Name: Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a caracterizar el microbioma fecal mediante secuenciación de 16S rRNA. Este protocolo de alto rendimiento permite analizar comunidades aeróbicas y anaeróbicas, incluyendo bacterias difíciles de cultivar, de forma reproducible y rentable.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el programa I-CORE (convocatoria nº 41/11), el Israel Science Foundation (grant no. 908/15) y la Europea de Crohn y Colitis organización (ECCO).

Aprobación ética para el estudio fue otorgada por el Comité de ética de investigación Local de Sheba y todos los métodos fueron realizados conforme a las normas y directrices pertinentes. El protocolo recibió una excepción del consentimiento del paciente de la Junta de revisión ética local, desde la materia fecal que se utilizaron fueron ya sometidos a la base de la microbiología como parte del workup clínico y sin paciente identificable que no sea de edad, Género y resultados microbianos. Escrito, el consentimiento informado fue obtenido de voluntarios sanos y la Junta de revisión institucional aprobó el estudio. Algunas de las muestras ya han sido incluidas en un análisis anterior1.
1. manejo de la muestra
<ol><li>Recoger un frotis aproximadamente 5 de2 mm (aproximadamente del tamaño de un borrador de lápiz) de una muestra fecal fresca con un hisopo estéril en una prueba de tubo (véase Tabla de materiales). Guarde los hisopos que contiene muestras de heces a-80 ° C en 24 h. Los hisopos fecales pueden permanecer allí hasta que la transformación posterior.</li>
</ol>2. extracción de ADN
<ol><li>Descongelar las soluciones de extracción y dilución a temperatura ambiente (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Transferencia el hisopo fecal en una colección vacía 2 mL del tubo (véase Tabla de materiales). Ajustar el tamaño de la stick de hisopo cortando con unas tijeras limpias para permitir el cierre del tubo con mínima contaminación. Añadir 250 μL de solución de extracción para cada tubo de la colección que contiene el hisopo fecal y vortex para mezclar.</li>
	<li>Calentar las muestras durante 10 min en un baño de agua hirviendo (95 – 100° C). Añadir 250 μL de solución de dilución para cada muestra y agitar para mezclar.</li>
	<li>Almacenar los tubos de 2 mL que contiene el ADN extraído y el hisopo a 4 ° C.</li>
</ol>3. PCR y preparación de la biblioteca
Para los pasos 3.1 y 3.2, ambiente de trabajo en una estación de trabajo PCR que proporciona limpio, plantilla y productos gratis.
<ol><li>Los iniciadores (tabla 1) según su código de barras de la etiqueta. Diluir cada cartilla en agua bidestilada (DDW) a una concentración μM 50 y almacenar a-20 ° C.</li>
	<li>Utilice una placa de 96 pocillos para reacciones de PCR. Cada placa puede contener 32 muestras diferentes, que son etiquetadas por 32 iniciadores de índice diferentes. Descongelar la cartilla hacia adelante y los cebadores inversos 32 a temperatura ambiente y diluir a 5 μM.</li>
	<li>Preparar mezclas de reacción de PCR para 100 reacciones (volumen final en cada pozo será 20 μl) mediante la mezcla de 100 μL del primer avance de 5 μM, 1 mL 2 X PCR Master mix y 400 μL DDW. Poner 15 μL de esta mezcla PCR en cada pozo (un total de 96 pocillos). Añadir 1 μL de cada cebador indexadas inversa 5 μM a 3 diferentes pozos (32 diferentes cartillas en triplicado da un total de 96 pocillos).</li>
	<li>En una zona dedicada a pre-PCR, lo que significa un banco limpio de la plantilla y productos gratis, añadir 4 μL de cada muestra de ADN extraída a las mezclas de reacción (cada muestra de ADN extraída se amplifica por triplicado — 32 muestras por placa de 96 pocillos).</li>
	<li>Ejecutar la polimerización en cadena con los siguientes ajustes: desnaturalización inicial de 94 ° C por 3 min; seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C por 1 min, recocido a 55 ° C por 1 min y extensión a 72 ° C por 1 min; y una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>En un banco diferente, que se define como una zona dedicada a post-PCR, combinar cada reacción de PCR por triplicado en un tubo de volumen (60 μL por muestra).</li>
