Name: Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a cuantificar microARN plasmáticos en monos cangrejeros mediante RT-qPCR en tiempo real. Este método permite detectar niveles bajos de expresión y comparar resultados entre estudios para investigación biomarcadora.

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Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de organismos de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro.

Todos los experimentos fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Daiichi Sankyo Co., Ltd.
1. preparación de la muestra
<ol><li>Recoger la sangre (menos de 0,5 mL) de la vena femoral de monos cangrejeros en tubos con EDTA 2K que contiene. Nota: El citrato y heparina no son aceptables porque estos anticoagulantes inhiben la posterior PCR14,15.</li>
	<li>Coloque las muestras colectadas inmediatamente en hielo y proceso para el aislamiento del plasma dentro de 2 horas de la recolección.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 10.000 x g a 4 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un microtubo 2 mL, seguido de centrifugación a 16.000 x g a 4 ° C por 5 min eliminar restos de células y plaquetas residuales. Nota: La cuantificación de miRNAs puede ser afectada significativamente por plaquetas contaminación16.</li>
	<li>Coloque 200 alícuotas μl del sobrenadante en frescos 2 mL-microtubos y almacenar a-80 ° C hasta su uso. Nota: Un volumen fijo de cada muestra se utiliza para la extracción de RNA; por lo tanto, el volumen de la alícuota debe ser exacto.</li>
</ol>2. extracción de RNA
<ol><li>Descongelar las muestras congeladas en el hielo (de paso 1.5).<ol>
<li>Mantener muestra frío en hielo durante la extracción de RNA. Enfriar el reactivo de lisis y cloroformo en antes hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 5 volúmenes (1000 μL) de reactivo de lisis, que contenga solución monofásica de fenol y guanidina isotiocianato, a la muestra (200 μL) y mezcla vigorosamente con un vórtex durante 1 minuto.</li>
	<li>Añadir 5 μl de 5 nM sintético miRNA de Caenorhabditis elegans (Syn-cel-miR-238-3 p).</li>
	<li>Agregar 1 volumen (200 μL) de cloroformo y mezclar vigorosamente con Vortex durante 1 minuto.</li>
	<li>Mantener en hielo durante 2 a 3 minutos y luego centrifugar las muestras a 12.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos.</li>
	<li>Transferir la fase acuosa con cuidado a un nuevo microtubo. Nota: No transfieren de la fase orgánica (rojo) o interfase (blanco). El volumen de la fase acuosa recogido debe ser uniforme para evitar manejo de inconsistencia, que resulta en la mayor variación técnica. La cantidad habitual de fase acuosa transferido en este protocolo era 650 μl.</li>
	<li>Añadir 1,5 volúmenes (975 μL) de etanol y mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
	<li>Transferir la muestra en una columna correspondiente y el adaptador, seguido del secado al vacío durante 3 minutos usando colectores de vacío. Si el volumen de muestra es de más de 700 μl, repita este paso para procesar la solución restante. Nota: Aislamiento de RNA base de columna es compatible con el método de vacío y centrifugación.</li>
	<li>Añadir 200 μL de etanol a la columna, seguida del secado al vacío durante 1 minuto.</li>
	<li>Añadir 800 μl de tampón de RCV a la columna, seguida del secado al vacío durante 2 minutos.</li>
	<li>Añadir 800 μl de tampón RPE a la columna, seguida del secado al vacío durante 2 minutos.</li>
	<li>Repita el paso 2.11.</li>
	<li>Añadir 300 μL de etanol a la columna, seguida del secado al vacío durante 1 minuto.</li>
	<li>Coloque la columna a un nuevo microtubo y centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) durante 1 minuto.</li>
	<li>La columna de la transferencia a un nuevo microtubo y añadir 50 μl de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Reposar a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) por 3 minutos y centrifugar a 8.000 × g a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) durante 1 minuto.</li>
	<li>Vuelva a aplicar el eluido de la columna.</li>
	<li>Repita el paso 2.16 y almacenar eluido a-80 ° C hasta su uso.</li>
</ol>3. síntesis de cDNA
<ol><li>Descongelar las muestras congeladas (de paso 2.18).</li>
	<li>
Preparar una concentración conocida de oligonucleótidos sintéticos de RNA que corresponden al objetivo miRNAs.
