Name: Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprende un protocolo de Western blot optimizado para analizar solo 500 células madre hematopoyéticas mediante lisis directa en tampón Laemmli. Este método reduce el uso de animales y permite detectar proteínas específicas en poblaciones celulares raras.

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Institutos nacionales de salud otorgar R01 CA149976 (N.A.S) apoyado este trabajo.

Todos los procedimientos deberán realizarse con arreglo institucional uso de animales y su cuidado. El procedimiento fue desarrollado para el análisis de murino madre y progenitoras células hematopoyéticas (HSCs y HPs), pero puede ser adaptado para el análisis de otras poblaciones de la célula.
1. flujo Cytometry aislamiento de HSCs murinas y HPs
<ol><li>Cosecha de células de médula ósea murina como se describe en la literatura6. Nota: En los datos presentados en la figura 1 y figura 2, la médula ósea fue cosechada de ratones C57BL/6J.</li>
	<li>Realizar el agotamiento de linaje de células de médula ósea usando un ratón linaje agotamiento kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Incubar las células con anticuerpos contra los marcadores superficiales de la célula de interés descrito7. En los experimentos que se muestra en la figura 1 y figura 2, se utilizan anticuerpos para Sca-1, Kit, Flt3 y marcadores de linaje (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 y Ter119.</li>
	<li>Ordenar 2.000-20.000 Sca1 de Lin– +Kit+ Flt3 células– (HSCs) o Lin–Sca1–células del Kit+ (HPs) en tubos Eppendorf de 1.5 mL que contiene 0, 1 mL de fosfato tampón salino (PBS) con 2% fetal bovino suero (FBS). Nota: Los datos que se muestra en la figura 1 y figura 2, las células fueron clasificadas usando un citómetro de flujo con una boquilla de 70 μm. El volumen de la colección máxima es de 1,4 mL.</li>
</ol>2. preparación de la muestra
Nota: Este paso es vital. Procesar la muestra con mucho cuidado. Al retirar el sobrenadante, ser muy cuidado de no perturbar el sedimento celulares.
<ol><li>Tubos de centrífuga 1,5 mL que contiene las células ordenadas en un rotor que hace pivotar del cubo a 4 ° C, 500 x g, durante 5 minutos quitar todos sino aproximadamente 100 μl del sobrenadante de la celda de pellets muy suavemente con una pipeta y una punta de pipetear 20 μl. No molestes a la pelotilla.<ol>
<li>Si la muestra contiene menos de 5.000 células, y el volumen total de la muestra seleccionada es inferior a 0,2 mL, transferir las células primero a tubos PCR de 0.2 mL baja obligatoria antes de la centrifugación.</li>
		<li>Si la muestra contiene menos de 5.000 células y volumen es más de 0,2 mL, desactivación de las células con una centrifugadora a 4 ° C, 500 x g, 5 min y eliminar casi 200 μL del sobrenadante. Resuspenda las células sedimentadas en los restantes 200 μL de sobrenadante, luego transferir las células a los tubos PCR de 0.2 mL y girar hacia abajo otra vez. Quitar todos sino 20-30 μL pellets después de la segunda vuelta y resuspender las células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspender las células en la izquierda sobrenadante en el tubo. Si es necesario, añadir PBS adicional en 2% FBS/PBS (también se puede usar 2% albúmina de suero bovino (BSA) / PBS, o solo PBS) para obtener una concentración de 5 x104 a 5 x 105 células/mL. Nota: El recuento de uso recopilados por citometría para estimar el volumen utilizado para suspender las células.</li>
	<li>Utilice 2-5 μl de las células suspendidas de nuevo para determinar una concentración exacta de la célula usando un contador de células automatizado (siguiendo las instrucciones del fabricante) o un hemocitómetro9.</li>
	<li>Transferir un volumen de células suspendidas de nuevo que contiene el número deseado de células a nuevos tubos de 1,5 mL. Para el experimento en la figura 1, se transfirieron 500, 1.000 o 2.000 HSCs o HPs. El número de las células depende de la fuerza de la señal obtenida mediante Western blot y se determina empíricamente. Realizar a la transferencia utilizando una 20 μl o punta de pipeta de Eppendorf de 100 μl.</li>
