Name: Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende a extraer lipoproteínas bacterianas mediante partición con surfactante no iónico y preparar lipopéptidos N-terminal para análisis estructural por espectrometría de masas MALDI-TOF.

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Investigación en el laboratorio de Meredith fue apoyada por fondos de arranque proporcionados por la Facultad de Ciencias de Eberly (Pennsylvania State University). Agradecemos a Dr. Tatiana Laremore para asesoramiento técnico y el acceso al equipo en la proteómica de estado de Penn e instalaciones de centrales de espectrometría de masa, University Park, PA, donde se realizaron análisis de espectrometría de masa.

1. crecimiento y lisis de la célula
<ol><li>Crecen bacterias en 15 mL de caldo de soja tríptica (TSB) o multimedia similar a última fase exponencial (OD600 , de 1.0-1.5). Cosecha de las células por centrifugación, lavar una vez con tampón Tris salino/EDTA (TBSE) y continuar con el protocolo o congelar hasta su uso. Nota: TBSE: 20 mM Tris-clorhidrato (HCl), pH 8.0, 130 mM cloruro de sodio (NaCl) y 5 mM el ácido etilendiaminotetracético (EDTA)). Modificación y expresión de la lipoproteína pueden ser influenciados por las condiciones de crecimiento (por ejemplo, acidez, salinidad, medios de cultivo) y de la fase de crecimiento15. Crecimiento de la célula puede escalarse como deseado y 15 mL de células se recomienda para una sola preparación de lipoproteínas como biomasa exceso puede disminuir la producción de lipoproteína. Uno de 15 mL preparación generalmente produce suficiente muestra para la óptima carga de ~ 2-4 carriles en gel de SDS-PAGE mini estándar.</li>
	<li>Resuspender las células en 800 μL TBSE con 1 mM phenylmethyl sulfonil fluoruro (PMSF) y lisozima de 0.5 mg/mL. Transferir la solución a un tubo de microcentrífuga roscada 2,0 mL con tapón de rosca y junta tórica e incubar por 20 min a 37 ° C. Nota: Algunas especies no son susceptibles a la lisis por la lisozima. Una enzima lítica apropiada debe sustituirse para ayudar en la lisis.</li>
	<li>Añadir cuentas de zirconia/sílice de 0,1 mm de ~ 800 μL al tubo y romper células agitando a máxima velocidad (7.000 rpm) en un homogenizador durante 5 ciclos de 30 s cada uno, con 2 minutos reposar en hielo entre cada ciclo.</li>
	<li>Muestra de centrífuga a 3000 x g durante 5 min a 4 ° C (para que sedimenten los granos y las células intactas). Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de 2.0 mL y conservar en hielo.</li>
	<li>Añada 200 μL TBSE al sedimento restante y volver al homogeneizador para un ciclo adicional. Centrífuga (como arriba) y combinar el sobrenadante con el sobrenadante anterior (debe ser 800-1000 μL volumen total).</li>
</ol>2. enriquecimiento de lipoproteínas por partición de fase de TX-114
<ol><li>Complementar el sobrenadante con TX-114 surfactante a una concentración final de 2% (vol/vol) mediante la adición de un volumen igual del 4% (vol/vol) el surfactante en TBSE helada e incubar en hielo durante 1 hora, mezclar por inversión cada ~ 15 minutos. Nota: Frío, el sobrenadante y surfactante será miscibles.</li>
	<li>Transferir el tubo a un baño de agua de 37 ° C e incubar por 10 min inducir la separación de fases. Centrifugar la muestra a 10.000 x g por 10 min a temperatura ambiente para mantener la separación bifásico.</li>
	<li>Suavemente la pipeta de la fase acuosa superior y deseche. Añadir TBSE helada a la fase inferior de surfactante para rellenar el tubo a su volumen e invertir para mezclar. Incubar en hielo durante 10 minutos.</li>
	<li>Transferir el tubo a un baño de agua de 37 ° C e incubar por 10 min inducir la separación de fases, luego centrifugar a 10.000 x g por 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita los pasos 2.3-2.4 una vez más para un total de 3 separaciones. Retirar la fase acuosa superior y desechar.</li>
	<li>Retire el pellet de proteínas precipitadas que formó durante el curso de extracciones (visibles en la parte inferior del tubo), mediante la adición de 1 volumen de TBSE helada a la fase de surfactante. Centrifugar a 4 ° C a 16.000 x g durante 2 min a proteína insoluble de la pelotilla. Nota: La muestra debe permanecer una sola fase. Si se produce la separación de la fase, volver a enfriar la muestra y centrifugar nuevamente. El pellet está generalmente compuesto de lipoproteínas no contaminantes, pero puede ser retenido para su posterior análisis.</li>
