Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas

El objetivo general de este procedimiento es extraer lipoproteínas de células bacterianas para aplicaciones directas y preparar lipopéptidos N-terminales para el análisis estructural mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, ya que la estructura N-terminal de las lipoproteínas influye en el reconocimiento y la señalización del receptor tipo Toll, lo que repercute en la respuesta inmunitaria del huésped. La ventaja única de esta técnica es la formación opcional pero intencional de aductos de sodio, lo que promueve la fragmentación hacia el ion dehidroalanilo de diagnóstico, lo que ayuda en la asignación estructural del estado de acilación de la lipoproteína.

Cultive bacterias en 15 mililitros de caldo de soja tríptico o medios ricos similares hasta la fase exponencial tardía. Recoja las células por centrifugación antes de lavarlas una vez con solución salina tamponada con Tris, EDTA o TBSE. resuspender las células en 800 microlitros de TBSE con un milimolar de PMSF y 0,5 miligramos por mililitro de lisozima.

Transfiera la solución a un tubo de microcentrífuga roscado de 2.0 mililitros con tapón de rosca y junta tórica antes de incubar durante 20 minutos a 37 grados Celsius. Agregue aproximadamente 800 microlitros de perlas de sílice de circonio de 0,1 milímetros al tubo, luego rompa las células agitándolas a máxima velocidad en un homogeneizador durante cinco ciclos de 30 segundos cada uno con un descanso de dos minutos en hielo entre cada ciclo. Centrifugar la muestra a 3.000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para obtener perlas de gránulos y células intactas.

Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2.0 mililitros, luego manténgalo en hielo. Agregue 200 microlitros de TBSE al pellet restante y regrese al homogeneizador para un ciclo adicional. Centrifugar como antes y combinar el sobrenadante con el sobrenadante anterior.

Complemente el sobrenadante con surfactante TX-114 hasta una concentración final del 2% agregando un volumen igual de surfactante al 4% en TBSE helado. Incubar el sobrenadante suplementado en hielo durante una hora, mezclando por inversión cada 15 minutos. Transfiera el tubo a un baño de agua a 37 grados centígrados e incube durante 10 minutos para inducir la separación de fases.

Centrifugar la muestra a 10.000 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente para mantener la separación bifásica. Pipetear suavemente la fase acuosa superior y desechar. Agregue TBSE helado a la fase inferior de surfactante para volver a llenar el tubo a su volumen original e inviértalo para mezclar.

Incubar en hielo durante 10 minutos. Después de la incubación, transfiera el tubo a un baño de agua a 37 grados centígrados e incube durante 10 minutos para inducir la separación de fases, luego centrifugue a 10.000 g de tiempo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de repetir estos pasos una vez más para un total de tres separaciones, retire la fase acuosa superior y deséchela.

Retire la bolita de proteínas precipitadas que se formaron durante el curso de las extracciones agregando un volumen de TBSE helado a la fase de tensioactivo. Centrifugar a cuatro grados centígrados y 16.000 veces g durante dos minutos para pellet la proteína insoluble. Transfiera inmediatamente el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo de 2,0 mililitros que contenga 1.250 microlitros de acetona al 100%.

Mezclar la muestra por inversión e incubar durante la noche a menos 20 grados centígrados para precipitar la proteína. Al día siguiente, centrifugar la muestra a 16.000 veces g durante 20 minutos a temperatura ambiente para granular las lipoproteínas prestando atención a la orientación del tubo. Lave el pellet dos veces con acetona al 100% antes de decantar la acetona y dejar que la muestra se seque al aire.

A continuación, añada de 20 a 40 microlitros de Tris-HCL de 10 milimolares, pH 8,0, y vuelva a suspender completamente el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo contra la pared con las lipoproteínas precipitadas. Separar las lipoproteínas por SDS-PAGE utilizando métodos estándar. Transfiera las lipoproteínas a una membrana de transferencia de nitrocelulosa utilizando un procedimiento estándar de electrotransferencia.

Transfiera la membrana de nitrocelulosa a un recipiente y cúbrala con la solución de Ponceau S. Mecete suavemente durante cinco minutos o hasta que se vean bandas de color rojo rosado. Vierta la solución de Ponceau S y enjuague cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa con agua destilada para eliminar el exceso de mancha.

