Name: Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende la estrategia HMEJ para integración dirigida de transgenes in vivo mediante CRISPR/Cas9. Este método mejora la eficiencia de la terapia génica y la corrección de mutaciones en modelos animales.

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Este trabajo fue apoyado por CAS estratégicas prioritarias programa de investigación (XDB02050007, XDA01010409), el nacional Hightech R & D programa (programa 863; 2015AA020307), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (NSFC concede 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), programa de talentos China juvenil de mil (en HY), rotura a través del proyecto de la Academia China de Ciencias, Shanghai ciudad Comité de ciencia y tecnología proyecto (16JC1420202 a HY), el Ministerio de ciencia y tecnología de China (más; 2016YFA0100500).

Todos los procedimientos incluyendo temas animales han sido aprobados por el Comité de ética de investigación biomédica en los institutos de Shangai para la ciencia biológica (CAS).
1. diseño de donante plásmidos
<ol><li>
Selección de sgRNA
	<ol>
<li>Utilizar herramientas de diseño en línea CRISPR para predecir sgRNAs en la región de destino de12,11,13,14,15. Para el locus Cdx2 , diseño seis sgRNAs diferentes (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) alrededor de la parada codon con mayor rango y menor potencial de-objetivos (figura 1A)16.</li>
		<li>Alinear 2 μg de vectores de expresión Cas9-CMV-EGFP y sgRNA por digestión BbsI (1 μl de BbsI por 2 h a 37 ° C a una concentración final de 1 U/μl de un volumen de 20 μl). Luego purificar el producto kit de purificación de gel con un gel de agarosa al 1% en Tampón TAE 1 x.</li>
		<li>Mezcla un par de oligonucleótidos sgRNA en 10 μl de 1 × T4 ADN ligasa buffer una concentración final de 50 μm. Incubar la solución oligo utilizando un gradiente de temperatura de 95 ° C a 25 ° C con una tasa de cambio de temperatura de 5 ° C/5min (95 ° C durante 5 min. entonces de 90 ° C por 5 min, 85 º C por 5 min, etcetera.), que hibridan los oligos.</li>
		<li>Mezcle 4 μL de recocido producto, 2 μl del vector linearizado con 1 μl de T4 ADN ligasa en 10 μl de tampón de 1 × T4 DNA ligasa y luego ligar a 22 ° C durante 1-2 h (figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensayo de nucleasa de topógrafo de sgRNA Nota: Se evaluó la eficacia dirigida a de sgRNA utilizado para el experimento de golpe por análisis de nucleasa de topógrafo (también conocido como endonucleasa T7 I (T7EI) ensayo)17. Seleccione lo sgRNA con alta eficiencia de clivaje de ADN y una baja distancia entre el sitio de corte sgRNA y el codón de parada.<ol>
<li>Transfectar vectores de expresión Cas9-sgRNA-EGFP en líneas de células N2a cultivadas en DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%, 1% PSG y el 1% no esenciales aminoácidos por la transfección kit (véase Tabla de materiales). Incube las células transfected a 37 ° C en 5% CO2.</li>
		<li>Después de 48 h de incubación, recoger 5.000 células transfected (GFP+) por celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación usando las células transfectadas no como control.</li>
		<li>Digerir las células recogidas en 2-5 μl de tampón de oflysis (0,1% Tritón X-100, 0,1% Tween 20 y 100 μg/mL proteinasa K) a 56 ° C durante 30 minutos y luego calor inactivar la proteinasa K a 95 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Amplificar la muestra por PCR anidada (tabla 1) utilizando el protocolo del fabricante. El tamaño de los productos PCR se establece en 300-500 bp.<ol>
<li>Mezclar 1 μl del producto de la lisis con polimerasa de la DNA y un par de cebadores externos reconociendo la secuencia alrededor del sitio de destino sgRNA (0,1 μm, concentración final) (tabla 1) y realizar la primaria PCR en un volumen de 20 μl.</li>
			<li>Activar el ADN polimerasa a 95 ° C por 5 min y realizar la PCR primaria por 30 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 24 s (1 minuto/1 kb), con una extensión final a 72 ° C durante 5 minutos.</li>
			<li>Llevar a cabo la polimerización en cadena secundario usando 1 μl del producto PCR primario y un par de cebadores internos anidados.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Desnaturalizar y volver a cocer 300-600 ng del producto PCR purificado en 20 μl de tampón de reacción T7EI (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM TDT pH 7.9) de × 1 utilizando un gradiente de temperatura de 95 ° C a 25 ° C con una tasa de 5 ° C/5min.</li>
		<li>Añadir 1 μl de enzima de T7EI a los productos de PCR recocidos y digerir a 37 ° C por 2 h. Luego ejecute el producto de la digestión en gel de agarosa al 2% en Tampón TAE de 1 × 120 V durante 40 minutos hasta que los fragmentos están separados (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Utilizar ImageJ para determinar las intensidades de la banda de corte y de la DNA sin cortar. Calcular la frecuencia de indel usando los métodos previamente registrados9 (figura 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Construcción del vector de donantes Nota: Para generar vectores de donantes HMEJ de gen Cdx2 , construir un donante de ADN (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp HAR) flanqueado por 23 nt Cdx2-sgRNAs a la secuencia en ambos extremos (figura 1D yEde la figura 1). El PAM de la secuencia de destino estaba adyacente al extremo del brazo homólogo. Asamblea de Gibson se recomienda para donantes HMEJ clonación.<ol>
