Name: Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a cuantificar microARN plasmáticos en monos cangrejeros mediante RT-qPCR en tiempo real. Este método permite detectar niveles bajos de expresión y comparar resultados entre estudios para investigación biomarcadora.

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Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de organismos de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro.

Todos los experimentos fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Daiichi Sankyo Co., Ltd.
1. preparación de la muestra
<ol><li>Recoger la sangre (menos de 0,5 mL) de la vena femoral de monos cangrejeros en tubos con EDTA 2K que contiene. Nota: El citrato y heparina no son aceptables porque estos anticoagulantes inhiben la posterior PCR14,15.</li>
	<li>Coloque las muestras colectadas inmediatamente en hielo y proceso para el aislamiento del plasma dentro de 2 horas de la recolección.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 10.000 x g a 4 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un microtubo 2 mL, seguido de centrifugación a 16.000 x g a 4 ° C por 5 min eliminar restos de células y plaquetas residuales. Nota: La cuantificación de miRNAs puede ser afectada significativamente por plaquetas contaminación16.</li>
	<li>Coloque 200 alícuotas μl del sobrenadante en frescos 2 mL-microtubos y almacenar a-80 ° C hasta su uso. Nota: Un volumen fijo de cada muestra se utiliza para la extracción de RNA; por lo tanto, el volumen de la alícuota debe ser exacto.</li>
</ol>2. extracción de RNA
<ol><li>Descongelar las muestras congeladas en el hielo (de paso 1.5).<ol>
<li>Mantener muestra frío en hielo durante la extracción de RNA. Enfriar el reactivo de lisis y cloroformo en antes hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 5 volúmenes (1000 μL) de reactivo de lisis, que contenga solución monofásica de fenol y guanidina isotiocianato, a la muestra (200 μL) y mezcla vigorosamente con un vórtex durante 1 minuto.</li>
	<li>Añadir 5 μl de 5 nM sintético miRNA de Caenorhabditis elegans (Syn-cel-miR-238-3 p).</li>
	<li>Agregar 1 volumen (200 μL) de cloroformo y mezclar vigorosamente con Vortex durante 1 minuto.</li>
	<li>Mantener en hielo durante 2 a 3 minutos y luego centrifugar las muestras a 12.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos.</li>
	<li>Transferir la fase acuosa con cuidado a un nuevo microtubo. Nota: No transfieren de la fase orgánica (rojo) o interfase (blanco). El volumen de la fase acuosa recogido debe ser uniforme para evitar manejo de inconsistencia, que resulta en la mayor variación técnica. La cantidad habitual de fase acuosa transferido en este protocolo era 650 μl.</li>
	<li>Añadir 1,5 volúmenes (975 μL) de etanol y mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
	<li>Transferir la muestra en una columna correspondiente y el adaptador, seguido del secado al vacío durante 3 minutos usando colectores de vacío. Si el volumen de muestra es de más de 700 μl, repita este paso para procesar la solución restante. Nota: Aislamiento de RNA base de columna es compatible con el método de vacío y centrifugación.</li>
	<li>Añadir 200 μL de etanol a la columna, seguida del secado al vacío durante 1 minuto.</li>
	<li>Añadir 800 μl de tampón de RCV a la columna, seguida del secado al vacío durante 2 minutos.</li>
	<li>Añadir 800 μl de tampón RPE a la columna, seguida del secado al vacío durante 2 minutos.</li>
	<li>Repita el paso 2.11.</li>
	<li>Añadir 300 μL de etanol a la columna, seguida del secado al vacío durante 1 minuto.</li>
	<li>Coloque la columna a un nuevo microtubo y centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) durante 1 minuto.</li>
