Name: Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Aprende a construir bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento a partir de especímenes de herbario degradados. Este protocolo robusto maximiza el aislamiento de ADN para estudios filogenómicos sin muestreo destructivo extenso.

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Agradecemos a Taylor AuBuchon-anciano, Jordania Teisher y Kristina Zudock asistencia en ejemplares de herbario de muestreo y el jardín botánico de Missouri para el acceso a los especímenes de herbario para muestreo destructivo. Este trabajo fue el apoyo de una beca de la National Science Foundation (DEB-1457748).

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.

El protocolo presentado aquí es un método integral y robusto para aislamiento de DNA y la secuencia de preparación de biblioteca de muestras de la planta seca. La consistencia del método y mínima necesidad de alterarlo según el ejemplar calidad hacen que escalable para proyectos grandes secuenciación basada en herbario. La inclusión de un paso de Reamplificación opcionales para las bibliotecas de bajo rendimiento permite la inclusión de baja calidad, baja cantidad, rara o históricamente importantes muestras que de lo con...

Colecciones de herbario son una fuente potencialmente valiosa de especies y diversidad genómica de estudios incluyendo phylogenetics1,2,3, genética de poblaciones4,5, conservación Biología6, de la biología de las especies invasoras7y rasgo evolución8. La capacidad para obtener una rica diversidad de especies, poblaciones, regiones geográficas y momentos destaca el "tesoro"9 que es el herbario. Históricamente, la naturaleza degradada del ADN derivado de herbario ha obstaculizado los proyectos basados en PCR, a menudo relegando los investigadores a usar sólo los marcadores encontrados en copia alta, como las regiones del genoma de cloroplasto o el espaciador transcrito interno (ITS) de la ribosomal ARN. Calidad de las muestras y ADN varían ampliamente en base a métodos de conservación9,10, con las roturas de doble hebra y fragmentación de calor utilizado en el proceso de secado siendo las formas más comunes de daños, la creación de la supuesto 90% ADN calabozo que ha gravado estudios basados en PCR11. Aparte de fragmentación, lo segundo más frecuente en la genómica de herbario es contaminación, tales como que derivado de los hongos endófitos13 u hongos adquirieron post mortem después de la recolección, pero antes de montar en el herbario12, aunque este problema puede ser solucionado bioinformatically dado la derecha fungicida base de datos (véase abajo). Un problema terceros y menos común, es modificación de la secuencia a través de citosina desaminación (G→T/C/A)14, aunque se estima que bajo (~ 0,03%) en ejemplares de herbario11. Con el advenimiento de secuenciación de alto rendimiento (HTS), la cuestión de la fragmentación puede superarse con lecturas cortas y secuenciación profundidad12,15, permitiendo la adquisición de datos de nivel genómico de numerosas muestras con baja calidad ADN e incluso a veces permitiendo que todo el genoma secuencia15.
Muestras de herbario son cada vez más frecuente y son un componente más grande de proyectos filogenética16. Un reto actual de la utilización de especímenes de herbario para HTS constantemente es obtener suficiente ADN de trenzado doble, un requisito previo necesario para los protocolos de la secuencia, de numerosas especies de manera oportuna, sin necesidad de optimizar los métodos para el individuo muestras. En este documento, un protocolo para la extracción de ADN y biblioteca preparación de especímenes de herbario se demuestra que se aprovecha de los métodos existentes y modifica para permitir resultados rápidos y reproducibles. Este método permite el completo procesamiento del espécimen a una biblioteca de 24 muestras 13 h, con el tiempo práctico 8 h o 16 h, con tiempo práctica 9 h, cuando se requiere el paso de Reamplificación opcional. Proceso simultáneo de muestras más es factible, aunque el factor limitante es la centrifugadora de la capacidad y habilidad técnica. El protocolo está diseñado para requerir sólo típico equipo de laboratorio (termociclador, centrífuga y soportes magnéticos) en lugar de equipo especializado, como un nebulizador o un sonicador, para el corte de ADN.
Calidad de ADN, el tamaño de fragmento y cantidad son limitantes para el uso de ejemplares de herbario en experimentos de secuenciación de alto rendimiento. Otros métodos para aislar ADN de herbario y crear bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento han demostrado la utilidad de utilizar tan poco como 10 ng de ADN16; sin embargo necesitan determinar experimentalmente el número óptimo de PCR ciclos necesarios para la preparación de la biblioteca. Esto se hace impracticable cuando tratar con muy pequeñas cantidades de viable doble trenzado DNA (dsDNA), como algunos ejemplares de herbario producen sólo suficiente ADN para la preparación de una sola biblioteca. El método presentado aquí utiliza un número de ciclos independientemente de la calidad de la muestra, por lo que no hay ADN se pierde en los pasos de optimización biblioteca. En cambio, un paso de Reamplificación se invoca cuando las bibliotecas no cumplen con los montos mínimos necesarios para la secuencia. Muchas muestras de herbario son raras y poseen poco material, lo que hace difícil justificar muestreo destructivo en muchos casos. Para contrarrestar esto, el protocolo presentado permite dsDNA entrada tamaños menos de 1.25 ng en el proceso de preparación de la biblioteca, ampliando el alcance de las muestras viables de alto rendimiento de secuenciación y minimizando la necesidad de muestreo destructivo de muestras.
El siguiente protocolo ha sido optimizado para las hierbas y probado en cientos de diferentes especies de muestras de herbario, aunque esperamos que el protocolo se puede aplicar a muchos otros grupos de plantas. Incluye un paso de recuperación opcional que puede utilizarse para salvar a baja calidad o especímenes raros. Basado en más de 200 especímenes de herbario probados, este protocolo trabaja en especímenes con entrada baja de tejido y calidad, lo que permite la preservación de especímenes raros a través de un mínimo muestreo destructivo. Aquí se demuestra que este protocolo puede proporcionar bibliotecas de alta calidad que pueden ser secuenciadas para proyectos basados en la filogenómica.