<li>Amplificar el brazo de homología izquierda bp 800 (HAL) con avance cartilla-1F (que contiene 15-20 nt superposición secuencia de vectores, 23 nt Cdx2-sgRNA secuencia dirigida a y cerca de 20 secuencia de nt de HAL) y cartilla-1R (contiene la secuencia de 15-20 bp superposición de p2A-mCherry y cerca de 20 secuencia de nt de HAL) en concentración final de 0.1 μm usando la DNA genomic de ratón a 200 ng/μl (D,figura 1, tabla 1).</li>
		<li>Amplificar el fragmento de inserción p2A-mCherry con avance cartilla-2F (contiene 15-20 nt superposición secuencia de HAL y cerca de 20 secuencia de nt del fragmento de inserción) y revertir la cartilla-2R (contiene 15-20 nt superposición secuencia de HAR y secuencia de nt cerca de 20 de el fragmento de inserción) en concentración final de 0,1 μm utilizando genomic ADN o plásmido con secuencias de reportero a 100 ng/μl o 30 ng/μl (D,figura 1, tabla 1).</li>
		<li>Amplificar el brazo de derecho homología bp 800 (HAR) con avance cartilla-3F (que contiene 15-20 nt superposición secuencia de vectores, 23 nt Cdx2-sgRNA secuencia dirigida a y cerca de 20 secuencia de nt de HAR) y cartilla-3R (contiene secuencia de superposición de nt de 15-20 de p2A-mCherry y cerca de 20 secuencia de nt de HAR) en concentración final de 0.1 μm usando la DNA genomic de ratón a 200 ng/μl (D,figura 1, tabla 1).</li>
		<li>Ejecutar todos los productos PCR en gel de agarosa al 1% en Tampón TAE 1 x y purificar los productos PCR del tamaño esperado kit de extracción de gel, según las instrucciones del fabricante (tabla 1).</li>
		<li>Digerir el 50-100 ng de un vector de construcción con KpnI y XbaI. Mezcle 2 μl del vector linearizado en 30-40 ng/μl con tres PCR amplifica fragmentos (1 μl de cada uno, 100-200 ng/μL) en 2 x mezcla de Gibson. Agregar H2O para ajustar el volumen final de 10 µL.Incubate la mezcla a 50 ° C durante 60 minutos.</li>
		<li>Competentes de e. coli de transformar las células con el producto ensamblado y extracto el plásmido construye por kit de extracción de ADN según las instrucciones del fabricante. Secuenciación de ADN para comprobar al donante HMEJ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. genoma edición en embriones de ratón utilizando el método basado en la HMEJ
<ol><li>
Producción de mRNA de Cas9
	<ol>
<li>Para la preparación de Cas9 mRNA, agregue la secuencia de promotor de T7 a la Cas9 codificación región por amplificación por PCR utilizando el par de cartilla apropiados listado en la tabla 1. Añadir la cartilla Cas9 F/R en una concentración final de 0.1 μm y 20 ng de Cas9 expresando el vector 1 × alta fidelidad mezcla de ADN polimerasa. Ajustar el volumen final de 50 μL con H2O.</li>
		<li>Activar el ADN polimerasa a 95 ° C por 5 min y realizar la PCR para 36 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 68 ° C por 4 minutos (1 minuto/1 kb), con una extensión final a 68 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Purificar el producto de PCR de Cas9 T7 en vitro transcripción (IVT) y luego transcribir 0.5-1 μg de ADN por kit de transcripción de mRNA a 37 ° C durante 8 horas en un volumen total de 20 μl, según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Añadir 1 μl de DNasa a la mezcla para quitar la plantilla de ADN a 37 º C durante 15 minutos agregar una cola poly-A 45 min a 37 ° C y recuperar el mRNA Cas9 por kit de purificación de RNA, según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Producción de sgRNA
	<ol>
<li>Generar la plantilla sgRNA conducida por un promotor T7 con polimerasa de la DNA de la alta fidelidad como arriba. Elegir un andamio sgRNA que contienen vectores como plantilla. Los cebadores utilizados se enumeran en la tabla 1.</li>
		<li>Purificar el producto PCR de T7-sgRNA y utilizar 0.5-1 μg de DNA como plantilla para la transcripción en vitro de sgRNA usando un kit de transcripción de RNA corto a 37 ° C durante 6 h en un volumen total de 20 μl, según las instrucciones del fabricante (ver tabla de materiales de < / c11 >).</li>
		<li>Añadir 1 μl de DNasa a la mezcla y continuar la incubación a 37 ° C durante 15 min eliminar la plantilla de la DNA. Purificar el sgRNAs por kit de purificación de RNA, como anteriormente (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Diluir el sgRNA a 500 ng/μl de agua libre de ARNasa y almacenar las muestras en el ° C −80 hasta 3 meses. Nota: Ribonucleoproteínas CRISPR (RNPs) son una substitución de la alternativa con mejor corte eficiencia18,19,20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultivo de colección, microinyección y en vitro de embriones
	<ol>
<li>Superovulate femeninos B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) ratones (7-8 semanas) de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG), seguidos de gonadotropina coriónica humana (hCG) 48 h más tarde. Después de la inyección de hCG, mujeres de casa con los varones B6D2F1 durante la noche.</li>