	<li>La columna de la transferencia a un nuevo microtubo y añadir 50 μl de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Reposar a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) por 3 minutos y centrifugar a 8.000 × g a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) durante 1 minuto.</li>
	<li>Vuelva a aplicar el eluido de la columna.</li>
	<li>Repita el paso 2.16 y almacenar eluido a-80 ° C hasta su uso.</li>
</ol>3. síntesis de cDNA
<ol><li>Descongelar las muestras congeladas (de paso 2.18).</li>
	<li>
Preparar una concentración conocida de oligonucleótidos sintéticos de RNA que corresponden al objetivo miRNAs.
	<ol>
<li>Uso de oligonucleótidos sintéticos de RNA para generar una curva estándar en qPCR. Solución madre de concentración de 1 x 108 copia/μl está preparado para propósitos de almacenamiento.</li>
		<li>Diluir la solución madre 10 veces para obtener 1 x 107 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o solución de trabajo de 1 x 105 copia/μl (muestras previamente amplificadas) como la concentración más alta para la construcción de la curva estándar. En general, un rango sugerido para las concentraciones de la curva estándar es 1 x 107 a 1 x 102 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o 1 x 105 a 1 x 100 copia/μl (muestras previamente amplificadas).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar piscina de cartilla de multiplex RT mezclando volúmenes iguales de 20 cartillas de RT x para destino miRNAs. Nota: Como se muestra en la figura 2, una piscina que contiene hasta 4 objetivo miRNAs se puede hacer mezclando los cebadores de RT 20 x de cada uno de los miRNAs en la piscina. Cel-miR-238 (control externo) debe ser incluido como uno de los miRNAs de destino en cada tubo. En caso de menos de 4 objetivo miRNAs, añadir volúmenes iguales de buffer TE de 1/10 en vez de 20 x RT la cartilla.</li>
	<li>Preparar la mezcla de reacción RT: 3 μl de cebador RT piscina (desde el paso 3.3), 0,15 μl de dNTPs 100 mM con dTTP, 1 μl de transcriptasa reversa (50 U/μL), 1,5 μl 10 x buffer de RT, 0.19 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL) y 4.16 μl de nucleasa-libre del agua.</li>
	<li>Mezclar 10 μl de la reacción de RT mezclar con 5 μl de la muestra de RNA (de paso 3.1) u oligonucleótidos (del paso 3.2) transfiriendo e incubar en hielo durante 5 minutos.</li>
	<li>Ejecutar la reversa de la transcripción en un aparato termociclador: 16 ° C por 30 min, 42 ° C por 30 min, seguida por un paso de inactivación definitiva de la transcriptasa inversa a 85 ° C por 5 min muestras transcritas atrás de tienda a-80 ° C hasta su uso.</li>
</ol>4. preamplificación (opcional)
Nota: Los miRNAs que muestran los valores de Cq por encima de 35 o más en qPCR posteriores son pre amplificados.
<ol><li>Descongelar las muestras congeladas (del paso 3.6).</li>
	<li>Hacer diluciones seriadas 10 veces del producto de RT de oligonucleótidos sintéticos de RNA; 1 x 10-5 a 1 x 100 copia/μL para generar la curva estándar.</li>
	<li>Preparar piscina de primer ensayo multiplex mezclando volúmenes iguales (5 μl) de 20 x cartillas análisis miRNAs de destino con la concentración final de cada cartilla de ensayo está diluyendo 200-fold de búfer en un volumen final de 1000 μl de TE. Nota: Los iniciadores de análisis cuyo objetivo miRNAs puede ser detectable en qPCR posterior sin la amplificación y los cel-miR-238 (control externo) no se incluyen en la piscina de la cartilla.</li>