	<li>Centrifugar las células en un rotor oscilante de cubo a 4 ° C, 500 x g, durante 5 minutos.</li>
	<li>Para generar 100 x soluciones, disolver inhibidores de proteasoma y fosfatasa en DMSO según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Preparar 2 x Laemmli tampón diluyendo el 4 x Laemmli Solución tampón de muestras proporcionadas por el fabricante con una cantidad equivalente de agua destilada. Agregar una cantidad apropiada de la población 100 x de inhibidores de la proteasoma y fosfatasa para obtener una concentración final de 2 inhibidores de la x en tampón x Laemmli 2. Nota: El tampón de muestra de 2 x Laemmli se puede hacer con antelación, pero los inhibidores de la proteasoma y fosfatasa se deben agregar inmediatamente antes de agregar los 2 x Laemmli el tampón de muestra (más inhibidores) para el precipitado de células para lyse las células, como se describe en el siguiente paso.</li>
	<li>Quitar una parte del sobrenadante de la pelotilla de la célula y el sobrenadante restante en el tubo con el precipitado de células con cuidado, añadir un volumen igual de 2 x Laemmli tampón más inhibidores de la proteasoma y fosfatasa para alcanzar una concentración final de 500 células/μl en 1 x Laemmli Solución tampón de muestra. Nota: por ejemplo, si transfiere 2.000 células en un volumen total de 20 μl a un tubo de paso 2.5, después de centrifugar células (paso 2.6) debe eliminar 18 μL del sobrenadante de la pelotilla y 2 μl de sobrenadante que queda añadir un volumen igual (2 μL) de 2 x Laemmli sample buffer alcanzar una concentración final de 500 células/μl en 1 x Laemmli Solución tampón de muestra.</li>
	<li>Resuspender el precipitado para generar el lisado tan pronto como sea posible. En este punto, las muestras pueden ser inmediatamente electrophoresed mediante geles SDS-PAGE, o se puede complemento congelado en líquido N2 y almacenado a-80 ° C para su uso futuro.</li>
</ol>3. electroforesis
<ol><li>Calor de los lisados en un bloque térmico a 95 ° C o en agua hirviendo durante 5 minutos.</li>
	<li>Electrophorese μL 1-40 de los lisados (contiene desde 500 hasta 20.000 equivalentes de la célula) a través de geles de SDS-PAGE a 100V utilizando protocolos estándar10. Nota: El volumen de lisado cargada en el gel es determinado por el número de células necesario para generar la señal deseable y dependerá de la abundancia de la proteína de interés y la calidad del anticuerpo. Los datos en la figura 1 se obtuvieron con 2.000, 1.000 y 500 celular equivalente al lisado. La anchura del pozo debe en el rango de 3 mm a 1,5 mm. 1,5 mm dientes pueden cortar de un peine disponible en el mercado con más dientes con unas tijeras.</li>
</ol>4. transferencia y bloquear
Nota: Realizar un Western blot siguiendo protocolos estándar11. Brevemente se describen aquí los pasos:
<ol><li>Use del polivinilideno (PVDF) de difluoruro membrana con metanol para 10 s, después lavar la membrana brevemente con agua destilada.</li>
	<li>Transferencia de la proteína del gel de SDS-PAGE a la membrana siguiendo las instrucciones en el manual suministrado por el fabricante de los aparatos de transferencia.</li>
	<li>Después de transferencia, bloquear la membrana con 2 mL de 5% albúmina sérica bovina (BSA) en SAFT (PBS con un 0.1% Tween) durante la noche a 4 ° C siguiendo protocolos estándar11.</li>
</ol>5. anticuerpo etiquetado
<ol><li>Incubar la membrana con anticuerpos en un agitador durante la noche a 4 ° C utilizando diluciones de anticuerpo recomendadas por el proveedor. Nota: Anticuerpos, los cuales hemos validado HSCs, HPs y las diluciones de anticuerpo correspondiente, se muestran en la tabla de materiales. Realizar el anticuerpo etiquetado utilizando procedimientos estándar8.</li>
</ol>6. detección de
<ol><li>Lavar la membrana 3 veces, 5 minutos para cada colada en SAFT a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar la membrana con 2 mL de tampón de quimioluminescencia realzada durante 1 min a temperatura ambiente. Detectar las señales usando un sistema de imágenes siguiendo las instrucciones, o película de autorradiografía y procesador de la película.</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses para declarar.

