Alto rendimiento, la absoluta determinación del contenido de una proteína seleccionada a nivel de tejido con punto cuantitativo Blot análisis (QDB)

Este método puede denominarse ELISA a nivel tisular para distanciarse de la cuantificación semicuantitativa relativa tradicional del contenido de proteínas a nivel celular y tisular, que es la norma en el laboratorio de investigación y en el campo del diagnóstico clínico en la actualidad. Las principales ventajas de esta técnica se pueden describir en tres palabras: alto rendimiento, cuantitativa y absoluta. Si tuviéramos que añadir otra palabra, sería sencillo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden al campo de la proteómica, mientras que la verificación de los biomarcadores se puede lograr en formato de alto rendimiento. Este método tiene amplias aplicaciones en todo el campo clínico y de investigación. La cuantificación de la cantidad de proteína a nivel celular y tisular es todavía primitiva en la actualidad.

En términos generales, las personas nuevas en este método no enfrentarán ningún problema para aprender esta técnica y es bastante básica y requiere habilidades mínimas de laboratorio para realizarla. Estamos entusiasmados de demostrar su confiabilidad, simplicidad y precisión de la técnica utilizando el modelo animal. Las muestras se pueden preparar con cualquier método tradicional de preparación de muestras utilizando cualquier tampón de lisis comúnmente utilizado en el laboratorio de investigación con o sin detergente como MP40 o Triton X.In nuestro caso, utilizamos tampón de lisis Triton X.

Coloque una rebanada de tejido de cinco a 100 miligramos en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, añadir 200 microlitros de tampón de lisis suplementado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa. A continuación, homogeneizar el tejido con un homogeneizador durante un minuto sobre hielo.

A continuación, centrifugar la muestra durante 10 minutos a 8.000 veces g a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante en tubos nuevos y extraiga un microlitro para medir la cantidad total de proteína en el lisado de proteínas utilizando un kit de determinación de proteínas, como un ensayo de BCA. Incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados, luego mida la absorbancia a 562 nanómetros en un lector de microplacas.

En este paso, utilizando una proteína recombinante con una concentración conocida como estándar, diluya la proteína a una concentración de 12.000 picogramos por microlitro como solución madre. Mientras tanto, diluya los lisados de la muestra preparada a cuatro microgramos por microlitro. Para obtener resultados más fiables, recomendamos utilizar una mezcla de lisados de muestras para evitar cualquier diferencia entre las muestras individuales.

Diluir en serie tanto la proteína estándar como las muestras preparadas para un estudio de dosis típico. Se suplementó el BSA para garantizar cantidades aproximadamente iguales de la proteína cargada para cada muestra. Después de eso, mezcle 10 microlitros de la proteína estándar diluida en serie o lisados de muestra con 10 microlitros de tampón de carga 2X.

Luego calienta la mezcla a 85 grados centígrados durante cinco minutos. En este procedimiento, coloque una caja de punta de pipeta vacía debajo de la placa QDB para evitar que la parte inferior de la placa toque la superficie de la mesa. Cargue hasta dos microlitros de la muestra en el centro de la membrana en la parte inferior de una unidad individual de la placa QDB.

Nunca permita que la parte inferior de la placa QDB toque ninguna superficie mientras se carga y no cargue demasiado para el pozo individual. En nuestra experiencia, no más de cuatro microlitros por pocillo. A continuación, deje la placa QDB cargada durante una hora a temperatura ambiente o deje la cargada a 37 grados centígrados durante 15 minutos en un espacio bien ventilado.

Para bloquear la placa, sumerja la placa QDB en el tampón de transferencia y agítela suavemente durante 10 segundos. Después de eso, enjuague la placa QDB suavemente con TBST tres veces y luego lave la placa durante cinco minutos en TBST bajo agitación constante. Posteriormente, bloquee la placa QDB con tampón de bloqueo durante una hora bajo agitación constante.

Ahora, diluya el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo a una concentración elegida y agregue 100 microlitros a cada pocillo individual de una placa ordinaria de 96 pocillos. Inserte la placa QDB en la placa de 96 pocillos e incube las placas combinadas durante dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados bajo agitación constante. Después de eso, enjuague la placa suavemente con TBST tres veces antes de lavarla con TBST tres veces cada vez durante cinco minutos bajo agitación constante.

A continuación, diluya el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo a la concentración elegida y alícuota 100 microlitros en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. A continuación, incube la placa QDB dentro de la placa de 96 pocillos cargada durante una hora a temperatura ambiente bajo agitación constante. Enjuague suavemente la placa QDB tres veces con TBST y luego lave la placa tres veces, cinco minutos cada una con TBST bajo agitación constante.

Para la cuantificación, prepare el sustrato ECL y alícuota en una placa de 96 pocillos a 100 microlitros por pocillo. A continuación, inserte la placa QDB dentro de la placa de 96 pocillos durante dos minutos bajo agitación constante. Después de eso, retire la placa QDB de la placa de 96 pocillos y agite brevemente para eliminar el exceso de líquido.

Posteriormente, coloque la placa sobre una placa de microtitulación blanca. A continuación, encienda el lector de microplacas y seleccione la placa con cubierta en la interfaz de usuario antes de colocar las placas combinadas dentro del lector de microplacas para la cuantificación. Asegúrate de elegir el plato con tapa para evitar errores.

Esta figura muestra la especificidad del anticuerpo anti-CAPG de conejo utilizando lisados de tejido de ratón preparados a partir de bazo, corazón, músculo, riñón, hígado y próstata con análisis de Western blot. Se definió el rango lineal de análisis de QDB de anticuerpos anti-CAPG de conejo utilizando lisados preparados a partir de próstata, riñón, bazo y utilizando el estándar de proteína CAPG recombinante purificada. Los resultados fueron un promedio de triplicados.

Y aquí se muestra la determinación absoluta de los niveles de CAPG en lisados preparados a partir de riñones, bazos y próstatas de ratón. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro a 24 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar un anticuerpo específico predeterminado para todo el procedimiento.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis bioestadístico, para responder a preguntas adicionales que solo se pueden lograr mediante la medición absoluta del contenido de proteínas individuales a nivel celular o tisular. Desde su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la investigación proteómica exploren la supuesta relación de los biomarcadores de proteínas con diversas enfermedades a nivel poblacional. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis QDB en formato de alto rendimiento.

No olvide que trabajar con tejidos humanos o animales puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes al realizar este procedimiento.