		<li>Sacrificio de las hembras por anestesia de CO2 , 24 h después de la inyección de hCG. Recogen los embriones fecundados de sus oviductos (con 30-50 embriones para cada mujer) en medio de M2.</li>
		<li>Lugar los embriones fertilizados (cerca de 300 huevos para la inyección de un día) en medio KSOM (5,55 g/L de NaCl, KCl, 0.05 g/L de KH2PO4, 0,05 G/l MgSO4•7H2O, 0.04 g/L glucosa, 1,12 g/L sodio de 0,19 g/L lactato, 2,1 g/L NaHCO3 , piruvato de sodio 0.02 g/L, 0,25 g/L CaCl2•2H2O, 0,004 g/L de EDTA, 0,146 gr/L glutamina y 1 g/L albúmina de suero bovino) a 37 ° C en una incubadora con 5% CO2.</li>
		<li>Mezcla Cas9 mRNA (100 ng/μL), sgRNA (50 ng/μL) y donantes HMEJ vector (100 ng/μL) y agregar H2O para ajustar el volumen final de 10 μl. poner la mezcla en hielo.</li>
		<li>Tire las agujas capilares (diámetro externo de 1,0 mm, diámetro interno 0,78 mm con filamento) utilizando un extractor de micropipeta (parámetros: calor, 74, tirón, 60; velocidad, 80; retardo, 200 presión, 300. Véase tabla de materiales). Agujas comerciales sería una sustitución alternativa para la microinyección.</li>
		<li>Inyectar un volumen probable de la mezcla en el citoplasma de cigotos con pronúcleos definidas en una gota de medio de CZB HEPES que contiene 5 μg/mL citocalasina B utilizando un microinyector con constante flujo de configuración (figura 2A) (ver Tabla de materiales)21. Nota: Se debe inyectar cada grupo de cigotos dentro de 20-30 min Cytochalasin B podría aumentar la viabilidad del zigoto de ratón después de la inyección. Por otra parte, microinyección puede funcionar con el sistema piezoeléctrico, como se describió anteriormente22.</li>
		<li>La cultura los cigotos inyectados en medio KSOM a 37 ° C debajo del 5% de CO2 hasta blastocisto etapa después de 3,5 días para observación de la fluorescencia (figuras 2B y 2C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferencia de embriones y la generación de ratones
	<ol>
<li>Compañero de estros ratones hembras ICR con vasectomía ratones machos ICR en el mismo día de la inyección.</li>
		<li>La cultura los cigotos inyectados en la fase de 2 células a 37 ° C con 5% CO2y embriones de 2 células de transferencia 25-30 en oviductos de las hembras ICR seudopreñadas en 0,5 días post coitum (dpc). Las madres beneficiarias entregan cachorros en dpc 19,5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Genotipificación de ratón
	<ol>
<li>Extracto de ADN genómico de ratón de dedo del pie o cola muestras utilizando un kit de extracción de ADN, según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Identificar a la Unión 5' y 3' de knock-eventos de uso de 200-400 ng de ADN genómico medido por espectrofotometría de UV/vis como plantilla para realizar la polimerización en cadena ampliﬁcation.<ol>
<li>Activar el ADN polimerasa a 95 ° C por 5 min y realizar la PCR para 38 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 1 minuto (1 min/1 kb), con una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos. Para el cruce de 5', use el primer avance en el upstream de la HAL, con el reverso en el fragmento de knock (p2A-mCherry). En cuanto a 3' cruce, utilice el primer avance en el fragmento de knock (p2A-mCherry), con el reverso en el abajo del HAR (tabla 1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ejecutar 6 μl del producto PCR en gel de agarosa al 1% en 1 x TAE buffer y compruebe el tamaño del fragmento esperado. Luego verificar por secuencia (figura 2D) de la DNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HMEJ-basado en Vivo genoma edición en hepatocitos
<ol><li>Coloque el receptor ratón C57BL/6J (8 semanas) en un dispositivo de restricción y poner la cola a través de la ranura.</li>
	<li>Mezcla de vectores donantes HMEJ (30 μg) y vectores de la expresión de la spCas9 (30 μg) en 2 mL de solución salina. Para el experimento control, suspender vectores donantes HMEJ (30 μg) en 2 mL de solución salina (figura 3A).</li>
	<li>Limpiar la cola de ratón con etanol al 70%. Insertar la aguja en la cola de la vena e inyectar la solución de ADN de plásmido dentro de 5-7 s. Retire la aguja y suelte el ratón desde el dispositivo que refrena.</li>
	<li>Sacrificio de ratones por CO2 anestesia después de 5-9 días después de la inyección. Inundar lo ratones transcardially con solución salina al 0.9%, seguido de paraformaldehído al 4% utilizando una bomba peristáltica y fijar el hígado durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Deshidratar el tejido con sacarosa al 30% durante la noche, hasta que se hunde hasta el fondo del tubo.</li>
	<li>Sección el tejido congelado en un espesor de 10 μm para las muestras de hígado.</li>
	<li>Enjuague las secciones tres veces con tampón fosfato 0,1 M (PB) e incubar con el anticuerpo primario: conejo anti-mCherry (diluido en 5% NGS) durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Lávese las secciones tres veces en PB y luego los incubar con el anticuerpo secundario: Cy3-AffiniPure de cabra anti-conejo IgG por 2 h a temperatura ambiente en un agitador orbital.</li>
	<li>Contratinción las secciones con DAPI por 20 min y montar con glicerina en portaobjetos de vidrio para mayor observación de fluorescencia (figura 3B).</li>
</ol>