Western Blot es una técnica común para la detección de proteínas específicas y la activación de vías de señalización en los tejidos o células. Mediante la introducción de pequeños ajustes a un procedimiento de uso general, hemos sido capaces de detectar rutinariamente 15 diversas proteínas (Tabla de materiales) en 15.000 HSCs y en algunos casos en tan solo 500 HSCs. The Most pasos críticos en este protocolo son: 1) exactamente contando las células 2) reduciendo al mínimo el número de transferencias entre...

Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son células renueva a sí misma que pueden dar lugar a todos los linajes de sangre. Son células relativamente raras en la médula ósea, haciendo difícil los análisis bioquímicos. Enfoques adecuados para el análisis de células, como la citometría de flujo, han sido extremadamente útiles para cuantificar cantidades relativas de los marcadores de superficie celular y proteínas intracelulares. Sin embargo, el análisis de proteínas intracelulares requiere la utilización de procedimientos de permeabilización celular para permitir el acceso del anticuerpo, y no todos celular epitopos superficiales sobreviven estos procedimientos1,2. Además, anticuerpos que discriminan entre productos de diferentes proteínas isoformas o hendidura a menudo no están disponibles para citometría de flujo, y por lo tanto, los investigadores todavía dependen de Western blot para ciertos tipos de análisis.
Mancha blanca /negra occidental análisis de lysates de la célula es un procedimiento rutinario en la mayoría de los laboratorios. Las células se pueden purificar en condiciones nativas que conservan los epitopos de moléculas de superficie celular, y lysates de la célula puede preparado y analizado posteriormente. Sin embargo, el análisis de proteínas en célula de primaria rara poblaciones por Western blot puede requerir euthanizing grandes cantidades de animales para obtener suficientes células. Haciendo pequeños ajustes en varios pasos, un protocolo Blot Western convencional fue capaz de detectar proteínas en un número relativamente pequeño de HSCs (500-15.000, dependiendo de la proteína de interés). Los ajustes incluyen exactamente contando las células, manipular cuidadosamente el sedimento celular, reducir las transferencias de células entre tubos para minimizar la pérdida de la célula, y lisis de un número determinado de células con una carga concentrada tampón que contiene proteasoma y inhibidores de la fosfatasa. Muchos informes publicados incluyen manchas blancas /negras occidentales obtenidas con 20.000 o más HSCs3,4,5,6,7; Este sencillo procedimiento reducirá el número de células y animales de experimentación necesarios para producir datos equivalentes por entre 4 y 40 veces. El protocolo está diseñado para normalizar los resultados en una base por células, en lugar de un control interno. Esto permite la detección de la reducción general en los niveles de proteína que pueden pasarse por alto si los datos se normalizan a un control interno. La importancia de la normalización de una base por celular fue descrita para el análisis de de datos de expresión génica8, y el mismo principio se aplica a la cuantificación de proteínas por Western blot. Este protocolo optimizado debe ser útil para cualquier persona que necesite analizar una pequeña cantidad de células.