<table><tbody><tr><td>Termociclador Veriti</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 pozo&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de imagen en gel</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Series</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Baño seco digital</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td></td></tr><tr><td>sistema de electroforesis</td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (Agua ultrapura)</td><td>ELGA&nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>Tubo LoBind de ADN&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Mortero</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td> mortero de <td>porcelana</td></tr><tr><td></td><td>fisher Scientific</td><td>S02595</td> tubos de centrífuga <td>de porcelana</td></tr><tr><td></td><td>fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Tubos de ensayo</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Tubo de tira y tapa para PCR</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorímetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Balanza</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido Almacenamiento</td> <td>a corto plazoNalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de anillo magnético&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 pozo&nbsp;</td></tr><tr><td>baño de agua</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>agitadores de placa calefactora</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>nitrógeno líquido</td><td>Airgas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 x tampón TE</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasa A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml solución</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>bio WORLD 705744</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isoamílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio Trihidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarosa</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS Escalera de ADN</td> Gold <td>Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Sal Disódica</td><td>IBI Scientific IB70182</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>tinte de carga de gel ultra puro púrpura (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit para Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S Juego de</td><td>cebadores de doble índice 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>Solución de fenol</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Arena de sílice</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Imprimaciones de reamplificación</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>ver texto</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>Códigos genéticos</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

robusto de adn y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbarios son una fuente valiosa de material vegetal que se puede utilizar en una variedad de estudios biológicos. El uso de especímenes de herbario está asociado con un número de desafíos, incluyendo calidad de preservación de la muestra ADN degradado y muestreo destructivo de especímenes raros. Para utilizar más eficazmente material de herbario en proyectos grandes de la secuencia, es necesario un método confiable y escalable de ADN aislamiento y biblioteca de preparación. Este documento muestra un protocolo robusto, de principio a fin para ADN aislamiento y alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario que requieren modificación para muestras individuales. Este protocolo se adapta para baja calidad secado planta material y toma ventaja de los métodos existentes mediante la optimización de tejido pulido, modificar la selección de tamaño de la biblioteca y presentando un paso de Reamplificación opcionales para las bibliotecas de bajo rendimiento. Reamplificación de bibliotecas de ADN de bajo rendimiento puede rescatar muestras derivadas de especímenes de herbario insustituible y potencialmente valiosa, negando la necesidad de muestreo destructivo adicional y sin introducir sesgo de secuencia perceptible común aplicaciones filogenéticas. El protocolo ha sido probado en cientos de especies de gramíneas, pero se espera que sea adaptable para el uso en otros linajes de la planta después de la verificación. Este protocolo puede ser limitada por ADN muy degradado, donde fragmentos no existen en la gama del tamaño deseado, y por metabolitos secundarios presentes en un material de planta que inhiben el aislamiento de ADN limpio. En general, este protocolo presenta un método rápido y completo que permite la extracción de ADN y preparación de la biblioteca de 24 muestras en menos de 13 horas, con solo 8 h de tiempo práctica activa con modificaciones mínimas.

Aislamiento de ADN y rendimiento Final de la biblioteca En este estudio, se demostró la eficacia del protocolo para el aislamiento de la DNA del herbario y la recuperación de las bibliotecas de la secuencia de alta calidad con cincuenta muestras diferentes la más antigua de 1920 y el más joven de 2012 (tabla 2). Para cada muestra, se utilizó aproximadamente 10 mg de tejido foliar para el aislamiento de ADN. Tejido foliar más verde se vio favorecido si ...

Este artículo muestra un protocolo detallado para el aislamiento de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de material de herbario incluyendo rescate del ADN de muy mala calidad.