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<li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li>
<li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos más críticos en la construcción de plásmidos de donantes HMEJ son: (1) selección de lo sgRNA con alta eficiencia de clivaje de ADN y baja distancia entre sgRNA corte y codón de parada y construcción (2) adecuada de donantes HMEJ. Escote CRISPR/Cas9-mediada en tanto vector de donante transgénico (contiene ~ 800 bp homología brazos y sitios de destino sgRNA) y genoma específica es necesario para la integración específica eficiente y precisa en vivo. Los pasos más críticos de generación de golpe en ratone...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay"  to " T7 endonuclease I" respectively. 
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>Surveyor nuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
to:
<ol class="jove_content" start="2">
	<li>T7 endonuclease assay of sgRNA 
	NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.</li>
</ol>
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
<img alt="CRISPR-Cas9 gene editing; sgRNA design, transfection, surveyor assay results; molecular diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Gene editing workflow with CRISPR, sgRNA, Cdx2 locus; includes T7E1 assay result and vector diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro. 
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56844/56844fig1v3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/56844/crisprcas9-mediated-targeted-integration-vivo-using-homology-mediated">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>. The phrases&#160;&#34;surveyor assay&#34;&#160;and&#160;&#34;Surveyor&#160;Nuclease&#34; have&#160;been updated to &#34;T7E1 assay&#34;&#160; to &#34; T7&#160;endonuclease I&#34; respectively.&#160;

Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

La edición del genoma, precisa, específica es a menudo necesaria para la producción de modelos animales modificados genéticamente y tratamientos clínicos. Se ha realizado mucho esfuerzo para desarrollar diversas estrategias para el genoma objetivo eficiente de edición, como nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras como activador de transcripción (TALENs) y sistemas de CRISPR/Cas9. Estas estrategias crean roturas de doble cadena DNA específicas (OSD) en el genoma y toman ventaja de intrínsecos sistemas de reparación del ADN, como la recombinación homóloga (HR)1,2, microhomology-mediada se terminan uniendo (MMEJ)3 , 4 , 5y no homólogas terminan uniendo (NHEJ)6,7,8 para inducir la integración dirigida de los transgenes1,9. La estrategia de recursos humanos es actualmente el más de uso general genoma edición de enfoque, que es muy eficiente en las líneas celulares, pero no fácilmente accesibles a las células no se dividen por su ocurrencia restringida en la fase tardía de la S/G2. Así, la estrategia de recursos humanos no es aplicable para en vivo la edición del genoma. Recientemente, la estrategia basada en NHEJ se desarrolló para eficaz de genes knock-en tejidos de ratón8. Sin embargo, el método basado en NHEJ usualmente presenta indels en las uniones, lo que es difícil generar la edición del genoma exacto, especialmente cuando se trata de construir en el marco de la fusión de genes8. Integración dirigida basada en MMEJ es capaz de la edición del genoma exacto. Sin embargo, sólo modestamente aumenta la eficiencia de integración específicas en informes anteriores5. Por lo tanto, mejorar la eficiencia de integración específicas precisa en vivo se necesita urgentemente para amplias aplicaciones terapéuticas3.
En un trabajo publicado recientemente, hemos demostrado una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-basado en la estrategia, que mostró la mayor eficiencia de integración específica en todo divulgado estrategias, tanto in vitro e in vivo10. Aquí, describimos un protocolo para el establecimiento del sistema HMEJ, y también la construcción de los vectores de RNA (sgRNA) solo guía al gen de interés y el donante vectores propios sitios de destino sgRNA y ~ 800 bp de brazos de homología (figura 1) . En este protocolo, también se describen los pasos detallados para la generación de ADN knock-en ratones y breves pasos de integración específica en tejidos en vivo. Por otra parte, un estudio de prueba de concepto de la estrategia basada en HMEJ demostrado su capacidad para corregir la mutación de la Fah y rescatar a Fah- / - hígado insuficiencia ratones, que además revelaron su potencial terapéutico.

<table><tbody><tr><td>pX330</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>vector pAAV</td><td>Addgene</td><td>37083</td><td></td></tr><tr><td>pX260</td><td>Addgene</td><td>42229</td><td></td></tr><tr><td>AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td><td>Addgene</td><td>97307</td><td>Vector AAV para codificar un SpCas9 optimizado para codón humano impulsado por el promotor de EFs</td></tr><tr><td>AAV_Actb HMEJ</td><td>donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA Addgene</td><td>97308</td><td>Donante de HMEJ para fusionar un reportero de p2A-mCherry con Actb de ratón. EGFP impulsado por el promotor de EF1a y sgRNAs impulsados por U6 dirigidos a Actb. Red troncal AAV.</td></tr><tr><td>AAV_Cdx2 Donante de HMEJ</td><td>Addgene</td><td>97319</td><td>Donante de HMEJ para fusionar un reportero de p2A-mCherry con Cdx2 de ratón.&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 Reactivo de transfección</td><td>Tecnología de vida</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasa</td><td>Life Technologies</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Bbs I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonucleasa I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Ensamblaje Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido EndoFree-Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>MEGACLEAR KIT 20 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS</td><td>Life Technologies</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>&nbsp; Extractor de micropipetas (parámetros: calor, 74; tracción, 60; velocidad, 80; tiempo/retardo, 200; presión, 300)</td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-78-10</td><td>tipo de capilares (diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,78 mm con filamento)&nbsp;</td></tr><tr><td>Microinyector FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo de congelación</td><td>Leica</td><td>CM1950-Espesor del criostato</td><td>&nbsp; de&nbsp; 40&nbsp; &mu; m&nbsp; para&nbsp; cerebro,&nbsp; 10 &mu; m&nbsp; para&nbsp; hígado</td></tr><tr><td>Conejo anti-mCereza</td><td>GeneTex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniCabra pura Anti-Conejo IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099141</td> NEAA Gibco 11140050 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluma,Estreptococo,Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD AriaII</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Ningbo Sansheng Medicine</td><td>S141004</td><td></td></tr><tr><td>HCG</td><td>Ningbo Sansheng Medicine</td><td>B141002</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Sigma</td><td>CAT#C6762</td><td></td></tr><tr><td>KSOM+AA con D-Glucosa y Fenol</td><td>Millipore</td> Rojo <td>CAT#MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medio con Fenol</td><td>Rojo Millipore</td><td>CAT#MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

