Mapeo metabólico: Citoquímica enzimática cuantitativa y la histoquímica para determinar la actividad de Deshidrogenasas en células y tejidos
26 de mayo de 2018
Aquí, presentamos un protocolo que puede utilizarse para visualizar microscópicamente y cuantificar la actividad de Deshidrogenasas en las células y tejidos y su cinética, función y localización subcelular.
Este video muestra cómo realizar un mapeo metabólico. Procedimiento para cuantificar la actividad de enzimas específicas llamadas deshidrogenasas. Las células se adhieren a un portaobjetos de microscopía o a un tejido congelado.
Hace décadas desarrollamos toda una serie de técnicas de mapeo metabólico, entonces llamadas enzimistoquímica, para detectar la actividad en tejidos y células bajo el microscopio. Sin embargo, el metabolismo quedó obsoleto durante la revolución genética de finales del siglo pasado. Pero ahora, el metabolismo vuelve a estar caliente.
Fíjate, por ejemplo, en las células cancerosas. El metabolismo se considera ahora un objetivo terapéutico y, por lo tanto, las determinaciones de actividad en células y tejidos vuelven a estar de moda. Un componente clave del tampón de reacción es el alcohol polivinílico o PVA.
Este se disuelve en un tampón de fosfato a una concentración del 18%El PVA es polvoriento y tóxico cuando se inhala, así que asegúrese de pesar el PVA bajo una campana extractora. Debido a la alta concentración de PVA en el tampón de fosfato, caliente la botella del tampón de reacción al baño maría mientras revuelve. Asegúrese de enroscar la tapa sin apretar en la botella o la botella puede explotar.
Pueden pasar hasta 15 minutos antes de que el PVA se disuelva por completo en el tampón de fosfato. Si es así, la solución debe ser transparente con pequeñas burbujas de aire causadas por la agitación. La solución viscosa de PVA se puede pipetear en tubos tampón de reacción utilizando una pipeta ancha.
Mantenga los tubos al menos a 40 grados centígrados o más para evitar que el PVA se solidifique. Un mililitro de solución de PVA es bueno para unos cuatro citospins, o dos preparaciones de tejido. Para los demás componentes del tampón de reacción, el cloruro de tetrazolio nitroblue amarillo, también llamado nitroBT, se disuelve en una mezcla de etanol y dimetilformamida, mientras se calienta en un vial de vidrio en el quemador Bunsen.
La solución no debe hervir o el volumen disminuirá demasiado. Por lo tanto, no deje el vial demasiado tiempo en la llama y agite regularmente. Manténgalo en hielo después de disolverse y proceda al siguiente paso rápidamente, ya que el nitroBT disuelto perece rápidamente.
NitroBT es un polvo amarillo que se encuentra en el fondo del vial de vidrio que contiene etanol y DMF cuando no se mantiene disuelto. Puede comprobar cada pocas veces si el nitroBT está disuelto. La solución será entonces de color amarillo transparente.
Cuando se disuelve, el nitroBT se puede pipetear en los viales que contienen la solución de PVA. Revuelva suavemente con una cuchara fina o una espátula fina para mezclar el nitroBT y el tampón. Haga esto para todos los componentes del tampón de reacción paso a paso que se enumeran en la tabla uno del texto completo.
Trate de no hacer demasiadas burbujas de aire mientras revuelve los componentes de la reacción en la solución de PVA. El truco está en remover continuamente sin sacar la cuchara o la espátula de la solución. El portador de electrones, metoxi fenazinio metilsulfato, debe protegerse de la luz y disolverse en el tampón de reacción al final.
El color rojo del MPMS es conveniente para verificar si todos los componentes se disuelven correctamente. Mientras prepara el tampón de reacción y revuelve los componentes en él, precaliente los portaobjetos durante 50 minutos en una incubadora que contenga agua tibia. Mantenga un nivel de agua bajo dentro de la cámara de incubación.
Con la tapa cerrada, esto mantendrá húmedo el ambiente de reacción. Con la tapa abierta, el agua mantendrá los portaobjetos a una temperatura cálida. Aplique el tampón de reacción a las preparaciones celulares o tisulares con una pipeta de vidrio.