	<li>Inmediatamente transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL fresco que contiene 1250 μL de acetona al 100%. Pipetee hacia arriba y hacia abajo completamente para lavar la muestra de la punta ya que es viscosa. Mezclar por inversión e incubar durante la noche a-20 ° C para precipitar proteínas.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 16.000 x g por 20 min a temperatura ambiente para que sedimenten las lipoproteínas con atención a la orientación del tubo. Las lipoproteínas forman una película delgada y blanca a lo largo de la pared exterior del tubo.</li>
	<li>Lavar el pellet dos veces con acetona al 100%. Decantar la acetona y deje secar la muestra al aire.</li>
	<li>Añadir 20-40 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 o un estándar muestra Laemmli SDS-PAGE buffer16 y resuspender completamente mediante pipeteo arriba y abajo contra la pared con las lipoproteínas precipitadas. Raspar el lado del tubo con la punta de la pipeta para desalojar a las lipoproteínas. Nota: Las lipoproteínas no se disolverán en tampón Tris, pero más bien forman una suspensión.<ol>
<li>Almacenar las lipoproteínas a-20 ° C hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SDS-PAGE, Electroblotting y tinción con Ponceau S
<ol><li>Lipoproteínas separadas por SDS-PAGE utilizando métodos estándar de16. Nota: El porcentaje de acrilamida del gel adecuado variará dependiendo de su uso y tamaño de las lipoproteínas. Aquí, las lipoproteínas de E. faecalis fueron separadas sobre un 10% gel Tris glicina, mientras que un gel Tris-Tricina de 16.5% fue utilizado para la lipoproteína más pequeños de e. coli Lpp17.</li>
	<li>Las lipoproteínas de transferencia a una membrana de nitrocelulosa transferencia usando un procedimiento estándar de electroblotting. Nota: Una transferencia semiseco utilizando Bjerrum Nielsen Schafer buffer más 0,1% de SDS se realizó a 25 V, 1.3 mA por 15 min18. Alternativamente, membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno podría utilizarse, sin embargo es más hidrofóbica que la nitrocelulosa, puede reducir eficiente elución de lipopéptidos hidrofóbico de la membrana en pasos posteriores.</li>
	<li>Transferir la membrana de nitrocelulosa a un recipiente y cubrir con solución de Ponceau S (0,2% (peso/volumen) Ponceau S en ácido acético al 5%). Rock suavemente durante 5 minutos o hasta que el rojo-rosa bandas son visibles.</li>
	<li>Retirar la solución de Ponceau S y enjuague cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa con dH2O para quitar exceso de la mancha. Nota: Vendas manchadas de Ponceau se desmanchar rápidamente. Si bandas desaparecen, repita el proceso de tinción.</li>
	<li>Con una cuchilla de afeitar limpia, suprimir la banda deseada y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga. Lavar tres veces con 1 mL de dH2O a desteñir totalmente la banda. Nota: El protocolo se puede detener aquí. Tienda la sección suprimida cubiertos de agua a-20 ° C hasta su uso.</li>
	<li>La sección de transferencia a una superficie limpia y con una cuchilla de afeitar limpia, dados la tira de nitrocelulosa en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm x 1 mm. recoger los pedazos en un tubo de microcentrífuga de 0.5-mL baja proteína vinculante.</li>
	<li>Lave las piezas dos veces con 0,5 mL recién preparado de 50 mM de bicarbonato de amonio (NH4HCO3), pH 7.8 en agua de grado cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).</li>
</ol>4. tríptica digestión, extracción de bacterias de una membrana de nitrocelulosa, deposición en MALDI destino y adquisición de datos
<ol><li>Resuspender pedazos de nitrocelulosa en 20 μL de solución 20 μg/mL de tripsina en 50 mM NH4HCO3, pH 7.8 en agua de calidad HPLC. Vortex para mezclar, luego girar brevemente para asegurar que todas las piezas están completamente cubiertas por la solución de tripsina. Cubra la tapa del tubo usando la película de parafina para evitar la evaporación e incubar digest durante la noche a 37 ° C.</li>
	<li>Hacer girar la muestra a 16.000 x g por 30 s y quitar el líquido mediante pipeteo. Nota: Esto elimina tripsinizaron péptidos hidrofílicos que pueden ser examinados más tarde por MS de MALDI-TOF para identificación de proteínas.</li>