integración dirigida crispr/cas9-mediada in vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Como una plataforma de edición de genoma prometedora, el sistema CRISPR/Cas9 tiene gran potencial para la manipulación genética eficiente, especialmente para la integración dirigida de los transgenes. Sin embargo, debido a la baja eficiencia de recombinación homóloga (HR) y las varias mutaciones indel de no homóloga se terminan uniendo (NHEJ)-basado en estrategias en las células no se dividen, en vivo genoma edición sigue siendo un gran desafío. Aquí, describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-sistema CRISPR/Cas9 eficiente en vivo precisa integración específica. En este sistema, el genoma de destino y el donante vector que contiene los brazos de homología (~ 800 bp) flanqueado por destino de RNA (sgRNA) solo guía secuencias son troceadas por CRISPR/Cas9. Esta estrategia basada en HMEJ logra integración eficiente del transgen en cigotos de ratón, así como en hepatocitos en vivo. Por otra parte, una estrategia basada en HMEJ ofrece un enfoque eficaz para la corrección del fumarylacetoacetate hidrolasa (Fah) mutación en los hepatocitos y rescata Fah-deficiencia inducida por ratones de insuficiencia hepática. Tomados en conjunto, centrándose en el objetivo integración, esta estrategia basada en la HMEJ proporciona una herramienta prometedora para una variedad de aplicaciones, incluyendo la generación de modelos animales modificados genéticamente y terapias genéticas específicas.

Edición del genoma basado en HMEJ en embriones de ratón: Para definir la eficiencia knock-in del método basado en la HMEJ de cigotos de ratón, entregamos Cas9 mRNA, sgRNA contra el gen Cdx2 y el donante HMEJ en cigotos de ratón, que fue diseñado para fundir un gen reportero de p2A-mCherry al codón de último de la Cdx2 gen (figura 2A). Los cigotos inyectados convirtieron en blastocistos en la cultura. Para ev...

El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) sistema proporciona una herramienta prometedora para la ingeniería genética y abre la posibilidad de integración dirigida de los transgenes. Describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-estrategia por turnos para ADN eficiente objetivo integración en vivo y dirigida terapias genéticas usando CRISPR/Cas9.

