$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
La determinación de la concentración de una proteína en las muestras es un paso fundamental en muchos ensayos bioquímicos. La determinación fotométrica se puede realizar con tamaños de muestra pequeños. Cuanto más contenga una muestra sustancias que absorban la luz, menos se transmitirá la luz a través de ella. Esto proporciona una medición cuantitativa de las sustancias absorbentes. Estos conceptos son tan fundamentales para la ciencia que los artículos que introdujeron dos de las técnicas se encuentran en los tres trabajos más citados de todos los tiempos. Este video mostrará los conceptos detrás de algunas de las técnicas de determinación fotométrica de proteínas más comunes, cómo se realizan y cómo se analizan los datos recopilados.
La determinación fotométrica de proteínas se basa en la relación entre la concentración y la absorbencia de luz. Esto se conoce como la Ley de Beer-Lambert, que establece que la concentración de una especie que absorbe la luz es proporcional a su absorbancia.
Este principio subyace en todos los métodos de determinación fotométrica de proteínas.
Para el análisis de absorción directa, se miden los valores de absorbancia de muestras de proteínas inalteradas. Debido a sus cadenas laterales aromáticas, los residuos de triptófano y tirosina proporcionan las lecturas de absorbancia más altas a una longitud de onda de 280 nm.
Sin embargo, estos aminoácidos, que son dos de los que se encuentran con menos frecuencia en las proteínas, están presentes en diferentes cantidades en cada proteína, por lo que cada determinación es única. Para superar esta limitación, se desarrollaron ensayos más complejos que no dependen de estos aminoácidos.
Un ejemplo es el ensayo de Bradford, en el que se añade un tinte coloreado a la muestra. El tinte, conocido como azul de Coomassie, responde proporcionalmente: cuanta más proteína esté presente, más eventos de unión con el tinte.
Luego, la concentración de proteínas se determina midiendo la absorbancia del colorante azul de Coomassie unido, que absorbe la luz a 594 nm. Sin embargo, el ensayo de Bradford es lineal en un rango corto de concentraciones, por lo que a menudo se requieren diluciones antes del análisis.
El Método Lowry combina el reactivo Biuret, una solución alcalina de iones de cobre que reaccionan con enlaces peptídicos, y el reactivo Folin-Cioc?lteu, que oxida los residuos de proteínas aromáticas. El cambio de color resultante de la muestra es proporcional a la concentración de proteína.
La absorbancia del reactivo Folin reducido se puede determinar a 750 nm. Al igual que la absorción directa, cada proteína tiene una respuesta única y debe calibrarse para la proteína de interés. Ahora que hemos revisado los principios básicos detrás de algunos de los ensayos más comunes, veamos cómo se realizan la absorción directa y el ensayo de Bradford.
Para comenzar un análisis de absorción directa, el espectrofotómetro se calibra con un blanco para determinar la absorbancia cero. Las soluciones estándar están preparadas para su uso en la creación de la curva de calibración. Luego, se agrega una alícuota del primer patrón a una cubeta y se coloca en el espectrofotómetro.
A continuación, se registra el valor de absorbancia a 280 nm. Este proceso se repite para cada estándar, utilizando una cubeta limpia para cada ejecución. Una vez completado, se crea una curva de calibración trazando la absorbancia frente a la concentración. La pendiente de esta línea es el coeficiente de atenuación molar, que relaciona la absorbancia con la concentración.
A continuación, la muestra desconocida se añade a una cubeta y se registra el valor de absorbancia. Dado que el análisis de datos para los diferentes métodos de determinación fotométrica es similar, lo cubriremos después de analizar el ensayo de Bradford.
Aquí, el ensayo de proteína de Bradford se realiza con un estándar BSA en una placa de 96 pocillos. Para empezar, se preparan las soluciones de stock de BSA.
Las soluciones desconocidas se diluyen con agua desionizada para garantizar que las concentraciones estén dentro del rango del ensayo. Dependiendo del kit, el tinte Coomassie también puede requerir dilución. Luego, la curva de calibración se configura agregando los estándares BSA a la placa de 96 pocillos.
Se agrega agua desionizada para alcanzar la concentración necesaria para generar una curva estándar. La muestra desconocida debe agregarse a la placa por triplicado para garantizar que se tome una medición precisa. A continuación, se añade el colorante Coomassie a cada pocillo, mezclándolo con la pipeta.
El agua desionizada se agrega a un pozo vacío como un blanco, para medir la absorbancia. Después de esperar 5 minutos para que el tinte se una, la absorbancia se mide en un lector de placas a 590 nm.
Ahora que hemos realizado algunos ensayos, veamos cómo analizar los datos. Cada método de determinación fotométrica de proteínas se basa en la Ley de Beer-Lambert.
La absorbancia medida de los patrones se utiliza para crear una curva de calibración, que luego se utiliza para determinar la concentración de muestras desconocidas. Esta curva se puede trazar manualmente, aunque las herramientas espectrofotométricas más nuevas crearán la curva de calibración una vez que se hayan medido todos los estándares. Estos sistemas también calcularán la concentración de proteínas a medida que se analizan muestras desconocidas.
Ahora que hemos revisado cómo analizar los datos de determinación fotométrica de proteínas, veamos algunas de las formas en que se utilizan estos procedimientos.
Los principios de la determinación fotométrica de proteínas también se pueden utilizar para medir directamente la concentración de ácidos nucleicos. El espectrofotómetro de nanogotas acepta muestras de muy pequeño volumen en un pedestal ópticamente activo. A continuación, se mide la absorbancia y el sistema determina automáticamente la concentración de ácido nucleico. Debido a que las proteínas y otras fuentes pueden interferir con las mediciones, la pureza de la muestra se determina analizando las relaciones de absorbancia de 260 a 280 nm y de 260 a 230 nm. Los ácidos nucleicos puros suelen producir proporciones de aproximadamente 1,8 y aproximadamente 2,0 para el ADN y el ARN, respectivamente.
La determinación fotométrica de proteínas también se puede utilizar en la producción de materiales biomiméticos, que se inspiran en la naturaleza para provocar respuestas celulares específicas. Las adhesinas recombinantes se unen a las perlas de poliestireno para simular la unión bacteriana a las células huésped. El ensayo de Bradford se utiliza para determinar la eficiencia de acoplamiento de la adhesión recombinante a las perlas en la producción del material biomimético.
Los ensayos fotométricos alternativos de proteínas se pueden utilizar en la detección y caracterización de proteínas antimicrobianas. El colorante R azul brillante Remazol se une covalentemente a las bacterias muertas por calor. La proteína antimicrobiana se incuba en la solución teñida. A continuación, se centrifuga la muestra y se mide la absorbancia del sobrenadante a 595 nm mediante un espectrofotómetro de microplacas. El aumento de la absorbancia, por el colorante soluble liberado en el sobrenadante por las bacterias marcadas, es una medida cuantitativa de la actividad enzimática.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la determinación fotométrica de proteínas. Este video describió los principios subyacentes de la determinación fotométrica, repasó los procedimientos generales para algunos ensayos comunes y cubrió algunos avances nuevos en las técnicas. ¡Gracias por mirar!