	<ol>
<li>Uso de oligonucleótidos sintéticos de RNA para generar una curva estándar en qPCR. Solución madre de concentración de 1 x 108 copia/μl está preparado para propósitos de almacenamiento.</li>
		<li>Diluir la solución madre 10 veces para obtener 1 x 107 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o solución de trabajo de 1 x 105 copia/μl (muestras previamente amplificadas) como la concentración más alta para la construcción de la curva estándar. En general, un rango sugerido para las concentraciones de la curva estándar es 1 x 107 a 1 x 102 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o 1 x 105 a 1 x 100 copia/μl (muestras previamente amplificadas).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar piscina de cartilla de multiplex RT mezclando volúmenes iguales de 20 cartillas de RT x para destino miRNAs. Nota: Como se muestra en la figura 2, una piscina que contiene hasta 4 objetivo miRNAs se puede hacer mezclando los cebadores de RT 20 x de cada uno de los miRNAs en la piscina. Cel-miR-238 (control externo) debe ser incluido como uno de los miRNAs de destino en cada tubo. En caso de menos de 4 objetivo miRNAs, añadir volúmenes iguales de buffer TE de 1/10 en vez de 20 x RT la cartilla.</li>
	<li>Preparar la mezcla de reacción RT: 3 μl de cebador RT piscina (desde el paso 3.3), 0,15 μl de dNTPs 100 mM con dTTP, 1 μl de transcriptasa reversa (50 U/μL), 1,5 μl 10 x buffer de RT, 0.19 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL) y 4.16 μl de nucleasa-libre del agua.</li>
	<li>Mezclar 10 μl de la reacción de RT mezclar con 5 μl de la muestra de RNA (de paso 3.1) u oligonucleótidos (del paso 3.2) transfiriendo e incubar en hielo durante 5 minutos.</li>
	<li>Ejecutar la reversa de la transcripción en un aparato termociclador: 16 ° C por 30 min, 42 ° C por 30 min, seguida por un paso de inactivación definitiva de la transcriptasa inversa a 85 ° C por 5 min muestras transcritas atrás de tienda a-80 ° C hasta su uso.</li>
</ol>4. preamplificación (opcional)
Nota: Los miRNAs que muestran los valores de Cq por encima de 35 o más en qPCR posteriores son pre amplificados.
<ol><li>Descongelar las muestras congeladas (del paso 3.6).</li>
	<li>Hacer diluciones seriadas 10 veces del producto de RT de oligonucleótidos sintéticos de RNA; 1 x 10-5 a 1 x 100 copia/μL para generar la curva estándar.</li>
	<li>Preparar piscina de primer ensayo multiplex mezclando volúmenes iguales (5 μl) de 20 x cartillas análisis miRNAs de destino con la concentración final de cada cartilla de ensayo está diluyendo 200-fold de búfer en un volumen final de 1000 μl de TE. Nota: Los iniciadores de análisis cuyo objetivo miRNAs puede ser detectable en qPCR posterior sin la amplificación y los cel-miR-238 (control externo) no se incluyen en la piscina de la cartilla.</li>
	<li>Preparar la mezcla de reacción de amplificación previa: 12,5 μl de 2 x listo para su uso reactivo preamplification, 3,75 μl de piscina de primer ensayo (de paso 4.3) y 6,25 μl de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Mezcla 22,5 μl de la reacción de amplificación previa mezclar con 2,5 μl de muestra transcripción inversa (del paso 4.1) o de oligonucleótidos (del paso 4.2) transfiriendo e incubar en hielo durante 5 minutos.</li>
	<li>Ejecutar la reacción en un aparato termociclador: 95 ° C por 10 min; seguido de 12 ciclos de 95 ° C por 15 s y 60 ° C durante 4 min. almacenan muestras previamente amplificadas a-80 ° C hasta su uso.</li>
