4.11: Ultracentrifugación con gradiente de densidad

La ultracentrifugación en gradiente de densidad es un enfoque común para aislar y purificar estructuras celulares para experimentos bioquímicos. La técnica utiliza una centrífuga de alta velocidad, o ultra, para separar de forma no destructiva los componentes celulares en un gradiente de densidad. Este video describe los principios de la ultracentrifugación en gradiente de densidad, proporciona un procedimiento general utilizando un gradiente de sacarosa y analiza algunas aplicaciones.

Comencemos examinando los principios de las ultracentrífugas y los gradientes de densidad. Una suspensión contiene partículas en un disolvente líquido. Debido a la gravedad, las partículas más densas que el disolvente se sedimentan, mientras que las menos densas que el disolvente flotan. Cuanto mayor sea la diferencia de densidad entre la partícula y el disolvente, más rápida será la separación.

Una ultracentrífuga contiene una unidad llamada rotor, que gira a velocidades muy controladas, simulando un fuerte campo gravitatorio. Dentro de este campo, las diferencias de densidad entre las partículas y el disolvente se magnifican.

La fuerza del campo depende de la velocidad de rotación. Incluso un rotor pequeño a una velocidad de rotación relativamente baja puede crear una fuerza miles de veces más fuerte que el campo gravitatorio de la Tierra.

Si un tubo contiene varios líquidos de diferentes densidades, la centrifugación los mantendrá en capas separadas en orden de densidad, con el líquido más denso más cerca de la base. Tal estratificación de múltiples líquidos se denomina "gradiente de densidad". Hay dos tipos. En los gradientes escalonados, los líquidos de densidad decreciente se superponen cuidadosamente. En gradientes continuos, los líquidos se mezclan en proporciones variables, por lo que la densidad disminuye suavemente desde la base hacia arriba.

Los orgánulos celulares se pueden separar mediante un gradiente escalonado, a través de la "centrifugación en gradiente de densidad isopícnica". Este es el procedimiento de centrifugación más simple y común.

Este procedimiento se utiliza para separar las estructuras celulares. Cuanto más denso es el orgánulo, más desciende, con las mitocondrias en la parte superior y los ácidos nucleicos en la parte inferior.

Ahora que conoces los principios detrás de la técnica, veámosla en el laboratorio.

Antes de iniciar el procedimiento, se deben anotar las clasificaciones de velocidad y densidad del fabricante, y se debe verificar que la ultracentrífuga no esté corroída. Este procedimiento utiliza un rotor de cubeta oscilante.

En primer lugar, el material celular se prepara homogeneizando las células, lo que libera sus orgánulos de forma no destructiva. El homogeneizado puede fraccionarse mediante centrifugación preliminar a baja velocidad, para eliminar los componentes de baja densidad. A continuación, se preparan las soluciones de sacarosa.

La sacarosa se añade en cantidades crecientes para que cada solución esté más concentrada y, por lo tanto, sea más densa que la anterior. Las densidades exactas de las soluciones dependerán de los componentes a separar, que varían entre organismos. Las soluciones deben tener densidades entre las de los componentes a separar, siendo la última solución más densa que el componente más denso del analito. Las técnicas para separar componentes más densos que la sacarosa, como los ácidos nucleicos, se describen en las aplicaciones.

El gradiente de sacarosa ahora se crea en un tubo de centrífuga limpio. Se utiliza una pipeta para extraer la solución de sacarosa más concentrada. Con el tubo en posición vertical, la punta de la pipeta se coloca en lo alto de la pared y el líquido se dispensa de forma constante. Es importante que el área de trabajo se mantenga libre de vibraciones y otras perturbaciones.

Después de reemplazar la punta, las soluciones restantes se agregan en orden decreciente de densidad. Se dispensan con cuidado para formar capas distintas y evitar mezclarse. Finalmente, se agrega aproximadamente medio mililitro de la muestra celular sobre el gradiente y se pesa el tubo. Esto se utiliza para equilibrar la distribución del peso, el siguiente paso del proceso.

La centrifugación debe comenzar lo antes posible. El tubo se coloca en el rotor, que luego se equilibra colocando soluciones en blanco de igual peso en ranuras opuestas. El rotor se coloca en la ultracentrífuga y el sistema se sella. La temperatura y la velocidad y el tiempo de rotación están establecidos. Los valores típicos son 4 ? C con una fuerza de más de 100.000 x g durante 16 h.

Después de la centrifugación, el tubo se retira del rotor, teniendo cuidado de mantenerlo en posición vertical y sin perturbaciones. Los diferentes componentes celulares se han fraccionado en bandas discretas entre las capas de solución. Las fracciones se pueden recoger con una jeringa. Alternativamente, se puede perforar el fondo del tubo con una aguja fina esterilizada y recoger el flujo de salida en tubos estériles. Los componentes celulares ahora han sido aislados. Se pueden almacenar a -80 ?C.

Ahora que hemos visto el procedimiento básico, veamos algunas aplicaciones.

Una aplicación típica es el aislamiento de complejos multiproteicos en células vegetales. En este ejemplo, los complejos responsables del flujo cíclico de electrones se están aislando del tilacoide, el sitio de la reacción de la luz en la fotosíntesis. Este procedimiento utiliza soluciones discretas de 14 a 45% de sacarosa. La centrifugación ocurre a más de 100.000 x g durante 14 h a 4 ?C.

Debido a que los ácidos nucleicos son más densos que la sacarosa, la centrifugación isopícnica no puede separarlos de los orgánulos de forma no destructiva.

Se utiliza una técnica diferente, conocida como "centrifugación zonal". Separa los orgánulos en función de sus tasas de sedimentación, que dependen no solo de sus densidades, sino también de sus conformaciones. Se utiliza un degradado continuo para separar los componentes en función de esta propiedad.

Los pasos procesales son similares a los de los casos isopícnicos. En este ejemplo, los complejos ARN-ribosoma se aíslan utilizando un gradiente continuo del 5% al 20%, centrifugados a 230.000 x g. La centrifugación se interrumpe después de unas horas para evitar la coprecipitación.

Las hebras de ácido nucleico se pueden separar entre sí en función de la densidad.

Esto se debe a que las hebras ricas en guanina y citosina son más densas que las ricas en adenina y tiamina. En este caso, el gradiente no puede estar hecho de sacarosa, porque la sacarosa es menos densa que los ácidos nucleicos. En su lugar, se utilizan gradientes de cloruro de cesio, normalmente de 1,65 a 1,75 g/mL, ya que tienen suficiente densidad y una baja viscosidad.

Aquí vemos que el ADN del plancton se purifica utilizando un gradiente continuo de cloruro de cesio. La centrifugación se produce a más de 1.000.000 x g durante 18 h al vacío.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la ultracentrifugación con un gradiente de densidad de sacarosa. Ahora debería comprender cómo funciona un gradiente de densidad, cómo construir un gradiente escalonado y cómo cargar y operar una ultracentrífuga. ¡Gracias por mirar!