Name: Generación y cultivo de Keratinocytes humanos primarios de piel adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprende a generar y cultivar queratinocitos humanos primarios a partir de piel adulta para estudiar biología cutánea in vitro. Este método permite investigar la diferenciación celular y enfermedades inflamatorias de la piel.

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El autor desea agradecer a Annette Blak Rasmussen y Kristine Moeller por su soporte técnico

La recogida de muestras de piel de voluntarios sanos adultos sometidos a cirugía plástica requiere la aprobación del Comité de ética en las instituciones de acogida. Este protocolo fue aprobado por la Regional ética Comité de región Midtjylland, Dinamarca (M-20110027). El método aquí descrito se deriva de estudios similares por Maciaq et al. 10 y11del Liu y Karasek.
1. aislamiento de queratinocitos de la piel humana
<ol>
	<li>Empezar haciendo las siguientes soluciones: solución de 50 mL de 0.25% tripsina y 0.1% glucosa en DPBS. Mix y el filtro de esterilización (0,2 μm) la solución. Preparar 10 mL de RPMI 1640 + 2% solución FBS, 50 mL de medio sin suero DPBS y queratinocitos (KSFM). Añadir suplementos KSFM y 250 μl de gentamicina a 500 mL de KSFM. Caliente previamente la solución a 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Recoger la piel de voluntarios sanos adultos sometidos a cirugía plástica. Las muestras de piel utilizadas son aproximadamente 10 cm x 15 cm, pero pueden variar de tamaño. Enfriar la piel bajo transporte de transporte de las muestras de piel en una caja de espuma de poliestireno que contienen un elemento de enfriamiento. Si es necesario, la muestra de piel puede almacenarse a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Quitar la grasa de debajo de la sección de la piel con pinzas, bisturís y tijeras esterilizadas.</li>
	<li>La hebilla de la sección de la piel (aproximadamente 10 cm x 15 cm) en una cubierta estéril sobre una placa con agujas. Primero, limpie la piel con una gasa esterilizada seca. Después, limpie la piel con una gasa esterilizada con etanol al 70%.</li>
	<li>Usando un cepillo de pies, corte de la capa superior (epidermis) de la sección de la piel y ponerla en un plato de Petri de 9 cm. Entonces, inmediatamente agregar 25 mL de la solución de tripsina/DPBS/glucosa (preparada en el paso 1.1) a la caja Petri. Incubar durante 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Usando una pipeta retirar la solución de tripsina/glucosa/DPBS de la caja Petri y añadir 10 mL de RPMI 1640 + 2% FBS para inactivar la tripsina.</li>
	<li>Utilizando dos pinzas, ahora liberan las células epidérmicas en el medio suavemente raspando y agitar el epidérmico y el compartimiento cutáneo de las secciones de la piel.</li>
	<li>Filtrar la suspensión de células epidérmicas a través de un filtro de metal (tamaño de orificio de 1 mm) y recoger en un tubo de 50 mL. Añadir las secciones restantes de la piel a un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de RPMI-1640 sin FBS y vortex para filtro de 10 s. la suspensión a través del metal del filtro en un tubo de 50 mL que contiene la suspensión de células epidérmicas. Añadir DPBS hasta un volumen total de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión celular por 10 min a 450 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células epidérmicas en aproximadamente 10 mL de 37 ° C KSFM dependiendo del tamaño de la pelotilla de la célula. Contar las células con el azul de tripano tinción bajo microscopio. El número de células obtenidas de una sección de piel de 10 cm x 15 cm es aproximadamente 50-100 x 106 células. A cada frasco de cultivo de 75 cm2 , 8 x 106 células junto con 12 mL de 37 ° C KSFM de transferencia. Sacuda suavemente los frascos de cultivo para asegurar una distribución uniforme de las células.</li>
	<li>Incubar los queratinocitos en una incubadora de 37 ° C con 100% humedad y 5% CO2. Cambiar el medio después de 2 días y tres veces semanalmente. Células de paso cuando la cultura es 70-80% confluente, que tarda aproximadamente 2 semanas dependiendo de la tasa de proliferación de los queratinocitos.</li>
</ol>