</ol>5. cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)
<ol><li>Descongelar las muestras congeladas (de paso 3.6 o paso 4.6).</li>
	<li>Diluir las muestras 5 veces con agua estéril.</li>
	<li>Preparar diluciones seriadas 10 veces del producto RT derivado de oligonucleótidos sintéticos de RNA; 1 x 107 a 1 x 102 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o 1 x 105 a 1 x 100 copia/μl (muestras previamente amplificadas) para la generación de curvas estándar.</li>
	<li>Preparar la mezcla de reacción de qPCR: 10 μl de 2 x reactivo de amplificación listo para su uso, 1 μl de 20 x reactivo de ensayo, que contiene la cartilla de la polimerización en cadena y sonda correspondiente a miRNA blanco, avance/retroceso y 7 μl de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Transferencia 18 μL de la mezcla de reacción de qPCR para las placas de reacción de 96 pocillos rápido óptico y añadir 2 μl de muestras diluidas (de paso 5.2 o 5.3 de paso) en los pocillos. Nota: Las muestras y estándares para qPCR se configuran por duplicado.</li>
	<li>Selle la placa con la película adhesiva y centrifugar brevemente.</li>
	<li>Ejecutar la reacción en un termociclador en tiempo real: 95 ° C por 20 s, seguido por 45 ciclos de 95 ° C para 1 s y 60 ° C por 20 s.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Calcular el número de copia cruda de cada muestra utilizando el software de análisis de datos que trabaja con correspondiente termociclador en tiempo real. Nota: Línea de umbral se establece manualmente en "1.0" en todas las placas en el estudio, para confirmar la reproducibilidad en comparación con sus vales de Cq. Nivel de corte se fija en Cq > 40 ciclos.</li>
	<li>Calcule el promedio del número de copia cruda de cada muestra de duplicados.</li>
	<li>Calcular el factor de corrección dividiendo un número de copia del cel-miR-238 en cada muestra el promedio de número de copia del cel-miR-238 de todas las muestras en un tubo correspondiente. Nota: Como se muestra en la figura 2, cada tubo contiene hasta 4 miRNAs de destino incluyendo cel-miR-238 (control externo). Por lo tanto, el factor de corrección se calcula para cada tubo utilizando el correspondiente valor de la cel-miR-238.</li>
	<li>Calcular el número de copia ajustada al dividir el número de copia cruda promedio de cada muestra (de paso 6.2) por el factor de corrección (de paso 6.3) para cada muestra.</li>
	<li>Calcular el número de copia absoluto multiplicando el número de copia cruda ajustada de cada muestra (de paso 6.4) por el el factor de dilución para cada muestra. Nota: El factor de dilución es "5" en el presente Protocolo, que se deriva de paso 5.2.</li>
	<li>Calcular la eficiencia de amplificación por PCR de la pendiente de la parcela de los valores de Cq para cada dilución serial contra concentración de cDNA de registro. Nota: Fórmula para el cálculo de la eficiencia; E = (10(-1/pendiente) -1) x 100%.</li>
	<li>Calcular la variación técnica utilizando los valores de Cq de cel-miR-238 de todas las muestras mediante la fórmula E = (eficacia de la amplificación de 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Nota: Los pasos 6.5 y 6.7 se utilizan para la evaluación de la calidad del procedimiento.</li>
</ol>

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</ol>

El autor no tiene ningún conflicto de interés que revelar.