	<li>Añadir 50 μL de 0.5% de ácido trifluoroacético (TFA) en agua de calidad HPLC. Vortex para mezclar, luego gire la muestra brevemente para asegurar que todas las piezas están cubiertas por la solución. Incubar 10 min a temperatura ambiente. Retire el líquido mediante pipeteo. PRECAUCIÓN: TFA es dañino si se inhala. Manejar con precaución y use la campana para vapores químicos. Evite el contacto con la piel.</li>
	<li>Repita el paso 4.3 con 50 μL de 10% de acetonitrilo en agua de calidad HPLC. PRECAUCIÓN: Acetonitrilo es dañino si se inhala. Manejar con precaución y use la campana para vapores químicos. Evite el contacto con la piel.</li>
	<li>Repita el paso 4.3 con 50 μL de acetonitrilo 20% en agua de calidad HPLC. Nota: Esto elimina cualquier péptidos moderadamente hidrófobos ligadas a la nitrocelulosa.</li>
	<li>Para eluir los lipopéptidos estrechamente enlazado, añadir 15 μL de 10 mg/mL recién hecho α-ciano-4-hidroxicinámico ácido (CHCA) matriz disuelto en Cloroformo-metanol (2:1, v/v) e incube durante 10 min a temperatura ambiente con un vórtex intermitente.<ol>
<li>Alternativamente, añadir 15 μL Cloroformo-metanol para eluir lipopéptidos y mezclar con la matriz en un momento posterior. Otras matrices, tales como el ácido 2, 5-dihydroxybenzoic (DHB), deben ser probados como alternativas a la CHCA si se obtienen resultados satisfactorios para una composición particular de bacterias. PRECAUCIÓN: Cloroformo y metanol son dañinos si se inhalan. Manejar con precaución y use la campana para vapores químicos. Evite el contacto con la piel.</li>
		<li>
Opcional: Promover sodio formación de aducción, complementar la solución de CHCA en Cloroformo-metanol con acuoso bicarbonato de sodio (NaHCO3) a una concentración final de 1 mM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hacer girar la muestra brevemente. Con una pipeta, transferir cuidadosamente el líquido a un nuevo tubo de microcentrífuga baja proteína vinculante. Esta solución contiene la mayor parte de los lipopéptidos de N-terminal. Nota: La nitrocelulosa puede disolver total o parcialmente en la solución de Cloroformo-metanol. Esto no afectarán negativamente los resultados de la MS y puede utilizarse como un método alternativo para aumentar el retorno de bacterias. Membrana PVDF no se disolverá en la misma forma.</li>
	<li>Depositar 1 μL de los lipopéptidos eluídas con CHCA en un objetivo MALDI acero pulido. Nota: El Cloroformo-metanol se evaporará rápidamente, dejando atrás el cristalizadas CHCA y lipopéptidos. Una opcional segunda 1 μL alícuota puede ser depositado en el mismo lugar para aumentar la concentración de la muestra. Cloroformo-metanol puede extenderse significativamente después de la deposición sobre el objetivo y como tal, debe tener cuidado para evitar muestra de mezcla en el destino. Se recomienda depositar y disparar múltiples puntos de cada muestra.</li>
	<li>Inmediatamente proceder a espectrometría de masas. Analizar todas las áreas del punto para señal de bacterias, especialmente si el terreno contiene dos capas de la muestra, como la segunda capa puede empujar los lipopéptidos al borde exterior de la mancha. Nota: Intensidad de láser inicial recomendada es 25%, aunque puede ser necesario aumentar la intensidad para adquirir señal y suma múltiples espectros (exploraciones de 20 o más) para lograr adecuada relación señal a ruido. Aquí, los espectros fueron adquiridos en un instrumento de MALDI-TOF-TOF (véase la Tabla de materiales) utilizando un método de instrumento configurado de fábrica para la detección de iones positivos del reflector en el rango de m/z de 700-3500. El instrumento fue calibrado con una mezcla de péptidos trípticos de albúmina de suero bovino (BSA).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo en el presente documento describe dos etapas distintas de la caracterización de la lipoproteína: determinación estructural y particionada por MALDI-TOF MS de la fase de enriquecimiento por TX-114. Durante TX-114 extracción, centrifugación adicional elimina proteínas contaminantes que precipitan durante este proceso, seguido por la precipitación de acetona para producir lipoproteínas muy enriquecidas. Limitando la magnitud de cada preparación valor 15 mL de las células, varias muestras pueden ser fácilmente p...