2. pases de queratinocitos
<ol>
	<li>Calentar la cantidad apropiada de solución de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C en una incubadora. 4,5 mL de solución al 0.05% tripsina-EDTA se utiliza para un frasco de cultivo de 75 cm2 .</li>
	<li>Retire el medio de las células y añadir frasco de 4,5 mL/75 cm2 cultura previamente calentado 0.05% solución de tripsina-EDTA a las células. Coloque el frasco de cultivo en la incubadora (37 ° C) y después de aproximadamente 5 minutos, comprobar al microscopio si las células han comenzado a aflojar.</li>
	<li>Cuando aproximadamente el 50% de las células se hayan aflojado, golpear suavemente el frasco de cultura contra la mano para aflojar las células restantes. Luego, para inactivar la tripsina, añadir 6 mL de RPMI 1640 + 2% FBS (37 ° C) al matraz de cultivo 75 cm2 y transferir la suspensión a tubos de 50 mL.</li>
	<li>Enjuague los frascos de cultivo con 3 mL de RPMI 1640 + 2% FBS y añadir a los tubos de 50 mL. Centrifugar las células durante 10 min a 450 x g a temperatura ambiente.
	<ol>
		<li>Resuspender las células concentradas en 10 mL de KSFM (37 ° C). Contar las células y la transferencia de 3 x 106 células a un matraz de cultivo de 150 cm2 con 20 mL de KSFM (37 ° C). Agite suavemente el frasco de cultivo para asegurar una distribución uniforme de las células. Congelar las células cuando la cultura es 80-90% confluente, que toma aproximadamente 4 a 6 días dependiendo de la tasa de proliferación de los queratinocitos (ver sección 3, a continuación del Protocolo de congelación). Ampliar los queratinocitos para generar adecuadas acciones congeladas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. congelación de los queratinocitos
<ol>
	<li>Calentar la cantidad apropiada de solución de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C en una incubadora. 9 mL de solución al 0.05% tripsina-EDTA se utiliza para un frasco de cultivo de 150 cm2 .</li>
	<li>Retire el medio de las células y añadir frasco de 9 mL/150 cm2 cultura previamente calentado 0.05% solución de tripsina-EDTA a las células. Coloque el frasco de cultivo en la incubadora (37 ° C) y después de aproximadamente 5 minutos, comprobar al microscopio si las células han comenzado a aflojar.</li>
	<li>Cuando aproximadamente el 50% de las células se hayan aflojado, golpear suavemente el frasco de cultura contra la mano para aflojar las células restantes. Entonces, para inactivar la tripsina, añadir 12 mL de RPMI 1640 + 2% FBS (37 ° C) en el matraz de 150 cm2 cultura y aspirar la suspensión celular en tubos de 50 mL.</li>
	<li>Enjuague los frascos de cultivo con 6 mL de RPMI 1640 + 2% FBS y añadir a los tubos de 50 mL. Centrifugar los tubos durante 10 min a 450 x g a 4 ° C. Preparan celda helada congelación medio (KSFM + 10% DMSO).</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en KSFM + 10% DMSO, contar las células y congelar las células a una densidad de 6 x 106 células/mL con estándar de métodos de criopreservación congelación lenta12.</li>
	<li>Almacenar los keratinocytes en nitrógeno líquido (fase vapor) hasta que esté listo para usar.</li>
</ol>
4. descongelación y cultivo de queratinocitos congelados
<ol>
	<li>Rápidamente descongelar los viales congelados apropiados en un baño de agua de 37 ° C. Utilizar el etanol del 70% para limpiar el exterior de la cryovial. Transferir el número apropiado de células (aproximadamente 15.000 células/cm2) a un matraz de cultivo y añadir medio precalentado (KSFM) al matraz de cultivo. Cualquier tamaño de frascos de cultivo se puede utilizar dependiendo de la configuración del experimento.</li>
	<li>Utilizar medio de cultivo 5 mL para un frasco de cultivo de 25 cm2 .</li></ol>El número de células ha añadido que al matraz de cultivo puede variar ya que el crecimiento de las células varía de un donante a donante. Incubar las células en una incubadora de 37 ° C con 100% humedad y 5% CO2.
	<li>Cambio el medio después de 2 días y tres veces semanalmente usando fresco KSFM precalentado. Nota: Los datos han demostrado que en promedio el 95% de las células aisladas por el protocolo descrito aquí son positivo para el marcador del keratinocyte citoqueratina 1413.</li>

