Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos

El objetivo general de esta secuenciación de amplicón de ARNr 16S de alto rendimiento es caracterizar la composición global del microbioma a partir de muestras fecales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la composición microbiana global asociada con muchos campos de interés, como el metabolismo, la digestión y la inflamación intestinal y sistémica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un censo de las comunidades microbianas aeróbicas y anaerobias presentes en la muestra fecal, incluyendo aquellas bacterias que son difíciles de cultivar.

Este método puede manejar simultáneamente un gran número de muestras fecales gracias a la línea de bombeo de procesamiento rápido sin colon y dio como resultado una secuenciación robusta y reproducible de 16S rRNA-Amplicon. Para este protocolo, tenga muestras de heces congeladas que sean aproximadamente del tamaño de la goma de borrar de un lápiz. Las muestras deben almacenarse en tubos de dos mililitros con la punta recortada del hisopo de recolección.

Incluya controles negativos que consistan en hisopos sin heces y controles internos de duplicados, y tenga duplicados de muestra de las heces originales de la muestra para que sirvan como control interno. Comience descongelando las soluciones de extracción y dilución a temperatura ambiente junto con las muestras fecales y las muestras de control. Una vez descongelado, agregue 250 microlitros de solución de extracción a cada tubo de muestra y mezcle las heces en la solución usando un vórtice.

En este punto, introduzca los controles negativos de solo búfer. A continuación, caliente las muestras durante 10 minutos en un baño de agua hirviendo. Después de la incubación en agua hirviendo, agregue 250 microlitros de solución de dilución a cada muestra y agite las muestras para mezclar.

A continuación, almacene los tubos de muestra a cuatro grados centígrados hasta que se pueda realizar la PCR. Configure las PCR en una estación de trabajo previa a la PCR que se haya limpiado de posibles contaminantes de ADN, como plantillas y amplicones. Etiquete los cebadores de acuerdo con su código de barras y dilúyalos en agua bidestilada hasta una concentración de 50 micromolares.

Guarde las existencias de imprimación diluida a menos 20 grados centígrados y descongélelas completamente antes de usarlas. Para cada muestra, prepare una placa de 96 pocillos para 32 reacciones por triplicado. Después de calentar a temperatura ambiente, diluya las alícuotas del cebador delantero y los 32 cebadores inversos a cinco micromolares para la PCR.

A continuación, prepare suficiente mezcla base de PCR para 100 reacciones. Combine 100 microlitros de cebador directo de cinco micromolares con un mililitro de mezcla maestra de PCR 2X y 400 microlitros de agua destilada doble. Agite esta mezcla y luego cargue 15 microlitros de esta mezcla en cada uno de los 96 pocillos.

A continuación, cargue conjuntos de tres pocillos cada uno con un microlitro de cebador inverso de cinco micromolares. Por lo tanto, cargue los 32 índices inversos diferentes en la placa. Luego, a cada plato se le añaden cuatro microlitros de la muestra de ADN extraída.

Esto se hace en un banco limpio. Ahora ejecute la PCR con una desnaturalización inicial de tres minutos seguida de 35 ciclos con un minuto de desnaturalización y arrodillándose a 55 grados centígrados y un minuto de extensión. Termina con una extensión final de 10 minutos.

Una vez completada la reacción, trabaje en un banco de trabajo dedicado después de la PCR. Allí, combine cada conjunto de productos de PCR por triplicado en un solo tubo para 60 microlitros por muestra. A continuación, ejecute cuatro microlitros de cada muestra en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio al 1%.

Los amplicones positivos aparecerán entre 375 y 425 pares de bases. Los controles negativos se muestran y se procesan junto con los amplicones positivos del estudio. Cuantifique las concentraciones de ADN de los productos de reacción positiva de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

A continuación, combine 500 nanogramos de ADN de cada uno de los productos en un solo tubo. Agite esta mezcla y luego agote 200 microlitros en un gel al 1% como antes. Ahora extrae las bandas del gel entre 375 y 425 pares de bases.

A continuación, prepare la biblioteca para la secuenciación. Mida la concentración utilizando un kit de detección de ADN bicatenario de alta sensibilidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante, seguido del uso de un kit de separación y análisis de alta sensibilidad. A continuación, diluye la biblioteca a siete picomolares y combínala de cuatro a uno con una biblioteca de controles.

Ahora que la muestra está lista para la secuenciación, transfiérala a la máquina de secuenciación. El método descrito para la preparación de una biblioteca a partir de muestras de heces se utilizó para analizar el microbioma de pacientes hospitalizados con sospecha de diarrea infecciosa. Paralelamente, las muestras de heces también se sometieron a un cultivo tradicional en un laboratorio de microbiología.

Se secuenciaron muestras de heces de adultos sanos para su comparación. Se incluyeron varias muestras de control negativo, PCR sin plantilla, PCR en hisopos limpios y estériles en solución de extracción y dilución y PCR en soluciones mixtas de extracción y dilución. Cada uno de ellos tuvo menos de 118 lecturas totales, que fueron principalmente taxones de Mycoplasma.

Las muestras estándar promediaron más de 10.000 lecturas sin identificación de Mycoplasma después del control de calidad. La consistencia y variabilidad de las muestras se midió utilizando 16 muestras de heces preparadas con dos cebadores con códigos de barras diferentes para construir dos bibliotecas diferentes a partir de cada muestra. La mitad de las muestras fueron positivas para Campylobacter salmonella o Shigella en la técnica de cultivo tradicional.

Utilizando los resultados de la secuenciación 16S, un gráfico de área a nivel de filo muestra la consistencia entre las bibliotecas hechas de las mismas muestras, independientemente de los resultados del cultivo tradicional. A partir de este grupo de 16 muestras pareadas, el análisis de coordenadas principales reveló que los pares de muestras están estrechamente alineados y que las muestras de cultivo positivas tenían un valor de PC1 significativamente diferente al de las muestras de cultivo negativas. Un análisis más detallado de las muestras reveló que solo se encontraron altos niveles de Proteobacteria en los pacientes hospitalizados.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo procesar simultáneamente una gran cantidad de muestras fecales utilizando una extracción de ADN sin colon y PCR para generar bibliotecas de secuenciación con código de barras de la región de la variable microbiana V4. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar en un entorno organizado y limpio, especialmente al preparar las bibliotecas. No olvide que trabajar con muestras de heces humanas es peligroso y siempre se debe usar equipo de protección personal mientras se realiza este procedimiento.