	<li>Para evaluar la calidad de los amplicones de PCR, ejecute 4 μL de cada reacción de PCR combinada en un gel de agarosa al 1% teñidos de bromuro de etidio. Bajo longitud de onda de UV de 260 nm, los amplicones positivo aparecerá en un tamaño de banda esperado de 375-425 bp. Sólo estos amplicones se incluirán en los pasos posteriores. Nota: Cada muestra se amplifica en triplicado, significa que cada muestra se amplifica en 3 diferentes reacciones de PCR. No escale.</li>
</ol>4. Biblioteca cuantificación y limpieza
<ol><li>Para conseguir una piscina de concentración equimolar de todas las muestras PCR, cuantificar cada amplicón por una doble trenzada DNA (dsDNA cuantificar reactivo) de la mancha fluorescente ácidos nucleicos (véase Tabla de materiales), adecuado para la cuantificación simultánea de un gran cantidad de muestras. Nota: Dado que el rango de tamaño de los amplicones es equívoco, la cantidad real en nanogramos se utiliza para cargar una concentración equimolar.</li>
	<li>Combinar 500 ng de cada muestra en un tubo único, estéril. Vortex para mezclar.</li>
	<li>Ejecutar 200 μL de la biblioteca agrupada en un gel de agarosa 1% teñido de bromuro de etidio. Extracto de las bandas de 375-425 bp del gel utilizando un kit de extracción de gel según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales) y eluir la biblioteca agrupada en 80 μL DDW. Nota: La biblioteca combinada debe ser el tamaño seleccionado para reducir productos de amplificación no específica de anfitrión DNA.</li>
	<li>Medir la concentración de final de la biblioteca utilizando un dsDNA altamente sensible detectar kit según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales). Medir el tamaño exacto de la biblioteca con el equipo de separación y análisis muy sensible para las bibliotecas de DNA según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).</li>
</ol>5. la secuencia
<ol><li>Diluir la biblioteca combinada de 19:00 con la adición de biblioteca de control de 20% (véase Tabla de materiales), según el protocolo de la máquina de la secuencia.</li>
	<li>Para la secuencia, diseñada personalizado de uso Lee cartillas que son complementarios a los cebadores de amplificación V4 (véase tabla 1).</li>
	<li>Cartilla de la secuencia diseñada personalizada uso un tercero que lee el código de barras en un ciclo (véase tabla 1) y genera lecturas de extremo apareado de 175 bases de longitud en cada dirección, según las especificaciones del fabricante.</li>
	<li>Funcionar la máquina de secuenciación y obtener archivos FASTQ según protocolo del fabricante.</li>
</ol>6. procesamiento de datos
<ol><li>Unir y procesar los archivos FASTQ extremo apareado superpuestos en una tubería de conservación de datos implementado en 2 QIIME versión 2017.7.017. Demultiplexar las lecturas según muestra determinados códigos de barras.</li>
	<li>Utilice DADA218 para la detección de variante (SVs) de control de calidad y secuencia. Truncar lee en 13 bases del extremo 3' y 15 bases desde el extremo 5', descarte Lee con más de 2 errores esperados. Identificar y eliminar las quimeras usando el método de consenso — quimeras son detectadas en las muestras individualmente, y se eliminan secuencias encuentran quiméricas en una fracción suficiente de muestras.</li>
	<li>Realizar la clasificación taxonómica de la SVs mediante un clasificador Naive Bayes equipado, entrenado en agosto de 2013 99% identidad Greengenes base de datos6, para 175 largo Lee y la cartilla de reversa/sistema.</li>
	<li>Espiritualizado todas las muestras a profundidad de 2.146 secuencias.</li>
	<li>Use Unweighted UniFrac para la medición de la β-diversidad (entre muestra diversidad19,20) en las muestras enrarecidas, para evitar un efecto de tamaño de muestra.</li>
	<li>Utilizar la matriz resultante de la distancia para realizar un análisis de coordenadas principales (PCoA). Nota: Los archivos de script y mapeo de proceso de datos se suministran como material complementario (Material complementario 1 y 2).</li>
</ol>

