Name: Cinemática ocular midiendo In Vitro la estimulación de los nervios craneales en la tortuga (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprende a medir la cinemática ocular en tortugas mediante estimulación de nervios craneales in vitro. Este protocolo electrofisiológico permite cuantificar rotaciones oculares y cambios pupilares sin entrenamiento previo.

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Los autores agradecen a la Sra. Paulette McKenna y Lisa Pezzino en este estudio para apoyo secretarial y Sr. Phil Auerbach para soporte técnico. Los autores también agradecen los Drs. Michael Ariel y Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) para introducirnos a la preparación principal en vitro aislado. Fondos para apoyo de esta colaboración fue proporcionada por el Departamento de Biología (Robert S. Chase fondo), la Comisión de investigación académica y el programa de Neurociencia en la Universidad de Lafayette. Por último, este trabajo está dedicado al Sr. Phil Auerbach, quien falleció el 28 de septiembre de 2016; había desarmado de un microscopio electrónico de barrido y reconoce la utilidad de su etapa de 5 ejes para el uso de este protocolo. Su amistad y su ingenio se echará de menos enormemente.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Pasos críticos:
Los pasos críticos en este protocolo son los siguientes: 1) la disección y el cuidado para mantener la viabilidad de los nervios seccionados; 2) la correspondencia de los tamaños de los electrodos de succión para los nervios craneales para proporcionar respuestas coherentes; y 3) la colocación de la cabeza en el cardán para proporcionar la calibración adecuada de la rotación del ojo.
Solución de problemas:
La disección puede ser...

Justificación para el uso de las tortugas de orejas rojas Slider en experimentos electrofisiológicos:
Resbalador Rojo-espigado tortugas (Trachemys scripta elegans), son considerados uno de los peores de las especies invasoras del mundo1 y puede indicar que un ecosistema está en problemas. La razón de por qué tienen tanto éxito las tortugas resbalador Rojo-espigado es mal entendida pero en parte puede ser debido a su fisiología tolerante y posesión de los tejidos nerviosos que pueden sobrevivir bajo condiciones hipóxicas2,3,4 . Uso para experimentación no amenaza a sus números y con esfuerzos mínimos, preparaciones electrofisiológicas pueden permanecer viables sobre duraciones extendidas, tanto como 18 horas5,6. El beneficio es similar a la ventaja de usar animales invertebrados como cangrejos7, que también tienen la capacidad de resistir bajos niveles de oxígeno8.
Técnicas para la medición de movimientos de los ojos:
Enfoques para medir los movimientos oculares en animales frontal-eyed con primates no humanos han sido bien desarrolladas9. El ojo gira en la órbita alrededor de tres ejes: horizontal, vertical y torsional. El método de la bobina de búsqueda magnético se considera generalmente el más confiable para medirlas rotaciones, pero es invasivo, que requiere pequeñas bobinas para ser insertado en el scleras de animales10,11. Sistemas de video también pueden medir rotaciones y tienen la ventaja de ser no invasivo. El desarrollo de mejores cámaras con procesamiento de imágenes innovadoras han mejorado su funcionalidad hacer sistemas basados en vídeo una alternativa atractiva al considerar12,13,14.
Las técnicas desarrolladas para la medición de movimientos de los ojos en nonmammals han sido mucho menos importantes. Las medidas son cualquiera baja resolución o describen sólo algunas de las rotaciones15,16,17,18. La falta de desarrollo puede ser parcialmente atribuyó a la dificultad de nonmammals de formación a seguir objetivos visuales. Aunque los movimientos de los ojos han sido bien estudiados en el resbalador Rojo-espigado tortugas19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, debido al desafío en animales del entrenamiento para realizar un seguimiento de objetivos, la cinemática exacta de sus movimientos del ojo está mal entendido.
Tortugas resbalador Rojo-espigado generalmente son considerados como vertebrados con ojos laterales, pero porque puede retraer completamente su cabeza en su concha31, obstrucción significativa de los campos de visión lateral por el caparazón produce32. El resultado es que su línea de vista visual es forzado hacia el frente, haciendo que se comporte más como mamíferos frontal-eyed. Por lo tanto, su uso como un modelo para el desarrollo de enfoques para la medición de movimientos de los ojos también ofrece una perspectiva evolutiva única.
El protocolo descrito en este trabajo utiliza una preparación de cabeza en vitro aislado para identificar la cinemática de los movimientos del ojo en las tortugas de orejas rojas slider. Se disecan los cerebros de los cráneos dejando intactos los nervios craneales. Las cabezas se colocan en un cardán para calibrar los movimientos de los ojos y evocar respuestas por estimulación eléctrica de los nervios craneales inervan los músculos del ojo. Medidas de rotaciones por los ojos se realizan mediante un sistema basado en el video, usando algoritmos de software, que la pista la pupila oscura y las manchas del iris. La preparación proporciona la oportunidad de medir cinemática de ambos extraocular (es decir, rotación horizontal, vertical o torsional)32 y intraocular (es decir, cambios de la pupila)33 movimientos.
Sistema modelo para el análisis de vías nerviosas eferentes:
Más generalmente, el enfoque proporciona a los investigadores la oportunidad para estudiar señales neuronales eferentes cómo generar movimientos de los ojos cuando los músculos de sus Estados relajados y en la ausencia de información sensorial integrada, procesada por el cerebro32, 33. Por lo tanto, la cinemática del ojo puede ser examinada en un sistema modelo en el que únicamente son procesados por la vía neural eferente dejando el cerebro y conectado a los músculos.