	<li>Preparar la mezcla de reacción de amplificación previa: 12,5 μl de 2 x listo para su uso reactivo preamplification, 3,75 μl de piscina de primer ensayo (de paso 4.3) y 6,25 μl de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Mezcla 22,5 μl de la reacción de amplificación previa mezclar con 2,5 μl de muestra transcripción inversa (del paso 4.1) o de oligonucleótidos (del paso 4.2) transfiriendo e incubar en hielo durante 5 minutos.</li>
	<li>Ejecutar la reacción en un aparato termociclador: 95 ° C por 10 min; seguido de 12 ciclos de 95 ° C por 15 s y 60 ° C durante 4 min. almacenan muestras previamente amplificadas a-80 ° C hasta su uso.</li>
</ol>5. cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)
<ol><li>Descongelar las muestras congeladas (de paso 3.6 o paso 4.6).</li>
	<li>Diluir las muestras 5 veces con agua estéril.</li>
	<li>Preparar diluciones seriadas 10 veces del producto RT derivado de oligonucleótidos sintéticos de RNA; 1 x 107 a 1 x 102 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o 1 x 105 a 1 x 100 copia/μl (muestras previamente amplificadas) para la generación de curvas estándar.</li>
	<li>Preparar la mezcla de reacción de qPCR: 10 μl de 2 x reactivo de amplificación listo para su uso, 1 μl de 20 x reactivo de ensayo, que contiene la cartilla de la polimerización en cadena y sonda correspondiente a miRNA blanco, avance/retroceso y 7 μl de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Transferencia 18 μL de la mezcla de reacción de qPCR para las placas de reacción de 96 pocillos rápido óptico y añadir 2 μl de muestras diluidas (de paso 5.2 o 5.3 de paso) en los pocillos. Nota: Las muestras y estándares para qPCR se configuran por duplicado.</li>
	<li>Selle la placa con la película adhesiva y centrifugar brevemente.</li>
	<li>Ejecutar la reacción en un termociclador en tiempo real: 95 ° C por 20 s, seguido por 45 ciclos de 95 ° C para 1 s y 60 ° C por 20 s.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Calcular el número de copia cruda de cada muestra utilizando el software de análisis de datos que trabaja con correspondiente termociclador en tiempo real. Nota: Línea de umbral se establece manualmente en "1.0" en todas las placas en el estudio, para confirmar la reproducibilidad en comparación con sus vales de Cq. Nivel de corte se fija en Cq > 40 ciclos.</li>
	<li>Calcule el promedio del número de copia cruda de cada muestra de duplicados.</li>
	<li>Calcular el factor de corrección dividiendo un número de copia del cel-miR-238 en cada muestra el promedio de número de copia del cel-miR-238 de todas las muestras en un tubo correspondiente. Nota: Como se muestra en la figura 2, cada tubo contiene hasta 4 miRNAs de destino incluyendo cel-miR-238 (control externo). Por lo tanto, el factor de corrección se calcula para cada tubo utilizando el correspondiente valor de la cel-miR-238.</li>
	<li>Calcular el número de copia ajustada al dividir el número de copia cruda promedio de cada muestra (de paso 6.2) por el factor de corrección (de paso 6.3) para cada muestra.</li>
	<li>Calcular el número de copia absoluto multiplicando el número de copia cruda ajustada de cada muestra (de paso 6.4) por el el factor de dilución para cada muestra. Nota: El factor de dilución es "5" en el presente Protocolo, que se deriva de paso 5.2.</li>
	<li>Calcular la eficiencia de amplificación por PCR de la pendiente de la parcela de los valores de Cq para cada dilución serial contra concentración de cDNA de registro. Nota: Fórmula para el cálculo de la eficiencia; E = (10(-1/pendiente) -1) x 100%.</li>
	<li>Calcular la variación técnica utilizando los valores de Cq de cel-miR-238 de todas las muestras mediante la fórmula E = (eficacia de la amplificación de 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Nota: Los pasos 6.5 y 6.7 se utilizan para la evaluación de la calidad del procedimiento.</li>
</ol>

