Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas

El objetivo principal de este protocolo de Western blot es realizar Western blots en un pequeño número de células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre hematopoyéticas, como la presencia o abundancia de proteínas específicas o la activación de vías de señalización. La principal ventaja de esta técnica es que requiere menos de 20.000 células, por lo que se necesitan menos animales para analizar poblaciones raras de células primarias.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando intentábamos encontrar formas de reducir el número de ratones que necesitábamos utilizar para los análisis de células madre hematopoyéticas. La demostración del procedimiento estará a cargo de Xiongwei Cai, un postdoc de mi laboratorio. Utilice un rotor de cubo oscilante para centrifugar tubos de 1,5 mililitros que contienen células madre y progenitoras hematopoyéticas clasificadas a 500 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Una vez finalizada la centrifugación, deseche todos menos 100 microlitros de sobrenadante, sin alterar la pastilla celular. Si hay menos de 5.000 células y el volumen de la muestra clasificada es inferior a 0,2 mililitros, transfiera primero las células a tubos de PCR de 0,2 mililitros de baja unión antes de la centrifugación. Sin embargo, si hay menos de 5.000 células, pero el volumen de la muestra clasificada es superior a 0,2 mililitros, centrifugar las células a 500 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación, deseche todo menos 200 microlitros de sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet y los 200 microlitros restantes de sobrenadante. A continuación, transfiera la suspensión de la celda a tubos de PCR de 0,2 mililitros y, de nuevo, centrifuga.

Luego vuelva a suspender el pellet en 20 a 30 microlitros de sobrenadante y deseche el resto. Si es necesario, añadir solución salina tamponada con fosfato en suero bovino al 2% o albúmina sérica bovina al 2% a las células resuspendidas. A continuación, utilice un contador de células automatizado para determinar la concentración celular utilizando de dos a cinco microlitros de células resuspendidas.

A continuación, utilice una punta de pipeta de 20 o 100 microlitros para transferir un volumen de 500, 1.000 y 2.000 células madre hematopoyéticas y progenitoras a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Utilice un rotor de cubo oscilante para centrifugar las células a cuatro grados centígrados a 500 veces la gravedad durante cinco minutos. A continuación, siga las instrucciones del fabricante para disolver la fosfatasa y el inhibidor del proteasoma y el DMSO para preparar una solución madre de 100 veces.

A continuación, diluya el tampón de muestra Laemmli cuádruple con volúmenes equivalentes de agua destilada para hacer un tampón de muestra Laemmli doble. A continuación, añada cantidades adecuadas de la solución madre de 100 veces de fosfatasa e inhibidor del proteasoma para ajustar la concentración final a dos veces los inhibidores y dos veces el tampón de muestra de Laemmli. Ajuste el volumen de sobrenadante residual en el tubo de modo que la adición de volúmenes iguales de tampón Laemmli de dos veces junto con el inhibidor de fosfatasa y proteasoma logre una concentración final de 500 células por microlitro y un tampón Laemmli de pliegue.

Y luego volver a suspender para formar el lisado. Antes de cargar el gel, caliente la muestra lisada a 95 grados centígrados en un bloque de calor durante cinco minutos. Utilizando protocolos estándar, electroforesis de uno a 40 microlitros de lisado equivalente a 500 a 20.000 células a través de la página SDS a 100 voltios.

Después de tratar la membrana de polivinilideno con metanol durante segundos, lave brevemente la membrana con agua destilada. Luego, transfiera la proteína del gel a la membrana de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante del aparato de transferencia. Después de la transferencia, bloquee la membrana con dos mililitros de albúmina sérica bovina al 2% y solución salina tamponada con fosfato con 0,1%Tween durante la noche a cuatro grados Celsius de acuerdo con los protocolos estándar.

Después de bloquear la membrana, incubarla con anticuerpos diluidos durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, lavar la membrana tres veces con solución salina tamponada con fosfato al 0,1%Tween 20 durante cinco minutos cada una a temperatura ambiente. A continuación, incube la membrana con dos mililitros de tampón de quimioluminiscencia mejorada durante un minuto a temperatura ambiente.

Detecte las señales mediante un sistema de imágenes. Para comparar las señales de beta actina, se prepararon lisados a partir de células madre y progenitoras hematopoyéticas en orina y se sometieron a un análisis de parcelas occidentales. Está claro en el amino blot que hay una disminución en la señal de beta actina de los lisados preparados de 2.000 a 500 progenitores hematopoyéticos y células madre cargadas en pocillos de 1,5 milímetros en un gel de página SDS al 12%.

Además, para comparar las señales de beta actina obtenidas de diferentes tamaños de pocillos fundidos en el gel. Los lisados se cargaron en pocillos de 1,5 y 3 milímetros en el gel y luego se sometieron a un análisis de Western blot. El blot muestra que la señal de beta actina obtenida del lisado preparado a partir de 500 progenitores hematopoyéticos cargados en un pocillo de 1,5 milímetros es mucho más fuerte que cuando se carga en un pocillo de tres milímetros.

A continuación, para comparar las señales del factor de iniciación eucariota 4G, la actina y la fosforilación de la proteína ribosómica S6 en respuesta a la estimulación del factor de células madre citoquinas, se analizaron los lisados obtenidos mediante amino blot. El blot muestra la presencia de intensidades de señal más fuertes para las tres proteínas en los regenitores hematopoyéticos con estimulación del factor de células madre citocinas. En comparación con el control in vitro, también está claro que hay una intensidad de señal creciente para las tres proteínas de diferentes volúmenes de células madre hematopoyéticas.

Una vez dominado, esto técnicamente se puede hacer en 48 horas. Si se aborda adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar contar con precisión las células y dirigir las células lisadas con un tampón de carga.

Después de este desarrollo, técnicamente se peletiza para que los investigadores en el campo de la investigación con células madre exploren las vías de señal en un pequeño número de células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer el trazado occidental con un pequeño número de piezas de dirección. Tenga cuidado con las regiones que está utilizando para la página SDS.

Gracias por mirar. Buena suerte con tus experimentos.