Nuestra evaluación completa proporciona un análisis estadístico más riguroso de la amplitud de la gama dinámica, que indica claramente que la magnitud de la variación entre muestras individuales fue muy diferente entre los miRNAs probado. Aunque estas variaciones pueden atribuirse a sus pequeñas cantidades en los fluidos corporales, debe señalarse que estos datos reflejan no sólo las variaciones biológicas, sino también variaciones técnicas. La mayoría de la variación de la técnica puede ser evaluada mediante valores de ...

Un creciente número de estudios ha sido explorar microRNAs (miRNAs) como biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de los cánceres, o supervisión y detección de otras enfermedades en estudios clínicos y no clínicos1,2,3 . Cuantitativa en tiempo real transcripción reversa PCR (RT-qPCR) es uno de los métodos más comunes utilizados para evaluar miRNAs del destino individual, porque esta técnica es más sensible de microarray4 y la secuencia de RNA a partir de plataformas5. En general, expresión de miRNA se mide en relación con una muestra de referencia utilizando el método de ΔCq6. Este enfoque es apropiado para la investigación de los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, la cuantificación relativa de miRNAs en circulación ha limitado utilidad debido a sus pequeñas cantidades. Además, la variación técnica hace difícil comparar los resultados de diferentes estudios, ya que diferentes laboratorios personalizar los protocolos experimentales de RT-qPCR diferentemente, que conduce a incompatibles o incluso contradictorios resultados de diferentes estudios7.
En vista de las preocupaciones mencionadas, cuantificación absoluta podría ser más adecuada para la evaluación de las cantidades pequeñas de miRNAs en los fluidos corporales. El método de cuantificación absoluta utiliza una curva estándar generada a partir de concentraciones conocidas de oligonucleótidos sintéticos de RNA que son idénticas en secuencia para el correspondiente destino miRNA8. La salud y el Instituto de ciencias ambientales (HESI) Comité técnico de genómica recientemente llevado a cabo estudios exhaustivos para comparar los resultados de medidas absolutas de miRNAs de plasma, a través de múltiples sitios de prueba. Los resultados mostraron que utilizando un protocolo estándar para la cuantificación absoluta de miRNAs produjo resultados comparables a través de la prueba de múltiples sitios9. El método de ensayo de RT-qPCR que se describe en el presente estudio es casi idéntico al protocolo estándar de HESI, que incluye análisis multiplexado de múltiples objetivos de miRNA y la amplificación para la detección de baja expresión de miRNAs.
En este estudio, recoge un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50) fue utilizado10. El siguiente protocolo describe el procedimiento para la preparación de las muestras de plasma, extracción de miRNA y RT-qPCR, incluyendo la amplificación. Lo más importante, información técnica adicional sobre el protocolo se ha incluido, por lo que la cantidad de miRNAs de blanco en las muestras puede ser validada en combinación con un proceso bien calificado. En primer lugar, la curva estándar de cada miRNA se validó su rango de detección individual, antes de su cuantificación en muestras biológicas. En segundo lugar, la calidad de la metodología actual se evaluó exhaustivamente mediante valores de Cq de un control externo (cel-miR-238). Por lo tanto, esta plataforma proporciona datos más informativos y confiables para comparar resultados de diferentes estudios o laboratorios.
Los perfiles de 8 miRNAs se han incluido en este informe como resultados representativos por el método de ensayo descrito aquí. Estos miRNAs se han propuesto como biomarcadores potenciales de seguridad asociaron con lesión del tejido del hígado (miR-122 y miR-192), corazón (miR-1, miR-208a, 208b miR y miR-499a) y músculo esquelético (miR-133a y miR-206) en roedores y seres humanos3, 11,12,13.