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</ol>

El autor no tiene ningún conflicto de interés que revelar.

Nuestra evaluación completa proporciona un análisis estadístico más riguroso de la amplitud de la gama dinámica, que indica claramente que la magnitud de la variación entre muestras individuales fue muy diferente entre los miRNAs probado. Aunque estas variaciones pueden atribuirse a sus pequeñas cantidades en los fluidos corporales, debe señalarse que estos datos reflejan no sólo las variaciones biológicas, sino también variaciones técnicas. La mayoría de la variación de la técnica puede ser evaluada mediante valores de ...

Un creciente número de estudios ha sido explorar microRNAs (miRNAs) como biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de los cánceres, o supervisión y detección de otras enfermedades en estudios clínicos y no clínicos1,2,3 . Cuantitativa en tiempo real transcripción reversa PCR (RT-qPCR) es uno de los métodos más comunes utilizados para evaluar miRNAs del destino individual, porque esta técnica es más sensible de microarray4 y la secuencia de RNA a partir de plataformas5. En general, expresión de miRNA se mide en relación con una muestra de referencia utilizando el método de ΔCq6. Este enfoque es apropiado para la investigación de los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, la cuantificación relativa de miRNAs en circulación ha limitado utilidad debido a sus pequeñas cantidades. Además, la variación técnica hace difícil comparar los resultados de diferentes estudios, ya que diferentes laboratorios personalizar los protocolos experimentales de RT-qPCR diferentemente, que conduce a incompatibles o incluso contradictorios resultados de diferentes estudios7.
En vista de las preocupaciones mencionadas, cuantificación absoluta podría ser más adecuada para la evaluación de las cantidades pequeñas de miRNAs en los fluidos corporales. El método de cuantificación absoluta utiliza una curva estándar generada a partir de concentraciones conocidas de oligonucleótidos sintéticos de RNA que son idénticas en secuencia para el correspondiente destino miRNA8. La salud y el Instituto de ciencias ambientales (HESI) Comité técnico de genómica recientemente llevado a cabo estudios exhaustivos para comparar los resultados de medidas absolutas de miRNAs de plasma, a través de múltiples sitios de prueba. Los resultados mostraron que utilizando un protocolo estándar para la cuantificación absoluta de miRNAs produjo resultados comparables a través de la prueba de múltiples sitios9. El método de ensayo de RT-qPCR que se describe en el presente estudio es casi idéntico al protocolo estándar de HESI, que incluye análisis multiplexado de múltiples objetivos de miRNA y la amplificación para la detección de baja expresión de miRNAs.
En este estudio, recoge un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50) fue utilizado10. El siguiente protocolo describe el procedimiento para la preparación de las muestras de plasma, extracción de miRNA y RT-qPCR, incluyendo la amplificación. Lo más importante, información técnica adicional sobre el protocolo se ha incluido, por lo que la cantidad de miRNAs de blanco en las muestras puede ser validada en combinación con un proceso bien calificado. En primer lugar, la curva estándar de cada miRNA se validó su rango de detección individual, antes de su cuantificación en muestras biológicas. En segundo lugar, la calidad de la metodología actual se evaluó exhaustivamente mediante valores de Cq de un control externo (cel-miR-238). Por lo tanto, esta plataforma proporciona datos más informativos y confiables para comparar resultados de diferentes estudios o laboratorios.
Los perfiles de 8 miRNAs se han incluido en este informe como resultados representativos por el método de ensayo descrito aquí. Estos miRNAs se han propuesto como biomarcadores potenciales de seguridad asociaron con lesión del tejido del hígado (miR-122 y miR-192), corazón (miR-1, miR-208a, 208b miR y miR-499a) y músculo esquelético (miR-133a y miR-206) en roedores y seres humanos3, 11,12,13.

<table><tbody><tr><td>Tubo BD Microtainer (K2EDTA)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>365974</td><td>Para la extracción de sangre</td></tr><tr><td>Tubos de PCR Eppendorf, 0,2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030124359</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos de ensayo Eppendorf Safe-Lock micro de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos de ensayo Safe-Lock de 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótido sintético</td><td>Hokkaido System</td> <td>Science-Individual</td> <td>miRNA (0.2 &mu; mol, grado de HPLC)</td></tr> <tr><td>Tampón Tris-EDTA &nbsp; (pH 8.0)</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td>Tampón TE Tampón</td></tr><tr><td>RPE</td><td>QIAGEN-Contenido</td><td></td> <td>en miRNeasy mini kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón RWT</td><td>QIAGEN-Contenido</td><td></td> <td>en miRNeasy mini kit&nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN 217004</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua Libre de Nucleasas&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reactivo</td><td>QIAGEN-Contenido</td><td></td> <td>en miRNeasy mini kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>219600</td><td>ID: MSY0000293, 5 nmol</td></tr><tr><td>Adaptadores SC</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>S0120</td><td>Para extracción de ARN</td></tr><tr><td>VacEZor 36 Sistema completo</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>M3610</td><td>Para extracción de ARN</td></tr><tr><td>7900HT Sistema rápido de PCR en tiempo real</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4351405</td> sistema rápido de PCR GeneAmp <td>en bloque de 96 pocillos</td></tr><tr><td>9700</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>9700</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>Película adhesiva óptica MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4311971</tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4444557</tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (cel-miR-238-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 000248</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-122-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 002245</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-133a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 002246</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-1-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 002222</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-192-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 000491</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-206)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 000510</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-208a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 000511</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-208b-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 002290</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-499a-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 001352</td></tr><tr><td>Kit de transcripción TaqMan MicroRNA Reverse Thermo</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4366597</tr><tr><td>Mezcla maestra de preamplificación TaqMan (2&veces;)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4391128</tr><tr><td>Cloroformo&nbsp;</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>035-02616</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99.5)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación absoluta de plasma niveles de microarn en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa pcr