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

El objetivo general de este protocolo es aumentar la cantidad de ADN bicatenario aislado y las posteriores bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento a partir de especímenes de herbario, maximizando su utilidad en estudios filogenómicos. Este método libera el potencial de especímenes de herbario que, de otro modo, no serían útiles para proyectos de secuenciación como secuencias genómicas debido a la extensa degradación de la muestra. La principal ventaja de esta técnica es que es lo suficientemente robusta como para que se puedan utilizar especímenes de herbario raros e históricamente significativos sin necesidad de un muestreo destructivo extenso.Esta técnica amplía la profundidad del muestreo de taxones en proyectos sistemáticos espaciados. La adquisición de especies es un paso limitante, pero con este protocolo, las colecciones históricas se pueden utilizar fácilmente en estos estudios. Agregue nitrógeno líquido y de 30 a 50 miligramos de arena esterilizada para moler un centímetro cuadrado de tejido de herbario preseleccionado hasta convertirlo en polvo fino en mortero preenfriado.La molienda adecuada es esencial para el éxito del aislamiento del ADN. Y se debe tener cuid

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

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Genética

El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

Este manuscrito describe un enfoque automatizado de selección del tamaño del gel para purificar fragmentos de ADN para la secuenciación de próxima generación. La tecnología Ranger proporciona una automatización completa de todo el proceso de carga de gel de agarosa, análisis electroforético y recuperación de fragmentos de ADN específicos, lo que permite bibliotecas de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento y alta calidad.

Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

Se describe un método eficiente y robusta, y rentable para la extracción de ácido nucleico a partir de hisopos para la caracterización de las comunidades bacterianas utilizando 16S rRNA secuenciación de genes de amplificación. El método permite un enfoque de procesamiento común para múltiples tipos de muestras y acomoda un número de procesos de análisis de aguas abajo.

Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

Se presentan la comparación y optimización de dos métodos de enriquecimiento de ADN organelar de plantas: centrifugación diferencial tradicional y fraccionamiento del gDNA total basado en el estado de metilación. Evaluamos la cantidad y calidad de ADN resultante, demostramos el rendimiento en secuenciación de próxima generación de lectura corta y discutimos el potencial de uso en la secuenciación de una molécula de larga lectura.

Optimización y Análisis Comparativo de Métodos de Enriquecimiento de ADN de Organelos Vegetales Adecuados para Secuenciación de Próxima Generación

Gel-seq permite a los investigadores a preparar simultáneamente las bibliotecas de ambos ADN - y RNA-seq en el insignificante costo adicional a partir de 100-1000 células usando un dispositivo simple de hidrogel. Este artículo presenta un enfoque detallado para la fabricación del dispositivo así como el protocolo biológico para generar bibliotecas emparejadas.

Gel-seq: Un método para la preparación de biblioteca simultánea de secuenciación de DNA y RNA utilizando Matrices de hidrogel

Contaminación durante la secuenciación de organismos microscópicos sigue siendo un gran problema. A continuación, os mostramos un método para secuenciar el genoma de un tardígrado de una sola muestra con tan poco como 50 pg de ADN genómico sin amplificación del genoma entero para minimizar el riesgo de contaminación.

Ultra bajo entrada genoma secuencia biblioteca elaboración de un solo espécimen Tardigrade

Secuencias de largo leer facilitan enormemente el montaje de genomas complejos y la caracterización de la variación estructural. Se describe un método para generar secuencias muy largas por plataformas de secuenciación basada en nanopore. El enfoque adopta una extracción de ADN optimizada seguida por las preparaciones de la biblioteca modificada para generar cientos de kilobases Lee con una cobertura moderada de células humanas.

Muy largo leer la secuencia para el análisis de la DNA de Genomic entero

Este protocolo detalla un enfoque integral para el cultivo, la secuenciación y el ensamblaje del genoma híbrido de novo de las bacterias urinarias. Proporciona un procedimiento reproducible para la generación de secuencias completas y circulares del genoma útiles en el estudio de elementos genéticos cromosómicos y extracromosómicos que contribuyen a la colonización urinaria, la patogénesis y la diseminación de la resistencia a los antimicrobianos.

Ensamblaje híbrido del genoma de novo para la generación de genomas completos de bacterias urinarias utilizando tecnologías de secuenciación de lectura corta y larga

La viabilidad y efectividad de los métodos scRNA-seq de alto rendimiento anuncian una era unicelular en la investigación de plantas. Aquí se presenta un procedimiento robusto y completo para aislar tipos específicos de células de raíz de Arabidopsis thaliana y la posterior construcción y análisis de la biblioteca del transcriptoma.

Análisis de aislamiento y transcriptoma de tipos de células vegetales

El presente artículo tiene como objetivo proporcionar protocolos detallados y adecuados para el aislamiento de hongos endófitos asociados a plantas, la preservación a largo plazo de aislados, la caracterización morfológica y la extracción de ADN total para su posterior identificación molecular y análisis metagenómicos.

Aislamiento, caracterización y extracción de ADN total para identificar hongos endófitos en plantas micoheterótrofas

El presente protocolo describe el uso de la tecnología de códigos de barras de ADN para autenticar materiales medicinales de origen vegetal y la planta medicinal Angelica sinensis (Oliv.) Diels fue identificado como un ejemplo.

Aplicación de códigos de barras de ADN para identificar plantas medicinales

Aprende a construir bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento a partir de especímenes de herbario degradados. Este protocolo robusto maximiza el aislamiento de ADN para estudios filogenómicos sin muestreo destructivo extenso.

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

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