<table><tbody><tr><td>Tortugas deslizadoras de orejas rojas</td><td>Kons Scientific</td><td>Trachemys scripta elegans</td><td>Tamaño grande (longitud del caparazón 15-20 cm)</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Corido de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M7304</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>C5767</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico concentrado</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>H7020</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Oakton</td><td>pH 6+</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de estimulación de succión</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td>Electrodo de succión bipolar. Tenga en cuenta que 573000 ha sido reemplazado por 573050.</td></tr><tr><td>Vidrio capilar</td><td>A-M systems</td><td>626000</td><td>Vidrio capilar de borosilicato de un solo barril sin microfilamento, longitud 10 cm, diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,50 mm</td></tr><tr><td>Electrodo de estimulación de succión alternativo</td><td>A-M Systems</td><td>573050</td><td>Electrodo de succión bipolar. Requiere vidrio capilar de mayor diámetro: 627000, diámetro exterior 1,2 mm, diámetro interior 0,68 mm</td></tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Lieca</td><td>GZ7</td><td>Rango de aumento, 10x &ndash; 70x</td></tr><tr><td>Fuente de luz de fibra óptica</td><td>Amscope</td><td>HL250-A</td><td>150W Caja de luz iluminadora de microscopio de fibra óptica</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>625654</td><td>acero inoxidable, resorte recto, 5.25"</td></tr><tr><td>Sonda de disección roma</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>627405</td><td>Sonda del centro comercial Huber, sonda y buscador de doble extremo,</td></tr> <tr><td>6" Microtijeras Carolina</td><td>Biological Supply Company</td><td>623555</td><td>Tijeras de microdisección Iris, acero inoxidable, cuchillas de 0.5", 4.75" de largo</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>F6521</td><td>Pinzas de joyería, dumont No. 5, aleación de acero inoxidable, pinzas curvas de 4.25"</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>Z168696</td><td>Punta mediana, pinzas curvas, acero inoxidable,</td></tr> <tr><td>mango de bisturí</td> de 4" <td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S2896</td><td>Mangos de bisturí, n.º 3, acero inoxidable</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>S2771</td><td>Hojas de bisturí, n.º 11, acero</td></tr><tr><td>Guillotina</td><td>Aparato Harvard</td><td>73-1918</td><td>Guillotina Kleine tipo 7575</td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Sigma</td><td>Z648299</td><td>Micro cuchara y espátula juego de pesaje. Use una espátula pequeña: 5.9" largo x 0.07" Diámetro del mango con extremo cuadrado: 0.17" x 1.3" largo, otro extremo redondo: 0.17" x 1.27" </td></tr><tr><td>Gancho</td> largo <td>Autozone</td><td>98069</td><td>Juego de ganchos y ganzúas SureBilt. Use el molinillo para desafilar las puntas afiladas del gancho para evitar lesiones en la boca de los animales.</td></tr><tr><td>95/5% O2/CO2</td><td>Airgas, Inc.</td><td>X02OX95C2003102</td> 5<td>% Mezcla de gases estándar certificada con oxígeno de equilibrio de dióxido de carbono, cilindro de tamaño 200, regulador CGA-296</td></tr><tr><td></td><td>Airgas, Inc.</td><td>Y11244D296-AG Regulador de</td><td>cilindro analítico de latón de una sola etapa 0-100 psi CGA-296 con salida de aguja. Utilice una válvula de tubo de línea de aire ajustable de latón para pasar de un tubo de línea de vinilo de 3/8" de diámetro interior conectado al regulador a una conexión de línea de aire de 3/16", de diámetro interior, que va a la pipeta de piedra difusora o de vidrio pasteur.</td></tr><tr><td>Válvula de tubo de línea de aire ajustable</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-12061 Válvula de</td><td>latón</td></tr><tr><td>Mesa rígida</td><td>Desconocido</td><td>Desconocido Puerta</td><td>de autoclave colocada encima de una mesa resistente. Nueve pelotas de tenis de 5" de diámetro aíslan las vibraciones de la superficie superior de la mesa.</td></tr><tr><td>Pelota de tenis de 5"</td><td>Petco Animal Supplies, Inc.