<ol><li>Braun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbial+characterization+of+hospitalized+patients+with+suspected+infectious+diarrhea+shows+significant+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis.</a> Scientific Reports. 7, 1088(2017).</li>
<li>De Filippo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+diet+in+shaping+gut+microbiota+revealed+by+a+comparative+study+in+children+from+Europe+and+rural+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).</li>
<li>Yatsunenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome+viewed+across+age+and+geography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome viewed across age and geography.</a> Nature. 486, 222-227 (2012).</li>
<li>Rodriguez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+gut+microbiota+throughout+life%2C+with+an+emphasis+on+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life.</a> Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).</li>
<li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).</li>
<li>Bakken, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+Clostridium+difficile+infection+with+fecal+microbiota+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).</li>
<li>Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+composition+of+the+human+fecal+microbiome+after+bacteriotherapy+for+recurrent+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).</li>
<li>Nood, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+infusion+of+donor+feces+for+recurrent+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile.</a> The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).</li>
<li>Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6105529">Value of stool cultures.</a> The Lancet. 316, 413-416 (1980).</li>
<li>Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+diagnostics+for+infectious+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">New concepts in diagnostics for infectious diarrhea.</a> Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).</li>
<li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality-filtering+vastly+improves+diversity+estimates+from+Illumina+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10, 57-59 (2013).</li>
<li>Leek, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+widespread+and+critical+impact+of+batch+effects+in+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data.</a> Nature Reviews Genetics. 11, (2010).</li>
<li>Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Create+a+global+microbiome+effort%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Create a global microbiome effort.</a> Nature. 526, 631-634 (2015).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> PNAS. 108, 4516-4522 (2011).</li>
<li>Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+PCR+approach+to+accelerate+analyses+of+human-associated+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities.</a> PloS One. 7, (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li>
<li>Lozupone, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+A+new+phylogenetic+method+for+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).</li>
<li>Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UniFrac%3A+An+effective+distance+metric+for+microbial+community+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison.</a> The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+16S+rRNA+gene+for+identification+of+a+broad+range+of+clinically+relevant+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens.</a> PloS One. 10, e0117617(2015).</li>
<li>Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+intestinal+microbiota%3A+culture+versus+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing.</a> ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).</li>
<li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).</li>
<li>Salipante, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+16S+rRNA+next-generation+sequencing+of+polymicrobial+clinical+samples+for+diagnosis+of+complex+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections.</a> PloS One. 8, e65226(2013).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

16S rRNA-amplicones y metagenómica escopeta secuenciación han ganado popularidad en microbiología clínica aplicaciones21,22,23. Estas técnicas son ventajosas en su mayor capacidad para capturar taxa cultivables y no cultivables, proporcionando datos sobre la abundancia relativa de inóculo patógeno y su capacidad para identificar más precisamente un polimicrobial infecciosa 24de la huella digital. Los avances en el campo de la investigación...