<ol><li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li>
<li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes%3A+key+immunocytes+of+the+integument%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li>
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<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li>
<li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets+Inflamm+Allergy%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li>
<li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li>
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<li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li>
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<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li>
<li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li>
<li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li>
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<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).</li>
<li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li>
<li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment%3A+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li>
<li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li>
</ol>

. El autor no tiene conflicto de interés.

Aquí, describimos cómo fácilmente aislar queratinocitos humano primario de piel adulto y su cultivo en vitro. Este modelo puede tener un amplio uso para la investigación de Biología de la célula epidérmica y puede ser útil para los investigadores interesados en el estudio de enfermedades cutáneas.
Algunas de las ventajas del protocolo descrito aquí es que en contraste con queratinocitos de prepucio neonatal de los varones recién nacidos sometidos a la circuncisión, keratinocytes human...

La piel es el órgano más grande del cuerpo humano y sirve como una barrera protectora contra el medio ambiente externo. La piel se compone de dos capas principales: la dermis y la epidermis, donde la epidermis constituye la capa más externa de la piel. El tipo de célula más abundante en la epidermis es keratinocytes que comprende más del 95% de la masa1,de célula2. Los queratinocitos se mantienen en distintas etapas de diferenciación de la epidermis y se organizan en estratos basals, espinosas, granuloso y cornified que corresponden a etapas específicas de diferenciación3. La función principal de los queratinocitos es proporcionar la integridad estructural de la epidermis, produciendo una barrera intacta al mundo exterior.
Los queratinocitos también representan la primera línea de defensa contra patógenos en la piel y por lo tanto juegan un papel importante en la respuesta inmune innata4,5. Exposición de los queratinocitos a los estímulos externos conduce a la activación de vías de señalización intracelular y posteriormente, producción de un número de varios mediadores inflamatorios como citoquinas, quimiocinas y péptidos antimicrobianos. Estas proteínas derivados de queratinocitos participan en la respuesta inflamatoria por reclutar y activar las células inmunes tales como células dendríticas, neutrófilos y específicos6,de las células de T7. Así, porque los queratinocitos desempeñan un papel crucial en numerosos procesos biológicos, el fundamento de la técnica presentada aquí fue generar un modelo en vitro para estudiar la biología de la piel. Cultivos de queratinocitos primarios obtenidos de prepucio neonatal se utilizan a menudo para estudiar la piel biología8,9. Sin embargo, con la técnica descrita aquí, queratinocitos de ambos sexos se obtienen dando por resultado una mayor diversidad biológica de las células.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento y la generación de keratinocytes humanos primarios de piel de adultos, incluyendo el mantenimiento y la congelación de los queratinocitos. El objetivo general de este método es generar keratinocytes humanos primarios que pueden utilizarse como modelo para estudiar biología cutánea in vitro.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034 Medio de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Suplementos de KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Suplementos para KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS sin DMSO de calcio y magnesio</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimetilsulfóxido</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Aditivo para medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Filtro de esterilización</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,2 y micro; m</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Se utiliza para tripsinizar células</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-RPMI-1640</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Se utiliza para inactivar</td></tr><tr><td>pinzas</td><td></td> de <td>tripsina:</td> <td>se pueden utilizar</td></tr> <tr>pinzas de cualquier empresa<td>Tijeras</td><td>:</td><td></td> se <td>pueden usar tijeras de cualquier empresa</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Los bisturíes de cualquier empresa se pueden usar</td></tr><tr><td>70% de etanol</td> <td>-</td><td>--</td> -<td>-</td></tr><tr><td>Almohadillas de gasa</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>Se pueden usar almohadillas de gasa de cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Cepilladora de pie</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>Se puede utilizar una cepilladora de pie de cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Se pueden utilizar placas de Petri de cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Filtro metálico</td><td></td> <td>interno</td> <td>Filtro metálico de 1 mm de tamaño de agujero</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo de 75 cm2</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>156499-150 cm2 matraces de cultivo</td><td>TTP</td><td>90151-0.05</td><td></td></tr><tr><td>% Solución de tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Se utiliza para tripsinizar células al pasar</td></tr></tbody></table>