Las lipoproteínas bacterianas se caracterizan por una conservada N-terminal modificada en lípidos cisteína que ancla el dominio globular de la proteína a la superficie de la membrana de la célula. Están distribuidos universalmente en las bacterias, constituyendo el 2 y el 5% de todos los genes celulares dentro de un genoma típico1. Las lipoproteínas juegan un papel crítico en una amplia variedad de procesos celulares, incluyendo la absorción de los nutrientes, transducción de señales, montaje de complejos de proteínas y en el mantenimiento de la célula envolvente integridad estructural2. En bacterias patógenas, las lipoproteínas sirven como factores de virulencia3,4. Durante una infección, reconocimiento de lipopéptidos N-terminal por Toll-like receptor (TLR) 2 genera una respuesta inmune innata para eliminar patógenos invasores. Dependiendo del estado de acilación del N-terminal, las lipoproteínas son reconocidas generalmente por alternativos complejos heterodiméricos de TLR2. TLR1 TLR2 reconoce N-acilados lipopéptidos, mientras que TLR2-TLR6 ATA gratis Lipopéptido termini α-amino. Una vez enlazado, convergen las vías de señalización para inducir la secreción de proinflammatory cytokines3,4.
Se pensaba que las lipoproteínas de bacterias Gram-positivas eran diacylated y los de bacterias Gram-negativas triacylated, difiriendo en la ausencia o presencia de un ácido graso amida vinculados a los residuos conservados de cisteína N-terminal. Esta hipótesis fue apoyada por la falta de secuencia ortólogos en Gram-positivas genomas a Lnt, la Gram negativos N-acil transferasa que forma de lipoproteínas triacylated5. Sin embargo, estudios recientes han revelado triacylation lipoproteína en Gram-positivas Firmicutes falta lnt, así como tres nuevos N-terminal lipoproteína estructuras, denominadas la peptidil lyso y N -acetil formas6,7 ,8. Estos resultados plantean cuestiones sobre formas posible lipoproteína con todo descubierto, junto a preguntas fundamentales acerca de cómo se hacen estas lipoproteínas novela y qué propósito fisiológico o ventaja imparten las distintas formas. Además, claramente demuestran la incapacidad actual de la genómica para predecir la estructura de la lipoproteína. De hecho, recientemente se identificaron una nueva clase de transferasas de N-acil de lipoproteína, llamado Lit, de Enterococcus faecalis y Bacillus cereus que hace forma de lyso lipoproteínas9. Esto indica la necesidad de verificar experimentalmente la estructura de la lipoproteína, que puede ser difícil debido a su naturaleza extremadamente hidrofóbica y métodos limitados disponibles para caracterizar su estructura molecular.
Para facilitar los estudios sobre la inducción de la lipoproteína de la inmunorespuesta del anfitrión, así como la determinación estructural del N-terminal, hemos adaptado varios protocolos descritos previamente para purificar las lipoproteínas bacterianas y preparar el caso del N-terminal lipopéptidos para análisis por MALDI-TOF MS6,10,11,12. Las lipoproteínas están enriquecidas con una fase de X-114 de Tritón (en adelante denominado surfactante o TX-114) establecida repartir método, con optimización para eliminar contaminantes no-lipoproteínas y aumentar la producción de lipoproteína. Estas lipoproteínas son aptos para su uso directo en los ensayos de TLR o para su posterior purificación por SDS-PAGE. MALDI-TOF MS, transferencia de lipoproteínas de las membrana de nitrocelulosa proporciona un andamio para eficiente en situ la digestión de la tripsina, lavado y elución posterior de la superficie de la membrana, resultando altamente purificada lipopéptidos N-terminal. Nitrocelulosa se ha demostrado para facilitar el manejo de la muestra y mejorar la cobertura de la secuencia de péptidos altamente hidrofóbicos de las proteínas de membrana integral13,14, así como las lipoproteínas9,10 . El método tiene la ventaja adicional de fraccionamiento péptidos basados en polaridad, para que soluciones de lavado intermedio pueden ser analizadas para identificación de proteínas de alta confianza simultáneamente con determinación estructural N-terminal en un solo experimento . Presente Protocolo únicamente sodio intencional características aducción formación para promover la fragmentación de iones de padre hacia los iones dehydroalanyl en MS/MS, ayudar en la asignación estructural de estado N- acilación. N-terminal es la característica más variable y clave relacionados con el reconocimiento TLR de las lipoproteínas. Tomados en conjunto, este protocolo ha permitido estudios intensivos y reproducibles en las lipoproteínas, de las fases individuales de la purificación y determinación estructural por MALDI-TOF MS fácilmente adaptada dependiendo del objetivo del experimento.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,01 mm Perlas de circonio/sílice</td><td>Productos BioSpec</td><td>110791012</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>EMD</td><td>AX0116-6</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>EMD</td><td>AX0142-6</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Fluka Analítico</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace NT Nitrocelulosa</td><td>PALL Life Sciences</td><td>66485</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA) patrón de digestión</td><td>Protea</td><td>PS-204-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Acros Organics</td><td>423550025</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado HPLC</td><td>EMD</td><td>WX0008-1</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP535-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Pierce tripsina proteasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>90057</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Acros Organics</td><td>161470100</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubo 0.5mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792519</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tris (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-114</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93422</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico (TSB)</td><td>BD</td><td>211822</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-ácido ciano-4-hidroxicinámico (grado MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNALyser</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF objetivo</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Equipado con un láser Nd:YAG smartbeam-II con triple frecuencia de 355 nm</td></tr></tbody></table>

enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos n-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Las lipoproteínas son importantes componentes de la envoltura celular bacteriana y potentes activadores de la respuesta inmunitaria innata mamífera. A pesar de su importancia para la fisiología celular e Inmunología, queda mucho por descubrir el efecto de las distintas formas sobre la inmunidad del anfitrión, cómo se sintetizan y lipoproteína novedosas formas. Para permitir estudios cuidadosos en las lipoproteínas, este protocolo describe un método para el enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos tríptico N-terminal para la determinación estructural por láser de matriz asistida por desorción de ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS). Expansión en una fase de Tritón X-114 establecida repartir método para la extracción de la lipoproteína y enriquecimiento de la membrana celular bacteriana, el protocolo incluye medidas adicionales para eliminar contaminantes no-lipoproteína, aumentar la producción de lipoproteínas y pureza. Puesto que las lipoproteínas son comúnmente utilizadas en ensayos de Toll-like receptor (TLR), es fundamental primero caracterizar la estructura del N-terminal por MALDI-TOF MS. adjunto, se presenta un método para aislar péptidos hidrofóbicos concentrados enriquecidos en N-terminal lipopéptidos de directo análisis por MALDI-TOF MS/MS. lipoproteínas que se han separado por electroforesis en Gel poli-acrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) se transfieren a una membrana de nitrocelulosa, digerido en situ con tripsina, secuencialmente se lava para quitar polar péptidos trípticos y finalmente se eluyeron con Cloroformo-metanol. Cuando se combina con MS de los péptidos más polares de trypsinized de soluciones de lavado, este método proporciona la capacidad para identificar la lipoproteína y caracterizar su N-terminal en un solo experimento. Sodio intencional aducción formación también puede ser empleado como una herramienta para promover más espectros de fragmentación estructural informativo. En última instancia, el enriquecimiento de lipoproteínas y determinación de sus estructuras del N-terminal permitirá estudios más extensos en esta clase ubicua de proteínas bacterianas.