<table><tbody><tr><td>Tubo BD Microtainer (K2EDTA)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>365974</td><td>Para la extracción de sangre</td></tr><tr><td>Tubos de PCR Eppendorf, 0,2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030124359</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos de ensayo Eppendorf Safe-Lock micro de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos de ensayo Safe-Lock de 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótido sintético</td><td>Hokkaido System</td> <td>Science-Individual</td> <td>miRNA (0.2 &mu; mol, grado de HPLC)</td></tr> <tr><td>Tampón Tris-EDTA &nbsp; (pH 8.0)</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td>Tampón TE Tampón</td></tr><tr><td>RPE</td><td>QIAGEN-Contenido</td><td></td> <td>en miRNeasy mini kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón RWT</td><td>QIAGEN-Contenido</td><td></td> <td>en miRNeasy mini kit&nbsp;</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN 217004</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua Libre de Nucleasas&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reactivo</td><td>QIAGEN-Contenido</td><td></td> <td>en miRNeasy mini kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>219600</td><td>ID: MSY0000293, 5 nmol</td></tr><tr><td>Adaptadores SC</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>S0120</td><td>Para extracción de ARN</td></tr><tr><td>VacEZor 36 Sistema completo</td><td>TAIGEN Bioscience Corporation</td><td>M3610</td><td>Para extracción de ARN</td></tr><tr><td>7900HT Sistema rápido de PCR en tiempo real</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4351405</td> sistema rápido de PCR GeneAmp <td>en bloque de 96 pocillos</td></tr><tr><td>9700</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>9700</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>Película adhesiva óptica MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4311971</tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4444557</tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (cel-miR-238-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 000248</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-122-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 002245</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-133a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 002246</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-1-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 002222</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-192-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 000491</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-206)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 000510</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-208a-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 000511</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-208b-3p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 002290</td></tr><tr><td>Ensayos de microARN TaqMan (has-miR-499a-5p)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>4427975</td><td>ID del ensayo: 001352</td></tr><tr><td>Kit de transcripción TaqMan MicroRNA Reverse Thermo</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4366597</tr><tr><td>Mezcla maestra de preamplificación TaqMan (2&veces;)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>4391128</tr><tr><td>Cloroformo&nbsp;</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>035-02616</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99.5)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación absoluta de plasma niveles de microarn en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa pcr

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR es uno de los métodos más comunes para evaluar objetivo individual miRNAs. Generalmente se miden los niveles de MiRNAs en relación con una muestra de referencia. Este enfoque es apropiado para examinar los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, cuantificación absoluta usando mejor el análisis estadístico es preferible para una evaluación integral de los niveles de expresión génica. Cuantificación absoluta está todavía no de uso común. Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de plasma miRNA, usando RT-qPCR con o sin la amplificación.
Se preparó un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50). ARN total fue extraído usando sistema comercialmente disponible. MiRNAs de plasma fueron cuantificados por análisis de RT-qPCR basada en sondeos que contiene la sonda y miRNA-específico-reversa PCR primer. Curvas estándar para cuantificación absoluta se generaron usando oligonucleótidos sintéticos disponibles en el mercado del RNA. Un sintético cel-miR-238 fue utilizado como un control externo para la evaluación de normalización y calidad. Los miRNAs que mostró cuantificación ciclo (Cq) valores por encima de 35 se pre amplificados antes el paso de la qPCR.
Entre los 8 miRNAs examinados, miR-122, miR-133a y miR-192 eran detectables sin la amplificación, mientras que 499a miR, miR-1 y miR-206 requieren la amplificación debido a sus niveles de baja expresión. MiR-208a y 208b miR no eran perceptibles aún después de la amplificación. Eficacia de la muestra fue evaluada por los valores de Cq de la cel-miR-238 con picos. En este método de ensayo, variación técnica era estimada para ser menos 3-fold y el límite inferior de cuantificación (LLOQ) 102 copia/μl, para la mayoría de los miRNAs examinados.
Este protocolo proporciona una mejor estimación de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación de la calidad de los correspondientes datos de diferentes estudios. Teniendo en cuenta que el bajo número de miRNAs en los fluidos corporales, la amplificación es útil para mejorar la detección de mal expresado miRNAs.