generación y cultivo de keratinocytes humanos primarios de piel adulto

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

La función principal de los queratinocitos es proporcionar la integridad estructural de la epidermis, manteniendo una barrera mecánica al mundo exterior. Además, queratinocitos juegan un papel esencial en la iniciación, mantenimiento y regulación de la respuesta inmune epidérmica por ser parte del sistema inmune innato responde a los estímulos antigénicos de una manera rápida y no específica. Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento de keratinocytes humanos primarios de la piel adulta y demostrar que estas células responden a la diferenciación terminal inducida por calcio, medida por un aumento de expresión de la diferenciación marcador involucrin. Además, mostramos que los queratinocitos aislados responden a la activación de vías de señalización intracelular inducida por IL-1β como es medido por la activación de la vía de p38 MAPK. Tomados en conjunto, se describe un método para el aislamiento y cultivo de keratinocytes humanos primarios de la piel adulta. Porque los queratinocitos son el tipo celular predominante en la epidermis, este método es útil para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea in vitro.

Diferenciación Terminal inducida por calcio Keratinocytes humanos experimentan diferenciación terminal sobre el tratamiento con calcio14,15,16. Queratinocitos humanos primarios fueron aisladas y cultivadas como se describe en el protocolo anterior. Cuando aproximadamente 50-60% de confluencia, las células fueron estimuladas con calcio (1,2 mM) o vehículo y fotografías de las células fueron tomadas en el día 0...

La piel humana actúa como primera línea de defensa contra el medio ambiente externo. Presentamos un método para aislar queratinocitos humano primario de piel adulto. Estos queratinocitos aislados son útiles en numerosas configuraciones experimentales y son un modelo muy adecuado para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea en vitro.