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

El objetivo general de esta estrategia de HMEJ es proporcionar una herramienta genética prometedora para una variedad de aplicaciones, incluida la generación de modelos animales modificados genéticamente y terapias génicas dirigidas. Este HMEJ aprobó la medida. También puede tener preguntas clave en el campo genético y en el neuro.Por ejemplo, cómo mejorar la eficiencia de la integración precisa y dirigida de transgenes in vivo. La principal ventaja de esta estrategia basada en HMEJ es la capacidad de corregir mutaciones genéticas con alta eficiencia in vivo. Lo que siguió es terapéutico en potencial.El demostrador del procedimiento será Xing Wang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para comenzar el protocolo, se recolectaron 5000 células N2a, previamente transfectadas con vectores de expresión de EGFP Cas9 sgRNA mediante clasificación celular activada por fluorescencia o FACS, utilizando células no transfectadas como control. Digiera las células recolectadas en 2 a 5 microlitros de tampón de lisis a 56 grados centígrados durante 30 minutos.Luego calentar y activar la proteinasa K a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Amplifique la muestra mediante PCR anidada utilizando el protocolo del fabricante. Mezcle un microlitro del producto de lisis con ADN polimerasa y un par de cebadores externos que reconozcan la secuencia alrededor del sitio objetivo del sgRNA y realice la PCR primaria en un volumen total de 20 microlitros.A continuación, active la ADN polimerasa a 95 grados centígrados durante 5 minutos, luego realice la PCR primaria con una extensión final a 72 grados centígrados durante 5 minutos. Realice la PCR secundaria utilizando un microlitro de producto de PCR primario y un par de cebadores internos anidados. Desnaturalice y recoche 300-600 nanogramos de producto PCR purificado en 20 microlitros de tampón de reacción TC7EI 1x.Agregue un microlitro de enzima T7EI a los productos de PCR recocidos y digiera a 37 grados Celsius durante dos horas. A continuación, ejecute el producto de digestión en gel de agarosa al 2% y 1x tampón TAE a 120 voltios durante 40 minutos, hasta que se separen los fragmentos. Utilice ImageJ para determinar las intensidades de banda del ADN cortado y no cortado y calcular la frecuencia indel.Para la preparación del ARNm de Cas9, agregue la secuencia del promotor T7 a la región codificante de Cas9 mediante amplificación por PCR. A continuación, agregue el cebador Cas9 FR a una concentración final de 0,1 micromolar y 20 nanogramos de vector expresor de Cas9 a la mezcla de ADN polimerasa de alta fidelidad 1x. Ajustar el volumen final a 50 microlitros con agua libre de nucleasas.Activar la ADN polimerasa a 95 grados centígrados durante 5 minutos y realizar la PCR. Purifique el producto T7 Cas9 y PCR para la transcripción in vitro, o IVT. A continuación, transcriba de 0,5 a 1 microgramo de ADN, utilizando un kit de transcripción de ARNm a 37 grados centígrados durante 8 horas en un volumen total de 20 microlitros.Agregue 1 microlitro de DNasa a la mezcla para eliminar la plantilla de ADN a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de agregar una cola de poli(A) durante 45 minutos a 37 grados centígrados, recupere el ARNm de Cas9 con un kit de purificación de ARN. Genere la plantilla de sgRNA impulsada por un promotor T7 con ADN polimerasa de alta fidelidad como se realizó en la sección anterior y elija un andamio que contenga un vector de sgRNA como plantilla.Después de purificar el producto de PCR de sgRNA T7, use de 0,5 a 1 microgramo de ADN como plantilla para la transcripción in vitro de sgRNA usando un kit de transcripción de ARN corto a 37 grados Celsius durante 6 horas, en un volumen total de 20 microlitros. Después de 6 horas de incubación, agregue 1 microlitro de DNasa a la mezcla y continúe la incubación a 37 grados centígrados durante 15 minutos para eliminar la plantilla de ADN. Vuelva a purificar los sgRNAs utilizando el kit de purificación de ARN.Diluya el sgRNA a 500 nanogramos por microlitro en agua libre de RNasa y almacene las muestras a menos 80 grados Celsius durante un máximo de tres meses. La alta calidad del ARNm y el ARNs de Cas9 sin degeneración y la línea correcta de los parámetros del donante de HMEJ son los pasos más críticos en la generación de ratones knock-in. Coloque los embriones fertilizados en medio KSOM a 37 grados Celsius en una incubadora con 5% de dióxido de carbono.Mezcle 100 nanogramos por microlitro de ARNm Cas9, 50 nanogramos por microlitro de ARNs y 100 nanogramos por microlitro de vector donante HMEJ y agregue agua para ajustar el volumen final a 10 microlitros. Pipetea la mezcla hacia arriba y hacia abajo y colócala sobre hielo. A continuación, tire de las agujas capilares con un extractor de micropipetas.Inyectar un volumen probable de la mezcla en el citoplasma de cigotos con pronúcleos bien definidos en una gota de medio HEPES-CZB que contenga 5 microgramos por mililitro de citocalasina B utilizando un microinyector con ajustes de flujo constante. Finalmente, se cultivaron los cigotos inyectados en medio KSOM a 37 grados Celsius bajo 5% de dióxido de carbono hasta la etapa de blastocisto después de 3 1/2 días para la observación de fluorescencia. Después de 3 días de inyecciones, el 12,9% de los blastocistos que recibieron donantes de HMEJ fueron positivos para mCherry, que se expresó estrictamente en el trofoectodermo.Al secuenciar los ratones positivos para PCR, todos los eventos de integración examinados fueron integraciones precisas en el marco en las uniones de 5 y 3 primos. Después de 7 días de inyecciones, las imágenes inmunofluorescentes revelaron que casi la mitad de los hepatocitos transfectados expresaban mCherry teñido en las secciones hepáticas. Después de la retirada de NTBC, la tinción hepática inmunohistoquímica de los hepatocitos corregidos por Fah de ratones Fah negativos que recibieron construcciones Fah HMEJ y Cas9 mostró una proliferación más efectiva que el método basado en MMEJ.La estrategia basada en HMEJ podría ser una plataforma ideal para reemplazar la secuencia mutada, como parte de la mutación, por la correcta. Lo cual no es aplicable para un método basado en HHEJ. Después de este experimento, esta terapia allana el camino para que los investigadores en el campo de la integración precisa de objetivos exploren amplias aplicaciones terapéuticas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este video, demostramos la edición del genoma basada en CRISPR-Cas9 todo en uno en células cultivadas donde Cas9 y sgRNA se proporcionan como una sola construcción de plásmido a las células. El sistema CRISPR-Cas9 y el gen deseado a insertar se introdujo en las células mediante la técnica de electroporación para facilitar el éxito de la edición de genes.