Flujo de trabajo de análisis de miRNA por RT-qPCR y calidad assessment La figura 1 muestra el flujo de trabajo de miRNA análisis de muestras de sangre usando qPCR10. La calidad de los experimentos puede ser verificada mediante la inclusión de cel-miR-238 como un control externo. Esto revelará las variaciones técnicas en la extracción de RNA y RT-qPCR posteriores procesos. En este estudio, la media ± SD de l...

Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de miRNA plasma, mediante la transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR con o sin la amplificación. Este protocolo permite la mejor comprensión de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación cualitativa de los correspondientes datos de diferentes estudios o laboratorios.

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los niveles absolutos de microARN plasmáticos mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa en tiempo real. Este método puede ayudar a evaluar la cantidad de microARN plasmáticos, incluso si su nivel de expresión es bajo. La principal ventaja de esta técnica es que los datos medidos se pueden comparar con otros de diferentes estudios o laboratorios.Las implicaciones de esta técnica se extienden a las muestras de otras especies, ya que se puede generar una curva estándar utilizando el ARN sintético o el nucleótido. Este método puede proporcionar información sobre la investigación traslacional para investigar biomarcadores de seguridad prometedores. Primero, descongele las muestras de plasma congelado obtenidas de la vena femoral de los monos Cynomolgus en hielo.Transfiera el reactivo de lisis en cloroformo sobre hielo para enfriarlo antes de la extracción del ARN. A continuación, agregue 1.000 microlitros de reactivo de lisis a 200 microlitros de la muestra. Y vórtice durante un minuto para garantizar una mezcla adecuada.A continuación, añada a la muestra cinco microlitros de microARN sintético de Caenorhabditis elegans y 200 microlitros de cloroformo. Agite la muestra durante un minuto para que se mezcle correctamente. Luego, coloque la muestra en hielo durante dos o tres minutos.A continuación, centrifugar la muestra a 12.000 G, durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera con cuidado 650 microlitros de la fase acuosa a un nuevo microtubo. A continuación, añada 975 microlitros de etanol a la fase acuosa y pipetee varias veces para asegurar una mezcla completa.Transfiera la muestra a la columna y el adaptador correspondientes y luego seque al vacío durante tres minutos usando colectores de vacío. Luego agregue 200 microlitros de etanol a la columna y seque al vacío durante un minuto. Después del secado al vacío, agregue 800 microlitros de tampón RWT a la columna y, nuevamente, seque al vacío durante dos minutos.A continuación, añada 800 microlitros de RPE Buffer a la columna y seque al vacío durante dos minutos. Agregue el tampón RPE dos veces, seguido de un secado al vacío. A continuación, agregue 300 microlitros de etanol a la columna.Después de agregar etanol, seque al vacío durante un minuto. A continuación, transfiera la columna a un nuevo microtubo y centrifugue el mismo a 12.000 G a temperatura ambiente durante un minuto. Después de la centrifugación, transfiera la columna a un nuevo microtubo y agregue 50 microlitros de agua sin nucleasa.Deje reposar la columna a temperatura ambiente durante tres minutos y luego centrifuga a 8.000 G a temperatura ambiente durante un minuto. Finalmente, almacene el eluido a menos 80 grados centígrados hasta su uso. Para preparar una concentración de oligonucleótidos de ARN sintético que corresponda al microARN objetivo, diluya la solución madre 10 veces para lograr una solución de trabajo con la concentración más alta para trazar las curvas estándar.A continuación, para constituir un grupo múltiplex de cebadores de transcripción inversa, mezcle volúmenes iguales de los cebadores de 20 concentraciones para los microARN diana. A continuación, prepare la mezcla de reacción de transcripción inversa. A continuación, añada 10 microlitros de mezcla de reacción de transcripción inversa a cinco