresco al 80% a los tubos del soporte magnético y espere otros 30 segundos a temperatura ambiente. Después de 30 segundos, retire con cuidado el sobrenadante.

Deje la tapa del tubo abierta para que las cuentas se sequen al aire durante cinco minutos en el soporte magnético. A continuación, retire los tubos del soporte magnético y eluya el ADN de las perlas en 55 microlitros de tampón Tris-EDTA 0,1X. Mezcle bien el ADN mediante pipeteo repetido.

A continuación, incubar la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos. Nuevamente, coloque el tubo en el soporte magnético y espere a que la solución se aclare en aproximadamente dos minutos. Retire 52 microlitros del sobrenadante y luego realice el análisis de cuantificación de ADN como se describe en el protocolo de texto.

A 50 microlitros de ADN limpio y cortado, agregue tres microlitros de endonucleasa, enzimas de cola de fosfato y siete microlitros de tampón de reacción. Mezcle bien el ADN y los otros componentes pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, gira los tubos para eliminar las burbujas.

Después de centrifugar, transfiera las muestras a un termociclador y configure el programa. Divida el adaptador de 25 a 50 veces para lograr una concentración de trabajo de 0,6 a 0,3 micromolares. Para una secuenciación de lectura corta de alto rendimiento, agregue 30 microlitros de mezcla maestra de ligadura, un microlitro de potenciador de ligadura y 2,5 microlitros de adaptador a las trompas.

Mezcle bien el contenido de los tubos pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Nuevamente, gire los tubos para eliminar las burbujas. Luego incube el tubo a 20 grados centígrados durante 15 minutos.

Añadir tres microlitros de mezcla comercial de uracilo-ADN glicosilasa y ADN glicosilasa liasa endonucleasa VIII a los tubos. Ajusta el volumen total a 96,5 microlitros. Mezcle bien los componentes e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos en el termociclador.

En el tubo, prepare la mezcla de reacción en cadena de la polimerasa añadiendo todos los reactivos al ADN limpio y ligado al adaptador. A continuación, mezcle bien la reacción mediante vórtice. Una vez que haya terminado el vórtice, coloque las muestras en el termociclador e inicie la configuración de amplificación del termociclador.

Agregue unos 25 microlitros de perlas magnéticas mantenidas a temperatura ambiente a la muestra y mezcle mediante pipeteo repetido. Incubar la muestra durante cinco minutos. A continuación, transfiera los tubos a un soporte magnético y espere otros cinco minutos.

Después de cinco minutos, retire el sobrenadante y colóquelo en un nuevo conjunto de tubos etiquetados. A continuación, al sobrenadante, añadir seis microlitros de perlas SPRI mantenidas a temperatura ambiente y mezclar bien. Después de incubar las muestras durante cinco minutos, transfiera los tubos a la placa magnética y espere otros cinco minutos.

Retire y deseche el sobrenadante. A continuación, añada 200 microlitros de etanol fresco al 80% a los tubos del soporte magnético. A continuación, incuba los tubos a temperatura ambiente durante 30 segundos.

Después de 30 segundos, retire con cuidado el sobrenadante y seque las perlas al aire durante cinco minutos con la tapa del tubo abierta mientras aún está en el soporte magnético. Ahora retire los tubos del imán. Eluir el ADN objetivo de las perlas en 33 microlitros de tampón Tris-EDTA 0,1X y someter a una mezcla minuciosa.

Después de mezclar adecuadamente, incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, transfiera los tubos al soporte magnético y espere unos dos minutos hasta que la solución se vuelva transparente. Pipetear 30 microlitros del sobrenadante en tubos de dos mililitros para su almacenamiento.

Para mostrar el aislamiento del ADN del herbario, se utilizó un gel de agarosa con ADN bicatenario aislado de diferentes especímenes de herbario. Usando 10 miligramos de tejido foliar, se cargaron casi 3,56 a 2.610 nanogramos de ADN bicatenario aislado en el gel de agarosa. El gel muestra el ADN degradado del herbario en forma de frotis en todos los carriles.

A continuación, con el fin de mostrar la recuperación de una biblioteca de secuenciación de alta calidad a partir de ADN aislado de 10 especímenes de herbario, se utilizó un gel de agarosa. Antes de cargar el gel de agarosa, aproximadamente de 1,26 a 464 nanogramos del ADN aislado del herbario se sometió a un cizallamiento enzimático y una limpieza con un volumen de perlas del 90%. El gel de agarosa muestra la recuperación de una biblioteca de secuenciación de alta calidad a partir del ADN de 10 especímenes de herbario.

Las bibliotecas de secuenciación final muestran una banda primaria entre 300 y 500 pares de bases. Luego, para mostrar la secuencia de escopeta del ADN derivado del herbario, se obtuvo un diagrama circular del genoma del cloroplasto TK 686. La secuencia muestra la longitud total del ADN, la región de repetición invertida y la presencia de regiones grandes y pequeñas de una sola copia.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 24 muestras en menos de 13 horas con solo unas ocho horas de tiempo de manipulación activo. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la captura de secuencias, en las bibliotecas resultantes para generar datos nucleares para estudios filogenéticos.