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR es uno de los métodos más comunes para evaluar objetivo individual miRNAs. Generalmente se miden los niveles de MiRNAs en relación con una muestra de referencia. Este enfoque es apropiado para examinar los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, cuantificación absoluta usando mejor el análisis estadístico es preferible para una evaluación integral de los niveles de expresión génica. Cuantificación absoluta está todavía no de uso común. Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de plasma miRNA, usando RT-qPCR con o sin la amplificación.
Se preparó un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50). ARN total fue extraído usando sistema comercialmente disponible. MiRNAs de plasma fueron cuantificados por análisis de RT-qPCR basada en sondeos que contiene la sonda y miRNA-específico-reversa PCR primer. Curvas estándar para cuantificación absoluta se generaron usando oligonucleótidos sintéticos disponibles en el mercado del RNA. Un sintético cel-miR-238 fue utilizado como un control externo para la evaluación de normalización y calidad. Los miRNAs que mostró cuantificación ciclo (Cq) valores por encima de 35 se pre amplificados antes el paso de la qPCR.
Entre los 8 miRNAs examinados, miR-122, miR-133a y miR-192 eran detectables sin la amplificación, mientras que 499a miR, miR-1 y miR-206 requieren la amplificación debido a sus niveles de baja expresión. MiR-208a y 208b miR no eran perceptibles aún después de la amplificación. Eficacia de la muestra fue evaluada por los valores de Cq de la cel-miR-238 con picos. En este método de ensayo, variación técnica era estimada para ser menos 3-fold y el límite inferior de cuantificación (LLOQ) 102 copia/μl, para la mayoría de los miRNAs examinados.
Este protocolo proporciona una mejor estimación de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación de la calidad de los correspondientes datos de diferentes estudios. Teniendo en cuenta que el bajo número de miRNAs en los fluidos corporales, la amplificación es útil para mejorar la detección de mal expresado miRNAs.

Flujo de trabajo de análisis de miRNA por RT-qPCR y calidad assessment La figura 1 muestra el flujo de trabajo de miRNA análisis de muestras de sangre usando qPCR10. La calidad de los experimentos puede ser verificada mediante la inclusión de cel-miR-238 como un control externo. Esto revelará las variaciones técnicas en la extracción de RNA y RT-qPCR posteriores procesos. En este estudio, la media ± SD de l...

Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de miRNA plasma, mediante la transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR con o sin la amplificación. Este protocolo permite la mejor comprensión de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación cualitativa de los correspondientes datos de diferentes estudios o laboratorios.