Generación y cultivo de Keratinocytes humanos primarios de piel adulto

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

El objetivo general de este procedimiento es generar queratinocitos humanos primarios que puedan utilizarse como modelo para estudiar la biología cutánea in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular epidérmica, como cómo se regula la diferenciación de los queratinocitos humanos o como modelo para estudiar las enfermedades inflamatorias de la piel. Las principales ventajas de esta técnica son que los queratinocitos humanos primarios se pueden aislar convencionalmente de la piel adulta tanto de hombres como de mujeres y pueden incluir piel de personas de cualquier edad mayores de 18 años.La demostradora del procedimiento estará a cargo de Annette Blak Rasmussen, una técnica de mi laboratorio. Para empezar, prepare una solución de 50 mililitros de 0,25% de tripsina y 0,1% de glucosa en DPBS. Luego, mezcle y filtre la solución.Prepare 10 mililitros de RPMI 1640 más 2% de FBS, 50 mililitros de DPBS y medio libre de suero de queratinocitos, o KSFM. Agregue suplementos de KSFM y 250 microlitros de gentamicina a 500 mililitros de KSFM. Luego, precaliente las soluciones a 37 grados centígrados antes de usarlas.Recoja muestras de piel de 10 centímetros por 15 centímetros de voluntarios adultos sanos que se sometan a cirugía plástica. Mantenga la piel fresca transportando las muestras de piel en una caja de espuma de poliestireno que contenga un elemento refrigerante. Si es necesario, almacene la muestra de piel a cuatro grados centígrados durante la noche.Con tijeras, bisturíes y pinzas esterilizadas, retire la grasa de debajo de la sección de la piel. Luego, con agujas, abroche la sección de piel sobre una cubierta estéril encima de un plato. Con una gasa seca y esterilizada, limpie la piel.A continuación, siga con etanol al 70% en una gasa esterilizada. A continuación, con una cepilladora de pies, corte la capa epidérmica superior de la sección de piel y transfiérala a una placa de Petri de nueve centímetros. Luego, agregue inmediatamente 25 mililitros de la solución de glucosa de tripsina DPBS previamente preparada a la placa de Petri.Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Con una pipeta, retire la solución de glucosa de tripsina DPBS de la placa de Petri y agregue 10 mililitros de RPMI 1640 más 2%FBS para inactivar la tripsina. Ahora, con dos pinzas, libere las células epidérmicas en el medio raspando y agitando suavemente tanto el compartimento epidérmico como el dérmico de las secciones de piel.Filtre la suspensión de células epidérmicas a través de un filtro metálico y recoja el filtrado en un tubo de 50 mililitros. Agregue las secciones de piel restantes a un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de RPMI 1640 sin FBS y vórtice durante 10 segundos. Filtre esta suspensión a través del filtro de metal en un tubo de 50 mililitros que contiene la suspensión de células epidérmicas.Luego, agregue DPBS hasta un volumen total de 50 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 450 veces G y temperatura ambiente, durante 10 minutos. Luego, retire el sobrenadante y, dependiendo del tamaño del pellet de celda, vuelva a suspender el pellet de celda epidérmica en aproximadamente 10 mililitros de 37 grados Celsius KSFM.Usando el método de tinción con azul de tripano, cuente las células bajo un microscopio. Luego, a cada matraz de cultivo de 75 centímetros cuadrados, transfiera ocho veces 10 a la sexta celda, junto con 12 mililitros de KSFM de 37 grados centígrados. Agite suavemente los matraces de cultivo para asegurar una distribución uniforme de las células.Incubar los queratinocitos en una incubadora a 37 grados centígrados con 100% de humedad y 5% de CO2. Cambie el medio después de dos días y luego tres veces por semana. Cuando las células alcancen el 70-80% de confluencia, mantenga la cantidad adecuada de solución de EDTA al 0,05% de tripsina a 37 grados Celsius en una incubadora.Retire el medio de las células y añada 4,5 mililitros por matraz de cultivo de 75 centímetros cuadrados de solución de EDTA precalentada al 0,05% de tripsina a las células. Después de colocar el matraz de cultivo en la incubadora a 37 grados centígrados durante aproximadamente cinco minutos, verifique bajo el microscopio si las células han comenzado a aflojarse. Cuando aproximadamente el 50% de las células se hayan aflojado, golpee suavemente el matraz de cultivo contra la mano para aflojar las células restantes.Luego, para inactivar la tripsina, agregue seis mililitros de 37 grados Celsius RPMI 1640 más 2%FBS al matraz de cultivo de 75 centímetros cuadrados y transfiera la suspensión celular a tubos de 50 mililitros. Enjuague los matraces de cultivo con tres mililitros de RPMI 1640 más 2%FBS y agregue el medio a los tubos de 50 mililitros. A continuación, centrifugar las células durante 10 minutos a 450 veces G y temperatura ambiente.Use 10 mililitros de KSFM de 37 grados Celsius para volver a suspender las celdas peletizadas. Luego, cuente y transfiera tres veces 10 a las sextas celdas a un matraz de cultivo de 150 centímetros cuadrados, junto con 20 mililitros de KSFM de 37 grados Celsius. Agite suavemente el matraz de cultivo para asegurar una distribución uniforme de las células, antes de devolverlas a la incubadora.Cuando el cultivo sea 80-90% confluente, después de tripsinizar y transferir las células a tubos de 50 mililitros, como se demostró anteriormente en este video, enjuague los matraces de cultivo con seis mililitros de RPMI 1640 más 2% FBS y agréguelo a los tubos de 50 mililitros. Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 450 veces G y cuatro grados centígrados. Luego, prepare un medio de congelación de celda helado.Vuelva a suspender el pellet de celda en KSFM más 10% DMSO. Luego, después de contar las células, congélelas a una densidad de seis veces 10 a la sexta célula por mililitro, utilizando métodos estándar de criopreservación de congelación lenta. Almacene los queratinocitos en nitrógeno líquido hasta que estén listos para usar.Como se ve aquí, los queratinocitos humanos fueron aislados y cultivados, como se demuestra en este video, y luego estimulados con calcio. Estas imágenes muestran los cambios morfológicos debidos a la adición de calcio en los días uno y dos, en comparación con las células tratadas controladas. Además de los cambios morfológicos, la adición de calcio también resultó en un aumento en la transcripción del ARNm para el marcador de diferenciación involucrina, 5,5 veces después de 24 horas y 3,5 veces después de 48 horas.En este experimento, los queratinocitos cultivados se estimularon con IL-1 beta durante varios períodos de tiempo. Como se observó en Western blot, en cinco minutos, la estimulación de IL-1 beta condujo a una fosforilación de activación rápida de la quinasa p38 MAP, ya que la estimulación de IL-1 beta no tuvo ningún efecto sobre los niveles totales de proteínas de la quinasa p38 MAP. Después de una hora, la fosforilación de la quinasa p38 MAP inducida por IL-1 beta volvió a los niveles basales.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de las células epidérmicas humanas exploraran el papel de los queratinocitos en las respuestas inmunitarias innatas, así como en el desarrollo de la piel. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar y cultivar queratinocitos primarios de piel humana adulta, que se puede usar como modelo para estudiar la biología cutánea in vitro.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Una forma rápida y robusta de aislar células viables de adultos epiteliales madre de la piel humana se describe. El método utiliza la digestión enzimática de la matriz de colágeno la piel, seguido por el punteo de los folículos pilosos y el aislamiento de las suspensiones de células individuales o fragmentos de tejido para el cultivo celular.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas epiteliales de la piel humana

