Proyección de imagen 3D de alta resolución de la red Neuro-insular del páncreas humano

El objetivo general de este protocolo es demostrar un método de limpieza óptica pasivo optimizado que sea adecuado para su uso con tejido de páncreas humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, relacionadas con la diabetes, al proporcionar detalles sobre la inervación de los islotes. La principal ventaja de esta técnica es que el método de limpieza garantiza la transparencia del tejido pancreático humano para su uso en imágenes confocales de alta resolución.

Para comenzar, fije una muestra de páncreas colocándola en paraformaldehído al 4% recién preparado e incube la muestra a cuatro grados centígrados durante 48 horas. A continuación, enfríe un matraz colocándolo en un cubo con hielo. Y luego coloque el balde encima de una placa de agitación magnética.

Asegúrese de que el matraz esté plano y agregue una barra magnética para agitar. Vierta 147,8 mililitros de agua destilada desionizada helada en el matraz. A continuación, añada 20 mililitros de PBS 0,1 molar, 20 mililitros de una solución helada de acrilamida al 40%, 12,2 mililitros de una solución de paraformaldehído al 16% y 250 miligramos de iniciador VA-044.

Mezcle toda la solución de hidrogel durante al menos 10 minutos. A continuación, coloque un tubo cónico de 15 mililitros en el hielo junto al matraz que contiene la solución de hidrogel. Pipetee 14 mililitros de solución de monómero en el tubo.

y añadir una pieza de la muestra de tejido fija y seccionada. A continuación, tape el tubo. Incubar la muestra en la solución de monómero durante 3 días a cuatro grados centígrados, mientras se protege de la luz.

Después de la incubación, coloque la muestra en hielo. A continuación, conecte la tubería a un tanque de nitrógeno a través de una llave de paso. Mientras mantiene la muestra en hielo, use con cuidado una aguja hipodérmica de calibre 18 para perforar la tapa de un tubo cónico que contenga la muestra en un lado.

Inserte la aguja en el tubo hasta que quede debajo de la superficie de la solución líquida de monómero. Luego use otra aguja hipodérmica de calibre 18 para perforar el lado opuesto de la tapa, pero no permita que se sumerja en la solución, para que pueda actuar como un respiradero. Conecte el tubo del tanque de nitrógeno a la aguja hipodérmica sumergida debajo del hidrogel y encienda lentamente el nitrógeno, hasta que burbujee constantemente a través del líquido.

Una vez desoxigenado, retire rápidamente ambas agujas y cubra el tapón con una película de parafina, para evitar cualquier intercambio adicional de gases entre el tubo y el medio ambiente. Finalmente, coloque la muestra en una incubadora a 37 grados centígrados, durante tres horas, para polimerizar el hidrogel. Después de la polimerización, vierta el hidrogel restante.

A continuación, lave la muestra en 3 a 5 intercambios de PBS de 0,01 molares durante 15 minutos en cada paso de lavado. Una vez lavada, transfiera la muestra a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 40 mililitros o tampón de limpieza. Incubar la muestra en el tampón de aclarado a 37 grados centígrados y cambiar la muestra a un tampón de aclarado nuevo cada dos días.

Para verificar que el aclarado sea adecuado, sostenga la muestra frente a una luz y asegúrese de que la muestra permita que la luz la atraviese, pero que conserve algo de color tostado en las regiones exocrinas. Una muestra demasiado clara aparecerá deshilachada en los bordes y la textura será muy suave cuando se recoja con pinzas. Es común que una muestra se despeje de manera desigual.

Cambie el tampón de aclarado con PBS 0.01 molar de 40 mililitros y coloque las muestras en un agitador a 60 RPM durante un día a temperatura ambiente. Realice cuatro o cinco cambios de tampón y deje que el lavado final continúe durante la noche. A continuación, prepare el tampón de tinción PACT en un tubo de fondo plano de 2 mililitros y agregue un 2% de suero normal a 1 mililitro del tampón base PACT.

A continuación, añada aproximadamente cinco veces la cantidad estándar de anticuerpo primario al tampón de tinción. Con una espátula, retire la muestra del tampón de lavado y frote el exceso de tampón en una toalla de papel. Coloque la muestra en el tubo con la solución de anticuerpo primario e incube en la solución durante dos a cuatro días a temperatura ambiente, en un agitador, a 60 RPM.

Después de la incubación, retire la solución de anticuerpos y agregue PBS 0,01 molar. Lave las muestras a fondo en el agitador a 60 RPM, cambiando a tampón fresco cuatro o cinco veces y dejando el lavado final en el agitador durante la noche. A continuación, agregue el anticuerpo secundario de 1 a 200 en el tampón de tinción PACT con 2% de suero agregado.

Use una espátula para quitar la muestra del tampón de lavado y frote el exceso de tampón sobre una toalla de papel. A continuación, coloque la muestra en el tubo con la solución de anticuerpos secundarios. Proteja la muestra de la luz mientras incuba la muestra a temperatura ambiente en un agitador a 60 RPM durante dos días.

Después de la incubación, retire la solución de anticuerpos y reemplácela con PBS 0.01 molar. Lave las muestras a fondo en el agitador a 60 RPM, cambie a tampón fresco cuatro o cinco veces y deje el lavado final en el agitador durante la noche. Para comenzar, prepare el tampón de solución emparejado con el índice de refracción pesando primero 11 gramos de medio de gradiente de densidad no iónico y transfiriéndolo cuidadosamente a un tubo cónico de 50 mililitros.

A continuación, añada 5 mililitros de tampón de fosfato 0,02 molar con una espátula para liberar aire del medio de gradiente de densidad no iónico en polvo. Si es necesario, aumente el volumen a 10 mililitros, use más tampón de fosfato molar 0.02, mezcle con una espátula y luego raspe el exceso de la espátula en el tubo. Incubar el tampón a 37 grados centígrados hasta que se disuelva por completo, invirtiéndolo y mezclándolo suavemente periódicamente.

Transfiera las muestras al tampón de solución de coincidencia de índice de refracción e incube en el banco protegido de la luz durante dos a cuatro días antes de obtener imágenes. Justo antes de la toma de imágenes, coloque una pequeña cantidad de la solución de coincidencia de índice de refracción en un portaobjetos de ocho pocillos. A continuación, añada la muestra al pocillo y tape el portaobjetos.

En el páncreas humano, los islotes pueden ser delineados por insulina, glucagón y Grana Three secretados para las células beta, la célula alfa o todas las células endocrinas respectivamente. Las células de Schwann aparecen blancas y las células endocrinas se muestran teñidas con insulina o glucagón. Los nervios, que discurren junto a los vasos sanguíneos en la periferia de los islotes, se destacan como líneas blancas y se extienden hacia los islotes.

Aquí, se puede ver claramente el contacto entre las células de Schwann y las células endocrinas. Aquí, una muestra preparada con los métodos que se muestran en este video se tiñó para obtener péptido intestinal vasoactivo y se obtuvieron imágenes con un microscopio de lámina de luz. Las fibras nerviosas se ven claramente en alta resolución y se muestran envolviendo un conducto en primer plano y un ganglio en el fondo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe utilizar las regiones acinares del páncreas que estén libres de conductos y vasos principales.