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El marcaje metabólico se utiliza para investigar la maquinaria de una célula. Esto se logra utilizando análogos químicos para sondear las transformaciones y modificaciones bioquímicas que ocurren. Este video mostrará los principios del etiquetado metabólico, los procedimientos típicos de etiquetado isotópico y fotorreactivo, y algunas aplicaciones.
El marcaje metabólico se puede llevar a cabo utilizando una serie de estrategias. Aquí describiremos el marcaje isotópico, fotorreactivo y bioortogonal.
El marcaje isotópico se realiza utilizando análogos estructurales que son químicamente idénticos a sus homólogos naturales, pero tienen isótopos poco comunes incorporados en su estructura. En este análogo de L-lisina, los átomos de carbono y nitrógeno se reemplazan por carbono-13 y nitrógeno-15. Las células cultivadas en presencia de análogos isotópicos los incorporarán a sus estructuras bioquímicas. Los metabolitos se recogen de las células y se purifican para su análisis. Las muestras con isótopos estables se analizan mediante técnicas como la espectrometría de masas o la espectroscopia de RMN. Las muestras con marcadores radiactivos se analizan mediante conteo de centelleo líquido y películas de rayos X, lo que se demostrará en el protocolo de marcaje isotópico.
Los marcadores fotorreactivos son grupos funcionales incorporados a las proteínas, que son estables hasta que se exponen a la luz ultravioleta. El grupo funcional forma un radical reactivo, que se une a la proteína más cercana. Un ejemplo común, la L-fotoleucina, contiene un anillo de diazirina, que es un reticulante fotorreactivo. En contraste con el marcaje isotópico, existe cierta disimilitud química entre los análogos químicos fotorreactivos y sus contrapartes naturales. Las células pueden incorporar preferentemente compuestos naturales sobre análogos. Por lo tanto, es importante realizar el marcaje fotorreactivo en un medio libre del compuesto que se está imitando. Una vez expuestos a la radiación ultravioleta, los grupos fotorreactivos de una proteína marcada se vuelven inestables y altamente reactivos, lo que hace que se entrecruce con las proteínas que interactúan, creando un complejo proteico. Los complejos reticulados actúan como instantáneas que luego se pueden analizar utilizando SDS-PAGE y métodos de espectrometría de masas. Esto proporciona información sobre qué reacciones están ocurriendo en la vía metabólica mediante la identificación de especies de reacción y cómo interactúan mediante la determinación de sitios de unión.
Las estrategias de marcaje bioortogonal utilizan análogos con pequeños grupos funcionales que tienen poca o ninguna reactividad con las biomoléculas naturales. Por ejemplo, las azidas son pequeños grupos funcionales, cuya reactividad se dice que es ortogonal a las reacciones bioquímicas. En la ligadura de Staudinger, un grupo fosfina ataca al grupo zido. Esto produce un estado de transición que reacciona intramolecularmente con un éster cercano, lo que da como resultado un ligando unido a aminas. Los grupos funcionales bioortogonales incorporados en biomoléculas se pueden ligar con etiquetas de detección, como grupos funcionales fluorescentes, y etiquetas de afinidad, como antígenos.
Ahora que se han discutido algunos conceptos y estrategias para el marcaje metabólico, veamos el proceso en el laboratorio.
El primer paso en un experimento de marcaje metabólico es recolectar la proteína de interés. Para ello, las células se cultivan en una placa y se utiliza un método de expresión para promover la síntesis de la proteína deseada. En este ejemplo, se expresan quinasas repetidas ricas en leucina, o LRRK. El fosfato disódico, que contiene fósforo radiactivo-32, se utiliza como análogo. Se deben tomar las medidas adecuadas para proteger contra las radiaciones ionizantes. Esto incluye establecer un área de trabajo, usar el equipo de protección adecuado y verificar si hay contaminación radiactiva. Una vez que se han tomado las medidas de seguridad, se prepara el medio que contiene los análogos isotópicos. El medio del cultivo se retira y se reemplaza por uno que contenga los análogos químicos isotópicos y luego se incuba. Después de la incubación, las células se lisan. El lisado se recoge y se purifica.
Después de la purificación, las proteínas se resuelven mediante SDS-PAGE y luego se transfieren a una membrana de PVDF. La autorradiografía se realiza exponiendo la membrana a una película de rayos X y se mide con un generador de imágenes de fósforo. La Western blot se utiliza para medir los niveles relativos de proteínas en la membrana de PVDF. En este ejemplo, se midieron los niveles de fosforilación de quinasas repetidas ricas en leucina sintetizadas en células 293T. El autorradiograma muestra la cantidad de fósforo que se incorporó a la proteína. La Western blot dilucida los niveles de las proteínas LRRK. El software de análisis de imágenes se utiliza para obtener datos cuantitativos de los niveles de fosforilación de las proteínas.
En el siguiente procedimiento, se demuestra el marcaje fotorreactivo. En primer lugar, se preparan y cultivan las células. El análogo fotorreactivo se añade a las células en la fase media de registro y se incuba. En este procedimiento se utiliza p-benzoilfenilalanina. Las muestras se recogen a intervalos y se colocan en hielo. A continuación, las muestras se exponen para obtener instantáneas de las vías bioquímicas a lo largo del tiempo. A continuación, las proteínas de interés se purifican y resuelven mediante SDS-PAGE.
Se utilizó una estrategia de marcaje fotorreactivo para identificar los compuestos que interactúan con la proteína de interés. La inmunodetección con Western blot muestra bandas de proteínas que indican la presencia de proteínas de mayor peso molecular en las muestras irradiadas. Estos son de la reticulación debida a la interacción proteína-proteína que ocurre durante la irradiación UV.
Ahora que hemos revisado los procedimientos de etiquetado metabólico, veamos algunas de las formas en que se utiliza el proceso.
Los conceptos de marcaje metabólico pueden extenderse a los organismos pluricelulares. Las plantas se cultivan en un ambiente sellado, rico en isótopos estables para producir material vegetal etiquetado. Se añade dióxido de carbono que contiene carbono-13 al recinto, mientras que se utiliza un fertilizante rico en nitrógeno-15. El material vegetal cosechado resultante puede ayudar a responder preguntas sobre el ciclo del carbono y el nitrógeno del ecosistema.
El etiquetado permite la separación del ARN recién sintetizado del ARN más antiguo. Al cambiar la concentración inicial de análogo, se puede determinar la cinética de la síntesis de nuevo ARN. Los resultados muestran que la concentración de 4-tiouridina afecta a la cantidad de ARN nuevo que se transcribe. Además, las tasas de incorporación de la marca en el ARN se pueden cuantificar directamente con un espectrofotómetro.
Usando la química de clic biortogonal, los glicanos en un embrión de pez cebra se pueden etiquetar. A los huevos se les inyecta un compuesto de marcaje que da como resultado etiquetas de alquino en los glicanos. A continuación, los glicanos de las larvas se ligan a un compuesto colorante en la etapa de desarrollo deseada. A continuación, se obtienen imágenes de los glicanos de los embriones. Los glicanos producidos en diferentes puntos de tiempo se pueden identificar mediante el etiquetado con diferentes colores en diferentes etapas del desarrollo embrionario.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre el etiquetado metabólico. Este video describió los conceptos detrás del etiquetado metabólico y sus estrategias, repasó dos procedimientos generales y cubrió algunos de los usos de las técnicas.
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