Un esquema del Protocolo se proporciona en la figura 1. La fracción enriquecida de lipoproteína extraída de Enterococcus faecalis ATCC 19433 por TX-114 se muestra en la figura 2. Para la comparación, también se muestra el patrón de bandas de la fracción de proteína precipitada. Las proteínas de esta fracción fueron confirmadas por MALDI-MS a ser altamente abundantes proteínas distintas lipoproteínas (tabla 1</str...

El enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas con una fase de tensioactivo no iónico, método de partición se describe para su uso directo en los ensayos de TLR u otras aplicaciones. Otras medidas se detallan para preparar N-terminal tríptico lipopéptidos caracterización estructural por espectrometría de masas.

Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

El objetivo general de este procedimiento es extraer lipoproteínas de células bacterianas para aplicaciones directas y preparar lipopéptidos N-terminales para el análisis estructural mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, ya que la estructura N-terminal de las lipoproteínas influye en el reconocimiento y la señalización del receptor tipo Toll, lo que repercute en la respuesta inmunitaria del huésped. La ventaja única de esta técnica es la formación opcional pero intencional de aductos de sodio, lo que promueve la fragmentación hacia el ion dehidroalanilo de diagnóstico, lo que ayuda en la asignación estructural del estado de acilación de la lipoproteína.Cultive bacterias en 15 mililitros de caldo de soja tríptico o medios ricos similares hasta la fase exponencial tardía. Recoja las células por centrifugación antes de lavarlas una vez con solución salina tamponada con Tris, EDTA o TBSE. resuspender las células en 800 microlitros de TBSE con un milimolar de PMSF y 0,5 miligramos por mililitro de lisozima.Transfiera la solución a un tubo de microcentrífuga roscado de 2.0 mililitros con tapón de ro

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminales para la determinación estructural por espectrometría de masas. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra el enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas utilizando un detergente no iónico que se somete a separación de fases al calentarse. A través de cambios secuenciales de temperatura y pasos de centrifugación, las lipoproteínas se dividen selectivamente en la fase...

Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas mediante separación de fases con detergente no iónico

Aislamiento y caracterización del dominio lípido A del lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram-negativas proporciona información sobre los mecanismos de la superficie celular a base de resistencia a los antibióticos, la supervivencia bacteriana y la forma física, y cómo químicamente diversa lípido A las especies moleculares modulan diferencialmente acogida la respuesta inmune innata.

Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

Muchas de las (fosfo)lipasas predichas están mal caracterizadas con respecto a sus especificidades de sustrato y funciones fisiológicas. Aquí proporcionamos un protocolo para optimizar las actividades enzimáticas, buscar sustratos naturales y proponer funciones fisiológicas para estas enzimas.

La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Este método proporciona un marco para el estudio de la incorporación de ácidos grasos exógenos de fuentes huésped complejas en membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para lograrlo, se describen los protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas a partir de la yema de huevo de pollo y el posterior perfilado de ácidos grasos de fosfolípidos bacterianos utilizando espectrometría de masas.

Aislamiento de partículas de lipoproteínas de yema de huevo de pollo para el estudio de la incorporación de ácidos grasos patógenos bacterianos en fosfolípidos de membrana

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Este protocolo cubre un análisis detallado de la composición de peptidoglicanos utilizando espectrometría de masas de cromatografía líquida junto con extracción avanzada de características y software de análisis bioinformático.

Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Este protocolo describe un método eficiente libre de células para la producción de proteoliposoma de alta calidad por el método de diálisis bicapa utilizando un sistema libre de células de trigo y liposomas. Este método proporciona medios adecuados para el análisis funcional de proteínas de membrana, detección de objetivos farmacológicos y desarrollo de anticuerpos.

Producción libre de células de proteoliposomas para análisis funcional y desarrollo de anticuerpos dirigidos a proteínas de membrana

La lipidómica basada en espectrometría de masas de escopeta ofrece una instantánea cuantitativa sensible de un amplio espectro de clases de lípidos simultáneamente en una sola medición de varios tejidos de roedores.

Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

Aprende a extraer lipoproteínas bacterianas mediante partición con surfactante no iónico y preparar lipopéptidos N-terminal para análisis estructural por espectrometría de masas MALDI-TOF.

Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal

Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas

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