Con una cuchilla de afeitar limpia, extraiga la banda deseada y transfiérala a un tubo de microcentrífuga. Lave la membrana tres veces con un mililitro de agua destilada para eliminar completamente la mancha. Después de transferir la sección a una superficie limpia, use una hoja de afeitar limpia para cortar la tira de nitrocelulosa en trozos pequeños de aproximadamente un milímetro por un milímetro.

Recoja las piezas en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 0,5 mililitros. Por último, lavar las piezas dos veces con 500 microlitros de bicarbonato amónico de 50 milimolares recién preparado, pH 7,8, en agua de grado HPLC. Resuspender los trozos de nitrocelulosa en 20 microlitros de una solución de 20 microgramos por mililitro de tripsina en bicarbonato de amonio de 50 milimolares.

Agitar las piezas de nitrocelulosa resuspendidas para mezclar. A continuación, gire el tubo brevemente para asegurarse de que todas las piezas están completamente cubiertas por la solución de tripsina. Cubra la tapa del tubo con una película de parafina para evitar la evaporación e incube el digesto durante la noche a 37 grados centígrados.

Centrifugar la muestra a 16.000 veces g durante 30 segundos y eliminar el líquido mediante pipeteo. A continuación, añada 50 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,5% en agua de grado HPLC. Después de agitar la muestra para mezclarla, centrifugar la muestra brevemente para asegurarse de que todas las piezas estén cubiertas por la solución e incubar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Después de la extracción del líquido por pipeteo, repita este paso con 50 microlitros de acetonitrilo al 10% y luego repita nuevamente con 50 microlitros de acetonitrilo al 20%. Para eluir los lipopéptidos fuertemente unidos, agregue 15 microlitros de matriz de CHCA de 10 miligramos por mililitro recién hecha disuelta en cloroformo-metanol. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente con vórtice intermitente.

Para promover la formación de aductos de sodio, complemente la solución de CHCA en cloroformo-metanol con bicarbonato de sodio acuoso hasta una concentración final de un milimolar. Después de girar la muestra brevemente, use una pipeta para transferir cuidadosamente el líquido a un nuevo tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas. Esta solución contendrá la mayor parte de los lipopéptidos N-terminales.

Deposite un microlitro de los lipopéptidos eluidos con CHCA en un objetivo MALDI de acero pulido. Proceda inmediatamente a la espectrometría de masas. Aquí se muestran ejemplos de espectros de masas de las soluciones de lavado de nitrocelulosa escalonadas de la lipoproteína PnrA de Enterococcus faecalis.

Con cada lavado posterior, se observan cambios en la intensidad de la señal y una disminución en los picos individuales, que culminan en el ion lipopéptido N-terminal altamente enriquecido en la fracción de elución final. El espectro MS/MS del ion lipopéptido padre revela que es el lisoformo, con iones fragmentados correspondientes al péptido tríptico PnrA N-terminal que presenta una cadena de acilo alfa-amino ligada y una estructura de monoacilglicerol. La adición de bicarbonato de sodio a la fracción lipopeptídica eluida de la lipoproteína Lpp de Escherichia coli da como resultado un aumento de 22 Dalton con respecto a la masa N-terminal calculada.

El análisis MS/MS del ion padre frente a su aducto de sodio demuestra una fragmentación preferencial hacia el ion dehidroalanilo del progenitor sodiado a través de la eliminación neutra de la fracción diaco-tiogliceridilo. Esto ayuda en la determinación estructural del estado de acilación N-terminal. Al llevar a cabo este procedimiento, vale la pena recordar que cada fracción de lavado de nitrocelulosa escalonada se puede analizar por espectrometría de masas, lo que permite tanto la identificación de proteínas como la caracterización N-terminal del lipopéptido en un solo experimento.

Después de la extracción de lipoproteínas de las bacterias, se pueden realizar otros experimentos, como los ensayos basados en células que miden la señalización del receptor tipo Toll, para responder a preguntas adicionales, como cómo el estado de acilación de las lipoproteínas influye en la respuesta inmunitaria del huésped.