No se preocupe por las pequeñas burbujas de aire porque fluirán hacia la superficie y no interferirán con la reacción en las células o tejidos. Mantenga la tapa de la cámara de incubación cerrada durante el tiempo de incubación. Esto asegurará que la reacción ocurra en un ambiente húmedo para evitar que el tampón de PVA se seque.
La mayoría de las reacciones de deshidrogenasa en los experimentos de mapeo metabólico ocurren a 37 grados centígrados. Incube los portaobjetos en el tampón de reacción durante un período de tiempo preespecificado, que se puede encontrar en la tabla uno del artículo de texto completo. Uno puede ver fácilmente si la reacción funcionó o no, ya que las células, o tejidos, se volverán de color azul oscuro o púrpura, debido a la actividad de las deshidrogenasas.
Que finalmente se convierte en nitroBT insoluble incoloro en formazol azul oscuro, que precipita en el sitio de actividad de la deshidrogenasa. La reacción enzimática se detiene en tres pasos. En primer lugar, el medio de incubación sobrante debe extraerse de un tejido.
En segundo lugar, el medio de incubación se lavará de los portaobjetos de microscopía mediante lavado mecánico en un tampón de fosfato de pH de 5,3 a 60 grados centígrados. En tercer lugar, los portaobjetos de microscopía deben dejarse en un tampón de fosfato fresco de PH 5,3 a 60 grados centígrados durante 20 minutos. En cuarto lugar, el tampón de fosfato se puede enjuagar con agua del grifo y luego con agua destilada.
Se puede ver fácilmente cómo se desprende el tampón de reacción. El pH bajo del tampón de detención ayuda a detener la reacción de deshidrogenasa dentro de las células. Coloque las diapositivas en el búfer de parada nueva una o dos veces, dependiendo de la cantidad de diapositivas que esté procesando a la vez.
También enjuague los portaobjetos con agua del grifo y termine con agua destilada. Ahora, los portaobjetos se pueden secar en un calentador de portaobjetos y encerrar. Seque cuidadosamente la parte posterior del portaobjetos limpiándola y colóquela en un calentador de portaobjetos precalentado a 50 a 60 grados centígrados.
Cuando los portaobjetos están secos, se puede usar una solución de glicerina glicerol y cubreobjetos para encerrar y preservar los portaobjetos. Guarde las diapositivas en el refrigerador hasta que proceda con la adquisición de la imagen. Esta es una fotomicrografía en color de una sección de tejido representativa en un portaobjetos de vidrio que se procesó en el experimento que se muestra en este video.
Se trata de una sección de glioblastoma y la leptodeshidrogenasa es la enzima que se investigó. Cada deshidrogenasa produce una entidad PH y cada molécula de entidad PH convierte una molécula de nitroBT, la sal amarilla de tetrazolio, en una molécula de formazol, el precipitado púrpura que se muestra en esta imagen. Se puede ver una alta actividad de lactato deshidrogenasa intracelular en las células tumorales que se muestran de color púrpura oscuro.
Los vasos sanguíneos tienen menor actividad y son blancos. Se trata de una imagen monocromática de la misma región de la diapositiva. Que se puede utilizar para cuantificar la actividad enzimática como se describe en el protocolo.
Cuanto más formazano se produce, más oscuro es el píxel y mayor es la absorbancia. La absorbancia se puede convertir en picomoles de la entidad ph que se generaron. Por lo tanto, el mapeo metabólico es fácil de hacer.
Es muy rápido y barato. Así que úsalo en tu investigación.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para la visualización microscópica y la cuantificación de la actividad de deshidrogenasa en células y tejidos. Detalla la cinética, función y localización subcelular de estas enzimas, destacando su relevancia en estudios metabólicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Metabolismo
Antecedentes
- Las deshidrogenasas son enzimas clave en las vías metabólicas.
- Las técnicas de mapeo metabólico han evolucionado durante décadas.
