Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

El objetivo general de este procedimiento es medir los niveles absolutos de microARN plasmáticos mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa en tiempo real. Este método puede ayudar a evaluar la cantidad de microARN plasmáticos, incluso si su nivel de expresión es bajo. La principal ventaja de esta técnica es que los datos medidos se pueden comparar con otros de diferentes estudios o laboratorios.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a las muestras de otras especies, ya que se puede generar una curva estándar utilizando el ARN sintético o el nucleótido. Este método puede proporcionar información sobre la investigación traslacional para investigar biomarcadores de seguridad prometedores. Primero, descongele las muestras de plasma congelado obtenidas de la vena femoral de los monos Cynomolgus en hielo.

Transfiera el reactivo de lisis en cloroformo sobre hielo para enfriarlo antes de la extracción del ARN. A continuación, agregue 1.000 microlitros de reactivo de lisis a 200 microlitros de la muestra. Y vórtice durante un minuto para garantizar una mezcla adecuada.

A continuación, añada a la muestra cinco microlitros de microARN sintético de Caenorhabditis elegans y 200 microlitros de cloroformo. Agite la muestra durante un minuto para que se mezcle correctamente. Luego, coloque la muestra en hielo durante dos o tres minutos.

A continuación, centrifugar la muestra a 12.000 G, durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera con cuidado 650 microlitros de la fase acuosa a un nuevo microtubo. A continuación, añada 975 microlitros de etanol a la fase acuosa y pipetee varias veces para asegurar una mezcla completa.

Transfiera la muestra a la columna y el adaptador correspondientes y luego seque al vacío durante tres minutos usando colectores de vacío. Luego agregue 200 microlitros de etanol a la columna y seque al vacío durante un minuto. Después del secado al vacío, agregue 800 microlitros de tampón RWT a la columna y, nuevamente, seque al vacío durante dos minutos.

A continuación, añada 800 microlitros de RPE Buffer a la columna y seque al vacío durante dos minutos. Agregue el tampón RPE dos veces, seguido de un secado al vacío. A continuación, agregue 300 microlitros de etanol a la columna.

Después de agregar etanol, seque al vacío durante un minuto. A continuación, transfiera la columna a un nuevo microtubo y centrifugue el mismo a 12.000 G a temperatura ambiente durante un minuto. Después de la centrifugación, transfiera la columna a un nuevo microtubo y agregue 50 microlitros de agua sin nucleasa.

Deje reposar la columna a temperatura ambiente durante tres minutos y luego centrifuga a 8.000 G a temperatura ambiente durante un minuto. Finalmente, almacene el eluido a menos 80 grados centígrados hasta su uso. Para preparar una concentración de oligonucleótidos de ARN sintético que corresponda al microARN objetivo, diluya la solución madre 10 veces para lograr una solución de trabajo con la concentración más alta para trazar las curvas estándar.

A continuación, para constituir un grupo múltiplex de cebadores de transcripción inversa, mezcle volúmenes iguales de los cebadores de 20 concentraciones para los microARN diana. A continuación, prepare la mezcla de reacción de transcripción inversa. A continuación, añada 10 microlitros de mezcla de reacción de transcripción inversa a cinco microlitros de muestra de ARN.

Mezcle los dos pipeteando varias veces. Luego, incuba la mezcla en hielo durante cinco minutos. Después de colocar la muestra en el termociclador, inicie el ciclo.

Una vez finalizado el programa, almacene la muestra transcrita inversa a menos 80 grados centígrados. Para constituir el grupo de cebadores de ensayo multiplex, agregue volúmenes iguales de cinco microlitros de cebadores de ensayo correspondientes a microARN objetivo en el tubo que contiene tampón Tris-EDTA en el volumen final de 1.000 microlitros. A continuación, constituya la mezcla de reacción de preamplificación.

Una vez que la mezcla de reacción esté lista, transfiera 22,5 microlitros de mezcla de reacción de preamplificación a dos coma cinco microlitros de muestra transcrita inversa. A continuación, pipetear para mezclar la muestra y la preamplificación maestra mezclar bien e incubar en hielo durante cinco minutos y luego dejar los tubos de PCR en el termociclador y comenzar la ejecución. Una vez finalizado el programa, transfiera todas las muestras a menos 80 grados centígrados.

Después de descongelar las muestras preamplificadas o no preamplificadas, diluya cinco veces con agua estéril. Para generar la curva estándar, realice una dilución en serie de 10 veces de las muestras derivadas de oligonucleótidos de ARN sintéticos. A continuación, constituyen la mezcla cuantitativa de la reacción PCR en un tubo mantenido en hielo.

A continuación, añada 18 microlitros de la mezcla de reacción cuantitativa de PCR a las placas de reacción óptica rápida de 96 pocillos. Luego agregue dos microlitros de las muestras diluidas en los pocillos. Después de sellar la placa con una película adhesiva, centrifugar brevemente la muestra a 500 G durante 15 segundos.

A continuación, inicie el programa Thermocycler en tiempo real. Utilice un software SDS versión 2.4 que funcione con el termociclador en tiempo real correspondiente para calcular el número de copias en bruto de cada muestra. A continuación, calcule el número absoluto de copias a partir del número de copias sin procesar utilizando el software Excel.

La eficiencia de amplificación de miR-122, miR-192 y miR-133a se analizó mediante el trazado de curvas estándar, lo que explica la relación entre la concentración logarítmica y el ciclo de cuantificación para las muestras no preamplificadas. Las curvas estándar para miR-122, miR-192 y miR-133a muestran una relación lineal entre los ciclos de cuantificación y la concentración logarítmica de las muestras. A continuación, se analizó la eficiencia de amplificación de miR-1, miR-499a y miR-206 mediante el trazado de curvas estándar para muestras preamplificadas.

Para analizar la eficiencia de amplificación, la pendiente se calculó mediante regresión lineal. La pendiente en la curva estándar A muestra la ausencia de amplicones específicos a 1.000 copias por concentración de microlitro para miR-499a y miR-206. Sin embargo, los amplicones inespecíficos se obtuvieron a 1.000 copias por microlitro para miR-1.

Aquí, se utilizaron muestras de miR-206 no preamplificadas y preamplificadas por duplicado para derivar los gráficos de amplificación. Los valores del ciclo de cuantificación para miR-206 no preamplificado y preamplificado se estimaron en 39,9, más o menos un coma nueve y 27,0, más o menos dos coma dos, respectivamente, lo que representa valores casi similares entre los duplicados, como se muestra en los gráficos. A continuación, los microARN plasmáticos obtenidos de monos Cynomolgus se sometieron a un perfil para calcular sus valores absolutos.

Los diagramas de puntos, obtenidos a partir de perfiles de microARN que representan sus niveles de expresión, muestran que miR-122, miR-133a y miR-192 son detectables sin preamplificación. Mientras que, miR-1, miR-206 y miR-499a requerirán preamplificación debido a los bajos niveles de expresión. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los niveles absolutos de microARN plasmático, utilizando RT-qPCR.

Y pre-amplificación; es útil para mejorar la detección con pequeñas cantidades de microARN.