Este video describe el aislamiento de queratinocitos, las células más prominentes de la capa epidérmica de la piel humana, mediante el empleo de una combinación de métodos de digestión enzimática y disrupción mecánica. Este método ayuda en el crecimiento preferencial de los queratinocitos sobre otros tipos de células de la piel utilizando un medio de crecimiento selectivo.

Aislamiento de queratinocitos de piel humana: un método para cultivar queratinocitos primarios a partir de muestras de piel

Este video describe un protocolo detallado para producir retrovirus recombinante de queratinocitos humanos primarios modificados genéticamente. Este método se puede utilizar para manipular la expresión génica en los queratinocitos.

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Este manuscrito proporciona un procedimiento paso a paso para la derivación y el mantenimiento de queratinocitos humanos a partir de pelo arrancado y la posterior generación de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) libres de integración por vectores episomales.

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El objetivo de este artículo es proporcionar un protocolo completo y detallado sobre cómo generar piel organotípica humana modificada genéticamente a partir de queratinocitos epidérmicos y dermis humana desvitalizada.

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Los queratinocitos epidérmicos forman una barrera cutánea funcional y se sitúan en la línea de frente de la defensa del huésped contra insultos ambientales externos. Aquí se describen métodos de aislamiento y cultivo primario de queratinocitos epidérmicos de piel de ratón neonatal y adulto, e inducción de diferenciación terminal y respuesta inflamatoria desencadenada por UVB a partir de queratinocitos.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto

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Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

Este protocolo describe un método sencillo para cultivar epidermis humana reconstituida tridimensional de una manera reproducible y robusta. Además, caracteriza la relación estructura-función del modelo de barrera epidérmica. Las respuestas biológicas de la epidermis humana reconstituida sobre estímulos proinflammatory también se presentan.

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Aquí describimos un protocolo para el cultivo sistemático de esferoides epidérmicos en cultivo de suspensión 3D. Este protocolo tiene una amplia gama de aplicaciones para su uso en una variedad de tipos de tejidos epiteliales y para el modelado de varias enfermedades y afecciones humanas.

Establecimiento de un sistema de cultivo de esferoides epidérmicos de alto rendimiento para modelar la plasticidad de las células madre de queratinocitos

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Aislamiento y cultivo de queratinocitos orales primarios del paladar del ratón adulto

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Aprende a generar y cultivar queratinocitos humanos primarios a partir de piel adulta para estudiar biología cutánea in vitro. Este método permite investigar la diferenciación celular y enfermedades inflamatorias de la piel.

Generación y cultivo de Keratinocytes humanos primarios de piel adulto

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