- El reciente interés en el metabolismo como diana terapéutica ha revitalizado estas técnicas.
- Comprender la actividad enzimática es fundamental para estudiar el metabolismo celular.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para cuantificar la actividad de deshidrogenasa.
- Destacar la importancia del mapeo metabólico en la investigación actual.
- Facilitar la visualización de la cinética y la localización enzimática.
Métodos Utilizados
- Preparación de tampones de reacción con componentes específicos.
- Aplicación de tampones a preparaciones celulares o de tejidos.
- Incubación en condiciones controladas para permitir que ocurran las reacciones.
- Visualización microscópica de la actividad enzimática mediante cambios colorimétricos.
Resultados Principales
- Visualización exitosa de la actividad de deshidrogenasa en diversas muestras.
- Se observaron cambios de color que indican actividad enzimática.
- El protocolo permite la cuantificación de la cinética enzimática.
- Aplicación demostrada en secciones de tejido de glioblastoma.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar deshidrogenasas.
- La cartografía metabólica es esencial para comprender el metabolismo celular.
- La investigación futura puede basarse en estas técnicas para explorar dianas terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cartografía metabólica proporciona una cuantificación directa e in situ de la actividad de deshidrogenasas, ofreciendo lecturas funcionales que complementan los datos genómicos y proteómicos en la validación de dianas. Esto posibilita la reducción mecanicista de riesgos al vincular la función enzimática con fenotipos de enfermedad, lo que refuerza la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento. La compatibilidad de esta técnica con microscopía convencional y plataformas de análisis de imágenes permite su integración escalable en flujos de trabajo de cribado y traslación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Mide la actividad enzimática funcional en el contexto celular nativo, aclarando la hipótesis terapéutica y la participación de la vía.
- Valor operativo: Permite la evaluación rápida de la modulación de deshidrogenasas mediante perturbaciones genéticas o farmacológicas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de actividad con resolución espacial adecuados para la confirmación de hits y el perfilado de respuesta a dosis.
- Valor operativo: Utiliza una lectura cromogénica compatible con microscopía monocromática y análisis automatizado de imágenes para cribado de throughput medio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Conserva la localización subcelular de la actividad, lo que aporta información sobre la relevancia de los biomarcadores en tejidos relacionados con enfermedades, como secciones de tumores.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar lecturas funcionales del metabolismo en diversos sistemas de modelos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La cartografía metabólica se enmarca dentro del continuo de descubrimiento que va desde la interacción con el blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando una validación funcional que vincula los ensayos bioquímicos con los resultados fenotípicos.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de cambios en la actividad de deshidrogenasas en respuesta a moduladores de la vía.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para la evaluación del efecto de compuestos en células o tejidos fijados.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la absorbancia de formazán como indicador del recambio enzimático, facilitando el análisis de la relación estructura-actividad.
- Investigación Traslacional: Mantiene la arquitectura tisular y la localización enzimática, lo que ayuda a extrapolar los resultados a modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Requiere únicamente equipos de laboratorio estándar (incubadora, microscopio, pipetas), lo que posibilita su amplia adopción en diferentes departamentos sin necesidad de infraestructura especializada.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al vincular la actividad enzimática con el fenotipo celular en condiciones cercanas a las fisiológicas.
- Valor operativo: Un tampón de reacción estandarizado y un protocolo de detención aseguran la reproducibilidad entre usuarios y sitios.
- Valor estratégico: Orienta decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos metabólicos funcionales que predicen los efectos del compuesto sobre el flujo de la vía.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basándose en la actividad validada de deshidrogenasas en modelos de enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Competencia técnica en el manejo de soluciones viscosas de PVA y transportadores de electrones sensibles a la luz.
- Acceso a microscopía de luz monocromática y software de análisis de imágenes para cuantificación.
- Normalización del tiempo de incubación, la temperatura y el pH en todos los experimentos.
- Consideraciones de adaptación para diferentes métodos de fijación de tejidos y requisitos de permeabilidad.
- Limitación: el formato del ensayo de punto final impide el monitoreo cinético en tiempo real.
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