<table><tbody><tr><td>dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% Acrylamidel Bis solution</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.5M Tris-HCl pH8.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.0M Tris-HCl pH6.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>mini-protean 3 peines</td><td>Bio-Rad</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sistema de transferencia</td><td>Bio-Rad</td><td>1704155EDU</td><td></td></tr><tr><td>Transferencia PowerPac HC Fuente de alimentación</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052EDU</td><td>electroforesis</td></tr><tr><td>sistema de imagen</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>detección de señales</td></tr><tr><td>4x Tampón de muestras Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747EDU</td><td>preparación de muestras</td></tr><tr><td>10x Tampón de electroforesis Tris/Glicina/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td><td>electroforesis</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710EDU</td><td>Preparación de muestras</td></tr><tr><td>RTA Mini PVDF Kit de transferencia, para 40 Transferencia</td><td>de 1704272 Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa Cóctel</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td>preparación de muestras</td></tr><tr><td>Inhibidor de la fosfatasa Cócteles</td> Gold <td>Biotechnology</td><td>GB-450-1 Preparación de</td><td>muestras</td></tr><tr><td>EIF4G</td><td>Señalización celular</td><td>2469</td><td>WB anticuerpo, validado en 1000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): Fig2</td></tr><tr><td>Señalización celular p-Rps6</td><td></td><td>4858</td><td>WB anticuerpo, validado en 1000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): Fig2</td></tr><tr><td>actina (HRP conjugado)</td> <td>abcam</td><td>ab49900</td><td>WB anticuerpo, validado en 500 células concentración de anticuerpos: 1:5000 referencia (figura): Fig1, Fig2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>Anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig5)</td></tr><tr><td>S6</td><td>Señalización celular</td><td>2317</td><td>anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>p-4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>2855</td><td>WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>TSC2</td><td>Cell Signaling</td><td>4308</td><td>WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Cell Signaling</td><td>4877</td><td>anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig5)</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>Cell Signaling</td><td>9188</td><td>WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>Señalización celular mTOR</td><td></td><td>2983</td><td>Anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>5536</td><td>anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>PP2AB</td><td>Cell Signaling</td><td>4953</td><td>WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-AMPKa</td><td>Cell Signaling</td><td>2535</td><td>WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>actina</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778</td><td>WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:3000 referencia (figura): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>kit de depleción de linaje (ratón)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>purificación de células madre y progenitoras hematopoyéticas</td></tr><tr><td>Columnas LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td><td>purificación de células madre y progenitoras hematopoyéticas</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03 estimulación de</td><td>la fosforilación</td></tr><tr><td>APC-Cy7 c-kit anticuerpo</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>clasificación celular</td></tr><tr><td>anti-B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>clasificación de celdas</td></tr><tr><td>anti-CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>clasificación de celdas</td></tr><tr><td>anti-Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>clasificación de celdas</td></tr><tr><td>anti-Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>clasificación de celdas</td></tr><tr><td>anti-Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td> clasificación de <td>celdas</td></tr><tr><td>Placas espaciadoras con 1,0 mm integradas Espaciadores</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International</td><td>A30075</td> suero <td>bloqueador de membrana</td></tr><tr><td></td><td>Atlanta Biologicals</td><td>A12450</td><td>suplemento medio</td></tr><tr><td>contador de células</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMQAF1000 hemocitómetro</td> de recuento celular <td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; S17040</td> flim de <td>conteo de células</td></tr><tr><td></td><td>Denville Scientific</td><td>E3012</td><td>detección de señal</td></tr><tr><td>procesador de película médica</td><td>Konica</td><td>SRC-101A</td><td>Detección de señal</td></tr><tr><td>Supersignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidad Therom</td><td>Scientific</td><td>34096</td><td></td></tr><tr><td>Detección de señal Allegra X-15R (rotor SX4750A)</td><td>Beckman Coulter</td><td>X-15R</td><td>muestra preparación</td></tr><tr><td>BLUEstain escalera de proteínas</td> Gold <td>Biotechnology</td><td>P007-500</td><td>electroforesis</td></tr><tr><td>clasificador de células</td><td>BD</td><td>FACSAria II</td><td>preparación de muestras</td></tr><tr><td>Incublock</td><td>Denville Scientific</td><td>I0510</td><td>electroforesis</td></tr></tbody></table>

un western blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son las células raras, con la médula ósea de ratón con sólo 25.000 ~ fenotípica largo plazo HSCs repoblamiento. Un Western Blot protocolo fue optimizado y adecuado para el análisis de una pequeña cantidad de HSCs (células 500-15.000). HSCs fenotípicas fueron purificadas, contó con precisión y lisis directamente en Tampón Laemmli. Lisados que contiene igual número de células se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE), y lo blot fue preparado y procesadas siguiendo el estándar de Western Blot protocolos. Mediante este protocolo, 2.000-5.000 HSCs pueden analizarse de forma rutinaria, y en algunos casos pueden obtenerse datos de tan sólo 500 células, en comparación con las células de 20.000 a 40.000 registradas en la mayoría de las publicaciones. Este protocolo debe aplicarse generalmente a otras células hematopoyéticas y permite el análisis de rutina de un pequeño número de células utilizando procedimientos estándar del laboratorio.

Resultados representativos de 500-2.000 purificada HSCs y HPs se muestran en la figura 1 y figura 2. La señal de β-actina en la figura 1 se puede detectar desde tan sólo 500 HSCs y HPs purificaron de la médula ósea de un ratón. Tenga en cuenta que cargar los lisados en pozos de 1.5 mm produce una señal mucho más fuerte de 500 HPs que carga en pocillos de 3,0 mm. Figura 2...

Un estándar de Western Blot protocolo fue optimizado para el análisis de tan sólo 500 madre hematopoyética o células progenitoras. Optimización implica la cuidadosa manipulación de la muestra de células, limitando las transferencias entre los tubos y directamente lisis de las células en Tampón Laemmli.

Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

El objetivo principal de este protocolo de Western blot es realizar Western blots en un pequeño número de células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre hematopoyéticas, como la presencia o abundancia de proteínas específicas o la activación de vías de señalización. La principal ventaja de esta técnica es que requiere menos de 20.000 células, por lo que se necesitan menos animales para analizar poblaciones raras de células primarias.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando intentábamos encontrar formas de reducir el número de ratones que necesitábamos utilizar para los análisis de células madre hematopoyéticas. La demostración del procedimiento estará a cargo de Xiongwei Cai, un postdoc de mi laboratorio. Utilice un rotor de cubo oscilante para centrifugar tubos de 1,5 mililitros que contienen células madre y progenitoras hematopoyéticas clasificadas a 500 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Una vez finalizada la centrifugación, deseche todos menos 100 microlitros de sobrenadante, sin alterar la pastilla celular. Si hay menos de 5.000 células y el volumen de la muestra clasificada es inferior a 0,2 mililitros, transfiera primero las células a tubos de PCR de 0,2 mililitros de baja unión antes de la centrifugación. Sin embargo, si hay menos de 5.000 células, pero el volumen de la muestra clasificada es superior a 0,2 mililitros, centrifugar las células a 500 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de la centrifugación, deseche todo menos 200 microlitros de sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet y los 200 microlitros restantes de sobrenadante. A continuación, transfiera la suspensión de la celda a tubos de PCR de 0,2 mililitros y, de nuevo, centrifuga.Luego vuelva a suspender el pellet en 20 a 30 microlitros de sobrenadante y deseche el resto. Si es necesario, añadir solución salina tamponada con fosfato en suero bovino al 2% o albúmina sérica bovina al 2% a las células resuspendidas. A continuación, utilice un contador de células automatizado para determinar la concentración celular utilizando de dos a cinco microlitros de células resuspendidas.A continuación, utilice una punta de pipeta de 20 o 100 microlitros para transferir un volumen de 500, 1.000 y 2.000 células madre hematopoyéticas y progenitoras a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Utilice un rotor de cubo oscilante para centrifugar las células a cuatro grados centígrados a 500 veces la gravedad durante cinco minutos. A continuación, siga las instrucciones del fabricante para disolver la fosfatasa y el inhibidor del proteasoma y el DMSO para preparar una solución madre de 100 veces.A continuación, diluya el tampón de muestra Laemmli cuádruple con volúmenes equivalentes de agua destilada para hacer un tampón de muestra Laemmli doble. A continuación, añada cantidades adecuadas de la solución madre de 100 veces de fosfatasa e inhibidor del proteasoma para ajustar la concentración final a dos veces los inhibidores y dos veces el tampón de muestra de Laemmli. Ajuste el volumen de sobrenadante residual en el tubo de modo que la adición de volúmenes iguales de tampón Laemmli de dos veces junto con el inhibidor de fosfatasa y proteasoma logre una concentración final de 500 células por microlitro y un tampón Laemmli de pliegue.Y luego volver a suspender para formar el lisado. Antes de cargar el gel, caliente la muestra lisada a 95 grados centígrados en un bloque de calor durante cinco minutos. Utilizando protocolos estándar, electroforesis de uno a 40 microlitros de lisado equivalente a 500 a 20.000 células a través de la página SDS a 100 voltios.Después de tratar la membrana de polivinilideno con metanol durante segundos, lave brevemente la membrana con agua destilada. Luego, transfiera la proteína del gel a la membrana de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante del aparato de transferencia. Después de la transferencia, bloquee la membrana con dos mililitros de albúmina sérica bovina al 2% y solución salina tamponada con fosfato con 0,1%Tween durante la noche a cuatro grados Celsius de acuerdo con los protocolos estándar.Después de bloquear la membrana, incubarla con anticuerpos diluidos durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, lavar la membrana tres veces con solución salina tamponada con fosfato al 0,1%Tween 20 durante cinco minutos cada una a temperatura ambiente. A continuación, incube la membrana con dos mililitros de tampón de quimioluminiscencia mejorada durante un minuto a temperatura ambiente.Detecte las señales mediante un sistema de imágenes. Para comparar las señales de beta actina, se prepararon lisados a partir de células madre y progenitoras hematopoyéticas en orina y se sometieron a un análisis de parcelas occidentales. Está claro en el amino blot que hay una disminución en la señal de beta actina de los lisados preparados de 2.000 a 500 progenitores hematopoyéticos y células madre cargadas en pocillos de 1,5 milímetros en un gel de página SDS al 12%.Además, para comparar las señales de beta actina obtenidas de diferentes tamaños de pocillos fundidos en el gel. Los lisados se cargaron en pocillos de 1,5 y 3 milímetros en el gel y luego se sometieron a un análisis de Western blot. El blot muestra que la señal de beta actina obtenida del lisado preparado a partir de 500 progenitores hematopoyéticos cargados en un pocillo de 1,5 milímetros es mucho más fuerte que cuando se carga en un pocillo de tres milímetros.A continuación, para comparar las señales del factor de iniciación eucariota 4G, la actina y la fosforilación de la proteína ribosómica S6 en respuesta a la estimulación del factor de células madre citoquinas, se analizaron los lisados obtenidos mediante amino blot. El blot muestra la presencia de intensidades de señal más fuertes para las tres proteínas en los regenitores hematopoyéticos con estimulación del factor de células madre citocinas. En comparación con el control in vitro, también está claro que hay una intensidad de señal creciente para las tres proteínas de diferentes volúmenes de células madre hematopoyéticas.Una vez dominado, esto técnicamente se puede hacer en 48 horas. Si se aborda adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar contar con precisión las células y dirigir las células lisadas con un tampón de carga.Después de este desarrollo, técnicamente se peletiza para que los investigadores en el campo de la investigación con células madre exploren las vías de señal en un pequeño número de células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer el trazado occidental con un pequeño número de piezas de dirección. Tenga cuidado con las regiones que está utilizando para la página SDS.Gracias por mirar. Buena suerte con tus experimentos.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC)