Concentración de esfuerzos se hicieron para entender mejor el microbioma diversidad y abundancia, como otro aspecto de la captura de diferencia y semejanzas entre los individuos en condiciones sanas y patológicas. Edad2,3, geografía4, estilo de vida5,6y5 de la enfermedad fueron demostrados para ser asociado con la composición del microbioma de la tripa, pero muchas condiciones y poblaciones aún no han sido completamente caracterizado. Recientemente se ha divulgado que el microbioma puede ser modificado para aplicaciones terapéuticas7,8,9. Por lo tanto, la penetración adicional en la relación entre diferentes condiciones fisiológicas y la composición microbiana es el primer paso hacia la optimización de posibles modificaciones futuras.
Los métodos tradicionales de cultivo microbiano están limitados por bajos rendimientos10,11y se conceptualizan como un estado binario donde es una bacteria presente en el intestino o no. Secuenciación de alto rendimiento basado en el ADN ha revolucionado la ecología microbiana, lo que permite la captura de todos los miembros de la comunidad microbiana. Sin embargo, la secuencia Lee longitud y calidad siguen siendo barreras significativas a la taxonomía exacta asignación12. Además, basado en experimentos de alto rendimiento pueden sufrir de efectos por lotes, donde las mediciones son afectadas por variables no biológicas o no científica13. En los últimos años, se han establecido varios programas para estudiar el microbioma humano, incluyendo el proyecto americano Gut, el proyecto microbioma humano de Estados Unidos (US) y el proyecto MetaHIT de Reino Unido (Reino Unido). Estas iniciativas han generado grandes cantidades de datos que no son fácilmente comparables debido a la falta de coherencia en sus planteamientos. Una variedad de proyectos internacionales tales como el consorcio internacional de microbioma humano, el proyecto del microbioma humano normas y el National Institute of Standards and Technology (NIST) intentó abordar algunos de estos temas14 y desarrolla estándares para la medición de microbioma que permita el logro de resultados reproductivos confiables. Se describe aquí es un protocolo integrado de15,varios métodos ampliamente utilizados de16 para 16S rRNA alto rendimiento secuencia (16S-seq) a partir de la recogida de muestras fecales a través del análisis de datos. El protocolo describe un enfoque PCR libre de columnas, diseñado originalmente para la extracción directa de la planta DNA16, para permitir el manejo simultáneo de grandes cantidades de heces las muestras en un tiempo relativamente corto con alta calidad amplificaron la DNA para la apuntada secuenciación de la región variable microbiana de V4 en una plataforma común de la secuencia. Este protocolo tiene como objetivo guiar a los científicos interesados en iniciar el uso de productos de rRNA 16S que ordena de manera robusta, reproductiva, fácil de usar, detallada, usando controles importantes. Tener un protocolo de visitas guiadas y detallada paso a paso puede minimizar el efecto de lote y así permitirá resultados de secuenciación más comparables entre laboratorios.

<table><tbody><tr><td>Primers</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de extracción</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7526</td><td></td></tr><tr><td>Solución de dilución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5688</td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPABIOSYSTEMS</td><td>KK2601</td><td>PCR Mezcla maestra</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit de reactivos</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>dsDNA cuantificar reactivo</td></tr><tr><td>MinElute kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28606</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Amresco</td><td>0710-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura libre de dnasa y rnasa</td><td>Industrias Biológicas</td><td>01-866-1A</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS kit de ensayo</td><td>Sondas moleculares</td><td>Q32854</td><td>dsDNA kit de detección de ADNd</td></tr><tr><td>Alta sensibilidad D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>Cinta de cribado 5067-5582</td><td>Separación y análisis</td></tr><tr><td>Ensayo de cinta de cribado</td><td>Reactivos 5067-5583</td> de <td>Agilent Technologies</td><td>para bibliotecas de ADN</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>15017666</td><td>biblioteca de control</td></tr><tr><td>MiSeq Reactive Kit v2 (500 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Amresco</td><td>E406-10mL-TAM</td><td></td></tr><tr><td>Colección de 2 mL </td><td>tubos SARSTEDT</td><td>72.695.400</td><td>Tubos de recolección Safe Seal</td></tr><tr><td>Hisopo de plástico en tubo de ensayo</td><td>de PP INTERIOR ESTÉRIL</td><td>23117</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR</td><td>aplicada Biosystems</td><td>2720 Termociclador</td><td></td></tr><tr><td>Secuenciadora</td><td>Illumina</td><td>Miseq</td><td></td></tr><tr><td>Estación de trabajo de PCR</td><td>Biosan</td><td>Limpiador</td><td></td>UV</tr><tr><td>tijeras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo guía para caracterización microbiana fecal por secuencia de 16s rrna-productos