Edición del genoma CRISPR todo en uno: un método para el knock-in de genes basado en la reparación dirigida por homología en células cultivadas mediante el sistema CRISPR-Cas9

Los recientes avances en la capacidad de manipular genéticamente las líneas celulares somáticas tienen un gran potencial para la investigación básica y aplicada. En este sentido, presentamos dos enfoques para CRISPR / Cas9 generado producción de eliminación y el cribado en líneas de células de mamíferos, con y sin el uso de marcadores seleccionables.

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

Este protocolo describe el flujo de trabajo de un gen CRISPR/Cas9 basado en sistema para la reparación de las mutaciones de punto en células de mamíferos. Aquí, utilizamos un enfoque combinatorio gene edición con una detallado seguimiento estrategia experimental para medir la formación de indel en el sitio de destino, en esencia, analizar in situ la mutagénesis.

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Edición del genoma específica en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) ha sido facilitada enormemente por la aparición de enfoques CRISPR. Adjunto, describimos un protocolo robusto optimizado para la generación y la identificación de alelos derivados CRISPR absurdo que incorpora el análisis de movilidad del heterodúplex y la identificación de mutaciones mediante secuenciación de próxima generación.

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Aquí, presentamos un método para diseñar el genoma de C. elegans utilizando ribonucleoproteínas Cas9 CRISPR y plantillas de reparación dependiente de homología.

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

Se describe aquí es un protocolo para etiquetar endógeno expresado proteínas con las etiquetas fluorescentes en las células de vástago humanas pluripotentes inducidas mediante CRISPR/Cas9. Células supuestamente editadas se enriquecen con clasificación de celda de fluorescencia activada y se generan líneas de células clonales.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Este estudio proporciona un procedimiento sistemáticamente optimizado de la construcción basada en ribonucleasa CRISPR / Cas9 de mutantes de langosta homocigota, así como un método detallado para la criopreservación y reanimación de los huevos de langosta.

Construcción de mutantes homocigotos de langostas migratorias utilizando tecnología CRISPR/Cas9

Un obstáculo importante para tecnologías como CRISPR son los eventos fuera del objetivo que pueden alterar genes vitales. La «circularización para la notificación in vitro de los efectos de la escisión mediante secuenciación» (CIRCLE-seq) es una técnica diseñada para identificar los sitios de escisión no intencionados. Este método mapea la actividad de CRISPR-Cas9 en todo el genoma con alta sensibilidad y sin sesgos.

CIRCLE-SEQ para la interrogación de la edición de genes fuera del objetivo

Se proporciona un protocolo detallado para el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 para lograr un knock-in dirigido altamente eficiente de grandes construcciones multicistrónicas en células T humanas primarias a través de la vía de reparación del ADN de unión de extremos mediada por homología (HMEJ). Las células T diseñadas con este protocolo adaptable a las buenas prácticas de fabricación actuales mantienen una excelente expansión celular, citotoxicidad y producción de citocinas.

Ingeniería no viral de células T humanas primarias mediante la integración dirigida de grandes plantillas de ADN mediada por homología

Aprende la estrategia HMEJ para integración dirigida de transgenes in vivo mediante CRISPR/Cas9. Este método mejora la eficiencia de la terapia génica y la corrección de mutaciones en modelos animales.

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

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