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los niveles absolutos de microARN plasmáticos mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa en tiempo real. Este método puede ayudar a evaluar la cantidad de microARN plasmáticos, incluso si su nivel de expresión es bajo. La principal ventaja de esta técnica es que los datos medidos se pueden comparar con otros de diferentes estudios o laboratorios.Las implicaciones de esta técnica se extienden a las muestras de otras especies, ya que se puede generar una curva estándar utilizando el ARN sintético o el nucleótido. Este método puede proporcionar información sobre la investigación traslacional para investigar biomarcadores de seguridad prometedores. Primero, descongele las muestras de plasma congelado obtenidas de la vena femoral de los monos Cynomolgus en hielo.Transfiera el reactivo de lisis en cloroformo sobre hielo para enfriarlo antes de la extracción del ARN. A continuación, agregue 1.000 microlitros de reactivo de lisis a 200 microlitros de la muestra. Y vórtice durante un minuto para garantizar una mezcla adecuada.A continuación, añada a la muestra cinco microlitros de microARN sintético de Caenorhabditis elegans y 200

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Investigación

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Biología

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

La microglía se macrófagos residentes que proporcionan la primera línea de defensa y de vigilancia inmune del sistema nervioso central. Los microARN son moléculas reguladoras que juegan un papel importante en muchos procesos fisiológicos, incluida la activación y diferenciación de los macrófagos. En este artículo se describe el método para la medición de los microRNAs en la microglía.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

MicroRNAs circulantes han surgido recientemente como biomarcadores prometedores y novedosos para varios tipos de cáncer y otras enfermedades. El objetivo de este artículo es discutir tres plataformas basados ​​en sondas diferentes en tiempo real PCR y métodos que están disponibles para cuantificar y determinar la abundancia de microRNAs en circulación.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Se describe un método sensible y preciso para la cuantificación de microRNAs libres de células utilizando una química basada en colorantes y tecnología de PCR digital en gotas.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Aquí presentamos un protocolo para la detección de la expresión de microRNA en la membrana peritoneal de rata mediante la cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real. Este método es adecuado para estudiar el perfil de expresión de microARN en la membrana peritoneal de rata en varias condiciones patológicas.

Detección de la expresión de microARN en la membrana peritoneal de ratas mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Descrito es una metodología para cuantificar la expresión de 96 genes y 18 proteínas de la superficie de células ex vivo, lo que permite la identificación de diferencialmente expresan genes y proteínas en células virus-infectadas en comparación con las células no infectadas. Aplicamos el enfoque de estudio CD4 infectados por SIV+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India.

Sola célula cuantificación del mRNA y la expresión de la proteína de superficie de CD4 infectados por el Virus de la inmunodeficiencia de los simios+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India

MicroRNAs circulación han demostrado promesa como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares y los infartos agudos de miocardio. En este estudio, se describe un protocolo para la extracción de miRNA, transcripción inversa y PCR digital para la cuantificación absoluta de miRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular.

Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares

Presentamos un protocolo para evaluar los niveles de expresión de microRNAs (miRNAs) que circulan en las muestras de plasma de pacientes con cáncer. En particular, se utilizó un kit disponible comercialmente para la extracción de miRNA y transcripción reversa de la circulación. Por último, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados usando las placas personalizadas de sonda previamente manchado en tiempo real.

Detección de un Panel personalizado de microARN circulantes en pacientes con cáncer colorrectal metastásico

Aquí, se presenta un protocolo cuantitativo en tiempo real basado en la reacción en cadena de la polimerasa para la determinación del contenido nativo de microARN (absoluto/relativo) de las partículas de lipoproteína. Además, se demuestra un método para aumentar el nivel de microARN, así como un método para determinar la tasa de captación celular de las partículas de lipoproteínas.

Enriquecimiento de partículas de lipoproteínas nativas con microRNA y determinación posterior de su contenido absoluto/relativo de microRNA y su tasa de transferencia celular

Describimos un método para evaluar la expresión del microRNA en los riñones de ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO) mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. Este protocolo es adecuado para el estudio de perfiles de expresión de microARN renal en ratones con UUO y en el contexto de otras condiciones patológicas.

Evaluación cuantitativa de PCR en tiempo real de expresiones de microARN en riñón de ratón con obstrucción ureteral unilateral

Aprende a cuantificar microARN plasmáticos en monos cangrejeros mediante RT-qPCR en tiempo real. Este método permite detectar niveles bajos de expresión y comparar resultados entre estudios para investigación biomarcadora.

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR (Video) | JoVE Journal

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

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