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

El microbioma intestinal humana juega un papel central en la protección de las células de la lesión, en el procesamiento de energía y nutrientes y en promover la inmunidad. Desviaciones de lo que se considera una composición de la microbiota saludable (disbiosis) pueden influenciar las funciones vitales que conduce a condiciones patológicas. Esfuerzos de investigación recientes y en curso se han dirigido hacia la caracterización de las asociaciones entre la composición microbiana y la salud humana y la enfermedad.
Los avances en tecnologías de secuenciación de alto rendimiento permiten la caracterización de la composición microbiana del intestino. Estos métodos incluyen amplicon de rRNA 16S que ordena y secuencia de la escopeta. Secuenciación de amplicones de rRNA 16S se utiliza para Perfil de composición taxonómica, mientras que la secuenciación shotgun proporciona información adicional acerca de las predicciones del gene y anotación funcional. Una ventaja en el uso de un método de secuenciación específica de la región variable del 16S rRNA gene es su costo sustancialmente inferior en comparación con la secuencia de la escopeta. Las diferencias de secuencia en el gene del rRNA 16S se utilizan como una huella microbiana para identificar y cuantificar diferentes taxones dentro de una muestra individual.
Grandes esfuerzos internacionales han alistado estándares para secuenciación de amplicones de rRNA 16S. Sin embargo, varios estudios reportan una fuente común de variación causada por el efecto de lote. Para minimizar este efecto, uniformados protocolos para toma de muestras, procesamiento y la secuencia deben implementarse. Este protocolo propone la integración de protocolos ampliamente usados a partir de muestras fecales para el análisis de datos. Este protocolo incluye un enfoque directo-PCR libre de columnas, que permite el manejo simultáneo y la extracción de ADN de un gran número de muestras fecales, junto con la amplificación por PCR de la región V4. Además, el protocolo describe la tubería análisis y proporciona un script usando la última versión de QIIME (QIIME 2 versión 2017.7.0 y DADA2). Este protocolo paso a paso está destinado a los interesados en iniciar el uso de productos de rRNA 16S que ordena de manera robusta, reproductiva, fácil de usar, detallada orientar a.

Figura 1muestra una ilustración esquemática del protocolo.
Forma prospectiva hemos recogido muestras de heces de pacientes hospitalizados con diarrea infecciosa sospechada. Las muestras fueron sometidas al laboratorio de microbiología clínica en el Sheba Medical Center entre febrero y mayo de 2015, como fue descrito previamente1. Muestras de heces fueron sometidas a cultivo m...

Este manuscrito describe un detallado protocolo estandarizado de secuenciación de amplicones de rRNA 16S de alto rendimiento. El protocolo presenta un protocolo integrado, uniformado, factible y de bajo costo a partir de la recolección de muestras fecales a través de análisis de datos. Este protocolo permite el análisis de un gran número de muestras con estándares rigurosos y varios controles.

Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

El objetivo general de esta secuenciación de amplicón de ARNr 16S de alto rendimiento es caracterizar la composición global del microbioma a partir de muestras fecales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la composición microbiana global asociada con muchos campos de interés, como el metabolismo, la digestión y la inflamación intestinal y sistémica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un censo de las comunidades microbianas aeróbicas y anaerobias presentes en la muestra fecal, incluyendo aquellas bacterias que son difíciles de cultivar.Este método puede manejar simultáneamente un gran número de muestras fecales gracias a la línea de bombeo de procesamiento rápido sin colon y dio como resultado una secuenciación robusta y reproducible de 16S rRNA-Amplicon. Para este protocolo, tenga muestras de heces congeladas que sean aproximadamente del tamaño de la goma de borrar de un lápiz. Las muestras deben almacenarse en tubos de dos mililitros con la punta recortada del hisopo de recolección.Incluya controles negativos que consistan en hisopos sin heces y controles internos de duplicados, y tenga duplicados de muestra de las heces originales de la

guided-protocol-for-fecal-microbial-characterization-16s-rrna

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Este video describe el protocolo de aislamiento de ADN de muestras de heces de ratones portadores de tumores de colon. El ADN extraído se amplifica mediante PCR y el producto se limpia aún más mediante un enfoque basado en perlas magnéticas. Este método se puede utilizar para determinar el efecto del enriquecimiento ambiental sobre la microbiota del colon y la mortalidad animal.