Este video muestra una técnica para generar ratones del sistema inmunológico humano (HIS). Las células madre hematopoyéticas (HSC) CD34+ se aíslan de las células de la capa leucitaria de la sangre del cordón umbilical humano mediante perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos. Las HSC CD34+ se expanden en un medio de crecimiento enriquecido con citocinas y criopreservado. Finalmente, las HSC descongeladas se inyectan en una cría de ratón inmunodeficiente para establecer el modelo de ratón HIS.

Aislamiento de células madre hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical para generar ratones del sistema inmunitario humano

Se utilizaron análisis de ARN de secuenciación y bioinformática para identificar factores de transcripción expresados ​​diferencialmente significativamente y en subpoblaciones Lin-CD34 + y Lin-CD34 de ratón EMLcells. Estos factores de transcripción que podrían desempeñar un papel importante en la determinación del cambio entre las células Lin-CD34- auto-renovación de Lin-CD34 + y parcialmente diferenciado.

Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

Aquí presentamos la metodología para el análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas durante el desarrollo embrionario de ratón. Combinación de índice de clasificación de las células de la región aorta-gónada-mesonefros embrionaria con cocultivo de células endoteliales y trasplante para caracterizar las propiedades fenotípicas y el potencial de engraftment de precursores hematopoyéticos individuales.

Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

Los patrones de mutación somática en las células reflejan la exposición mutagénica anterior y pueden revelar relaciones de linaje del desarrollo. Aquí se presenta una metodología para catalogar y analizar mutaciones somáticas en células madre hematopoyéticas individuales y células progenitoras.

Caracterización de la carga mutacional y la composición clonal de la sangre humana

Células progenitoras hematopoyéticas (HSPC) transición de un estado de reposo a un estado de diferenciación debido a su plasticidad metabólica durante la formación de sangre. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la respiración mitocondrial y la glucólisis de los HSCCP.

Análisis del metabolismo de células hematopoyéticas del progenitor del tallo

Aquí describimos un método confiable para medir la masa mitocondrial y el potencial de membrana en células madre hematopoyéticas cultivadas ex vivo y células T.

Medición de la masa mitocondrial y el potencial de la membrana en células madre hematopoyéticas y células T por citometría de flujo

Este protocolo permite el mantenimiento de células madre hematopoyéticas humanas en reposo in vitro imitando el microambiente de médula ósea utilizando abundantes ácidos grasos, colesterol, concentraciones más bajas de citoquinas e hipoxia.

Un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes

Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.

Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal

Presentamos un protocolo paso a paso para el aislamiento de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSCs) y HSCs a corto plazo (ST-HSCs) utilizando el sistema reportero Hoxb5.

Método de aislamiento para células madre hematopoyéticas a largo y corto plazo

Aquí, establecimos osteoorganoides in vivo activados por andamios de gelatina cargados con proteína morfogenética ósea 2 para recolectar células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas para la reconstrucción de un sistema hematopoyético e inmunológico dañado. En general, este enfoque puede proporcionar una fuente celular prometedora para las terapias celulares.

Enfoque osteo-organoide in vivo para la recolección de células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas

Aprende un protocolo de Western blot optimizado para analizar solo 500 células madre hematopoyéticas mediante lisis directa en tampón Laemmli. Este método reduce el uso de animales y permite detectar proteínas específicas en poblaciones celulares raras.

Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas

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