</td><td>712868</td><td>Pelota de tenis Petco Jumbo Pet: las pelotas no están cortadas y se mantienen dentro de un marco integrado en la parte inferior de la puerta del autoclave.</td></tr><tr><td>Mesa alternativa de aislamiento de vibraciones</td><td>Newport Corporation</td><td>INT1-36-6-N Sistema de control de</td><td>vibraciones rígido, integridad 1: Dimensiones de la superficie, 3' x 6'</td></tr> <tr><td>Gimbal</td><td>ISI, International Scientific Instruments, Inc.</td><td>Etapa de la</td><td>etapa excéntrica de 5 ejes EM de escaneo SUPER III-A: X, Y movimientos lineales Z, &plusmn; 20 mm, precisión de 0,1 mm; Rotaciones, verticales, &plusmn; 10&deg;, y horizontal, &plusmn; 12.5&deg;, con 1.25&deg; precisión. Nota: del instrumento de desmantelamiento.</td></tr><tr><td>Mandril para cardán</td><td>Desconocido Desconocido</td><td></td> El <td>mandril de un viejo micrótomo de fabricación desconocida fue mecanizado para adaptarse al eje del portamuestras del cardán alternativo de la etapa EM de escaneo</td></tr><tr><td></td><td>ThorLabs, Inc.</td><td>GN2/M con MBT602/M</td><td>Goniómetro de doble eje (GN2/M) montado en una platina de microbloque de 3 ejes con ajustadores de tornillo de mariposa (MBT602/M): diseñe un mandril para sujetar la cabeza de tortuga con el ojo a 12,7 mm por encima de la superficie superior del goniómetro (distancia al punto de rotación)</td></tr><tr><td>Sistema de seguimiento ocular basado en vídeo</td><td>Arrington Research, Inc.</td><td>ViewPoint EyeTracker, PC-60 Método de</td><td>seguimiento: Vídeo infrarrojo con pupila oscura; Cámara en blanco y negro (Artículo BC02): 30 Hz, 640 x 480; Requisitos del sistema: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Rango visual: Horizontal +/- 44&deg;; vertical +/- 20&deg;; Precisión ~0.5&deg;; Resolución espacial ~0.15&deg;; Resolución del tamaño de la pupila ~0,03 mm; Datos oculares: X, Y, posición de la mirada, altura y anchura de la pupila, torsión, tiempo delta, tiempo total y regiones de interés (ROI); Comunicación en tiempo real (artículo 0022): Salida analógica de 4 canales con ocho canales de entrada TTL para marcar códigos en el archivo de datos</td></tr><tr><td>Base magnética multiposición</td><td>Herramientas de carga portuaria</td><td>Pittsburg, artículo #5645</td><td>El soporte magnético alcanza hasta 12" y produce 45 libras de tracción magnética. Úselo para colocar la cámara. La máquina enrosca agujeros en el extremo de la varilla para montar las cámaras.</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Kopf</td><td>900</td><td>Manipulación de 5 ejes para el montaje del electrodo de succión: X, Y, Z recorrido lineal, 2 ejes de rotación</td></tr><tr><td>Osciloscopio de disección en la pluma</td><td>Lieca</td><td>GZ6</td><td>Rango de aumento, 6,7x &ndash; 40x</td></tr><tr><td>Estimulador nervioso/muscular</td><td>Astro-Med Grass Telefactor</td><td>Grass S88</td><td>Estimulador de voltaje de doble pulso: dos canales de salida que pueden funcionar de forma independiente o sincronizada para generar pulsos de voltaje constante no aislados (10 mv a 150 V). Los pulsos pueden ser simples (10 &mu; seg. a 10 s), repetitivos (de 0,01 Hz a 1 KHz) y trenes (de 1 ms a 10 s) y sincronizados con entradas y salidas TTL. Envíe salidas TTL a través de los canales de salida de un conector DB25 a los canales de entrada TTL del ViewPoint EyeTracker. Nota: Astro-Med Grass Telefactor ya no está en el negocio.</td></tr><tr><td>Dispositivo de aislamiento de corriente</td><td>Astro-Med Grass Telefactor</td><td>PSIU6</td><td>Unidad de aislamiento de estímulo de corriente: permite el suministro seguro de corrientes constantes por parte del S88 a la preparación. El PSIU6 se conecta mediante un cable BNC a uno de los canales de salida del S88. Los interruptores multiplicadores del PSIU6 permiten que el S88 genere una amplia gama de amplitudes de corriente que van desde 0,1 y micro; De A a 15 mA.</td></tr><tr><td>Estimulador alternativo de nervios/músculos con aislamiento</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>Estimulador de pulso aislado: La unidad tiene un aislador incorporado para producir corrientes constantes.</td></tr></tbody></table>