Aislamiento de ADN microbiano en heces: estudio del efecto del enriquecimiento ambiental en la diversidad del microbioma en un modelo de tumor murino

La caracterización de la comunidad microbiana ha sido un objetivo de larga data en microbiología ambiental. Los métodos de secuenciación de próxima generación ahora permiten la caracterización de comunidades microbianas a una profundidad sin precedentes con un costo y mano de obra mínimos. Detallamos aquí nuestro enfoque para secuenciar genes de ARN ribosómico 16S bacterianos utilizando un secuenciador de sobremesa.

La secuenciación de próxima generación de 16S ARN ribosomal genes Amplicones

Se describe un método eficiente y robusta, y rentable para la extracción de ácido nucleico a partir de hisopos para la caracterización de las comunidades bacterianas utilizando 16S rRNA secuenciación de genes de amplificación. El método permite un enfoque de procesamiento común para múltiples tipos de muestras y acomoda un número de procesos de análisis de aguas abajo.

Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

Aquí presentamos un protocolo de secuenciación de próxima generación para la secuenciación de rRNA 16S que permite la identificación y caracterización de comunidades microbianas en vectores. Este método implica la extracción de ADN, amplificación y código de barras de muestras mediante PCR, secuenciación en una celda de flujo y bioinformática para que coincida con los datos de la secuencia a la información filogenética.

Caracterización de microbioma marca Next-Generation 16S rRNA Amplicon ordenando

Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de la microbiota intestinal de la Colón in vitro, utilizando una serie de biorreactores que simulan las condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal.

La aplicación Advanced In Vitro cultivo tecnología para estudiar la Microbiota del intestino humano

Este protocolo describe un sistema in vitro de fermentación de cultivo por lotes de microbiota fecal humana, utilizando inulina (un prebiótico bien conocido y uno de los moduladores de microbiota más ampliamente estudiados) para demostrar el uso de este sistema en la estimación de efectos específicos de sobre la composición de la microbiota fecal y las actividades metabólicas.

Un modelo de cultivo por lotes In Vitro para estimar los efectos de los regímenes intervencionistas en la microbiota fecal humana

Aquí se describe un procedimiento operativo estándar simplificado para la elaboración de perfiles de microbiomas mediante la secuenciación y el análisis metagenómicos de 16S rRNA utilizando herramientas disponibles gratuitamente. Este protocolo ayudará a los investigadores que son nuevos en el campo del microbioma, así como aquellos que requieren actualizaciones sobre los métodos para lograr el perfilado bacteriano a una resolución más alta.

Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

Presentamos el proceso de aislamiento, propagación y caracterización de bacterias degradadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos. El protocolo describe el aislamiento bacteriano, la identificación mediante el método de ARNr 16S y las pruebas de su potencial de degradación de hidrocarburos. Este artículo ayudaría a los investigadores a caracterizar la biodiversidad microbiana en muestras ambientales y, específicamente, a detectar microbios con potencial de biorremediación.

Aislamiento, propagación e identificación de especies bacterianas con propiedades metabolizadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos

Pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano que se puede utilizar para identificar las especies bacterianas, discriminar las cepas bacterianas, y detectar las mutaciones genéticas que confieren resistencia a los agentes anti-microbianos. En este vídeo, se demostrará el procedimiento para la generación de amplicón microbiana, amplicón pirosecuenciación, y el análisis de secuencia de ADN.

Pyrosequencing para la identificación microbiana y caracterización

Aprenda a caracterizar el microbioma fecal mediante secuenciación de 16S rRNA. Este protocolo de alto rendimiento permite analizar comunidades aeróbicas y anaeróbicas, incluyendo bacterias difíciles de cultivar, de forma reproducible y rentable.

Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos

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