microlitros de muestra de ARN.Mezcle los dos pipeteando varias veces. Luego, incuba la mezcla en hielo durante cinco minutos. Después de colocar la muestra en el termociclador, inicie el ciclo.Una vez finalizado el programa, almacene la muestra transcrita inversa a menos 80 grados centígrados. Para constituir el grupo de cebadores de ensayo multiplex, agregue volúmenes iguales de cinco microlitros de cebadores de ensayo correspondientes a microARN objetivo en el tubo que contiene tampón Tris-EDTA en el volumen final de 1.000 microlitros. A continuación, constituya la mezcla de reacción de preamplificación.Una vez que la mezcla de reacción esté lista, transfiera 22,5 microlitros de mezcla de reacción de preamplificación a dos coma cinco microlitros de muestra transcrita inversa. A continuación, pipetear para mezclar la muestra y la preamplificación maestra mezclar bien e incubar en hielo durante cinco minutos y luego dejar los tubos de PCR en el termociclador y comenzar la ejecución. Una vez finalizado el programa, transfiera todas las muestras a menos 80 grados centígrados.Después de descongelar las muestras preamplificadas o no preamplificadas, diluya cinco veces con agua estéril. Para generar la curva estándar, realice una dilución en serie de 10 veces de las muestras derivadas de oligonucleótidos de ARN sintéticos. A continuación, constituyen la mezcla cuantitativa de la reacción PCR en un tubo mantenido en hielo.A continuación, añada 18 microlitros de la mezcla de reacción cuantitativa de PCR a las placas de reacción óptica rápida de 96 pocillos. Luego agregue dos microlitros de las muestras diluidas en los pocillos. Después de sellar la placa con una película adhesiva, centrifugar brevemente la muestra a 500 G durante 15 segundos.A continuación, inicie el programa Thermocycler en tiempo real. Utilice un software SDS versión 2.4 que funcione con el termociclador en tiempo real correspondiente para calcular el número de copias en bruto de cada muestra. A continuación, calcule el número absoluto de copias a partir del número de copias sin procesar utilizando el software Excel.La eficiencia de amplificación de miR-122, miR-192 y miR-133a se analizó mediante el trazado de curvas estándar, lo que explica la relación entre la concentración logarítmica y el ciclo de cuantificación para las muestras no preamplificadas. Las curvas estándar para miR-122, miR-192 y miR-133a muestran una relación lineal entre los ciclos de cuantificación y la concentración logarítmica de las muestras. A continuación, se analizó la eficiencia de amplificación de miR-1, miR-499a y miR-206 mediante el trazado de curvas estándar para muestras preamplificadas.Para analizar la eficiencia de amplificación, la pendiente se calculó mediante regresión lineal. La pendiente en la curva estándar A muestra la ausencia de amplicones específicos a 1.000 copias por concentración de microlitro para miR-499a y miR-206. Sin embargo, los amplicones inespecíficos se obtuvieron a 1.000 copias por microlitro para miR-1.Aquí, se utilizaron muestras de miR-206 no preamplificadas y preamplificadas por duplicado para derivar los gráficos de amplificación. Los valores del ciclo de cuantificación para miR-206 no preamplificado y preamplificado se estimaron en 39,9, más o menos un coma nueve y 27,0, más o menos dos coma dos, respectivamente, lo que representa valores casi similares entre los duplicados, como se muestra en los gráficos. A continuación, los microARN plasmáticos obtenidos de monos Cynomolgus se sometieron a un perfil para calcular sus valores absolutos.Los diagramas de puntos, obtenidos a partir de perfiles de microARN que representan sus niveles de expresión, muestran que miR-122, miR-133a y miR-192 son detectables sin preamplificación. Mientras que, miR-1, miR-206 y miR-499a requerirán preamplificación debido a los bajos niveles de expresión. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los niveles absolutos de microARN plasmático, utilizando RT-qPCR.Y pre-amplificación; es útil para mejorar la detección con pequeñas cantidades de microARN.

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