cinemática ocular midiendo in vitro la estimulación de los nervios craneales en la tortuga

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Después de que los animales son sacrificados, los tejidos comienzan a morir. Las tortugas ofrecen una ventaja debido a un tiempo de supervivencia de sus tejidos, especialmente en comparación con los vertebrados de sangre caliente. Debido a esto, se pueden realizar experimentos en vitro en tortugas para largos períodos de tiempo para investigar las señales neuronales y control de sus acciones de blanco. Con una preparación aislada de cabeza, medimos la cinemática de los movimientos oculares en tortugas, y su modulación por señales eléctricas por los nervios craneales. Después de que el cerebro fue quitado del cráneo, dejando intactos los nervios craneales la cabeza disecada fue colocada en un cardán para calibrar los movimientos de los ojos. Electrodos de vidrio fueron atados a los nervios craneales (oculomotor, trochlear y abducens) y estimulada con corrientes para evocar los movimientos de los ojos. Nos vigila movimientos de los ojos con un video infrarrojo de seguimiento sistema y cuantificada de rotación de los ojos. Corriente de pulsos con una gama de amplitudes, frecuencias, y las duraciones del tren fueron utilizadas para observar efectos sobre las respuestas. Porque la preparación se separa del cerebro, la vía eferente va a objetivos musculares puede examinarse aisladamente para investigar señales neuronales en ausencia de la información sensorial procesada centralmente.

La figura 1 muestra imágenes fijas de imágenes tomadas de un video que describe la disección. Imágenes ofrecen localizaciones típicas de los nervios antes de cortar el cerebro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56864/56864fig1.jpg"> Figura 1: imágenes de imágenes capturadas del vídeo de la disección para mostrar ubicaciones del nervio óptico (nII), nervio oculomot...

Este protocolo describe cómo utilizar una en vitro aislado tortuga cabeza preparación para medir la cinemática de los movimientos del ojo. Después del retiro del cerebro del cráneo, los nervios craneales pueden ser estimulados con corrientes cuantificar rotaciones y cambios en el tamaño de la pupila.

Cinemática ocular midiendo In Vitro la estimulación de los nervios craneales en la tortuga

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

El objetivo general de este protocolo electrofisiológico es proporcionar la capacidad de medir la cinemática de los movimientos oculares de la tortuga de orejas rojas utilizando una preparación de cabeza aislada in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo ocular-motor, como cómo evolucionó la visión en las tortugas. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere entrenar a los animales para rastrear objetivos y utiliza un cardán para calibrar sus movimientos oculares.Quien demuestra esta técnica es Steven Nesbit, un estudiante de pregrado en mi laboratorio. Comienza con la cabeza de tortuga en un plato de disección. Tenga a mano suficiente solución para el timbre de tortuga para irrigar el tejido.Mantenga el pañuelo a cuatro grados centígrados, colocando hielo alrededor del exterior del plato. Coloque una sonda de disección roma a través de la boca para facilitar el manejo de la cabeza. Luego, mientras trabaja bajo un microscopio de disección, corte la articulación que conecta el hueso dentario con el cráneo con el bisturí.A continuación, use rongeurs para separar la mandíbula inferior del cráneo. Luego, retire la piel y los músculos de sus i

ocular-kinematics-measured-vitro-stimulation-cranial-nerves

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

En este vídeo podemos realizar la grabación electrorretinograma, la grabación del nervio óptico, y la grabación intrarretinianas con el cangrejo de herradura de...

Utilizando el cangrejo de herradura, Limulus polyphemus, En la Investigación de la Visión

Control nervioso y los procesos cognitivos pueden ser estudiados a través de los movimientos oculares. El software VisualEyes permite a un operador para programar los estímulos en dos pantallas de ordenador de forma independiente utilizando un lenguaje de scripting personalizado simple. El sistema puede estimular los movimientos oculares sacádicos tándem (y seguimiento lento) o movimientos oculares opuestas (de convergencia) o cualquier combinación.

VisualEyes: Un sistema de software modular para experimentación oculomotor

Vídeo-oculografía es un método muy cuantitativa para investigar el rendimiento motor ocular, así como el aprendizaje motor. A continuación, describimos la forma de medir vídeo-oculografía en ratones. La aplicación de esta técnica en normal, tratamiento farmacológico o ratones modificados genéticamente es una poderosa herramienta de investigación para explorar la fisiología subyacente de comportamientos motores.

Vídeo-oculografía en ratones

La eliminación de los ojos, también llamado enucleación, ofrece una estrategia útil para estudiar los aspectos de la visual, cross-modal, y la plasticidad del desarrollo a lo largo del sistema visual de mamíferos ya que induce irreversible parcial (monocular) o completa (binocular) pérdida de la visión. Aquí se describe un enfoque altamente reproducible y fácil de realizar en la enucleación vivo.

Un método altamente reproducible y fácil de Perform En Vivo Ocular enucleación en el ratón después de la abertura del ojo

Se presenta un protocolo detallado para la evaluación de lecturas visuales y estructurales en roedores por coherencia óptica tomografía y optoquinéticas respuesta. Los resultados proporcionan información valiosa para la investigación oftalmológica y neurológica.

Utilizando tomografía de coherencia óptica y respuesta Optokinetic como lecturas de sistema Visual estructural y funcional en ratones y ratas

Un ensayo de rebanada ex vivo permite que el crecimiento del nervio oculomotor se intermiera en tiempo real. Los cortes se generan mediante la incrustación de embriones E10.5 IslMN:GFP en agarosa, cortando en un vibratome, y creciendo en una incubadora de etapa superior. El papel de las vías de orientación de axón se evalúa mediante la adición de inhibidores a los medios de cultivo.

Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor

VisualEyes2020 (VE2020) es un lenguaje de scripting personalizado que presenta, registra y sincroniza estímulos visuales de movimiento ocular. VE2020 proporciona estímulos para movimientos oculares conjugados (sacadas y persecución suave), movimientos oculares desconjugados (vergencia), acomodación y combinaciones de cada uno. Dos programas de análisis unifican el procesamiento de datos de los sistemas de seguimiento ocular y registro de alojamiento.

Cuantificación de respuestas oculomotoras y acomodación a través de instrumentación y cajas de herramientas de análisis

A continuación, describimos un protocolo estándar para cuantificar el reflejo optocinético. Combina la estimulación virtual de tambores y la video-oculografía, y por lo tanto permite una evaluación precisa de la selectividad de las características del comportamiento y su plasticidad adaptativa.

Cuantificación de la selectividad de las características visuales del reflejo optocinético en ratones

Describimos aquí PyOKR, un método de análisis cuantitativo semiautomatizado que mide directamente los movimientos oculares resultantes de las respuestas visuales al movimiento bidimensional de la imagen. Una interfaz de usuario y un algoritmo de análisis basados en Python permiten un mayor rendimiento y mediciones cuantitativas más precisas de los parámetros de seguimiento ocular que los métodos anteriores.

PyOKR: Un método semiautomatizado para cuantificar la capacidad de seguimiento de los reflejos optocinéticos

La metodología exploró las contribuciones visuales y vestibulares a la estabilización de la mirada durante las rotaciones optocinéticas y de todo el cuerpo. Las estimulaciones se llevaron a cabo a través de ensayos visuales, vestibulares y visuovestibulares. La ganancia de movimiento ocular torsional y las frecuencias de nistagmo sirvieron como indicadores para la transmisión subcortical de información de movimiento sensorial específica hacia la respuesta reflexiva del tronco encefálico para...

Uso del seguimiento ocular para evaluar la importancia relativa de la entrada visual y vestibular para el procesamiento del movimiento subcortical en el plano de balanceo

Aprende a medir la cinemática ocular en tortugas mediante estimulación de nervios craneales in vitro. Este protocolo electrofisiológico permite cuantificar rotaciones oculares y cambios pupilares sin entrenamiento previo.

Cinemática ocular midiendo In Vitro la estimulación de los nervios craneales en la tortuga

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