Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

El objetivo general de este procedimiento es inducir la conversión de células germinales en neuronas en C. elegans. Este método puede ayudar a investigar la implicación de procesos biológicos, como las vías de señalización o la epigenética en la regulación de la reprogramación del destino celular. La principal ventaja del método descrito en este video es que en animales vivos, las células germinales pueden ser desafiadas por la sobreexpresión de un factor de transcripción que induce el destino.

Mientras tanto, en paralelo, se puede realizar un cribado genético como un cribado de ARNi para identificar nuevos factores que están implicados en la regulación de la reprogramación celular. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia regenerativa. Porque este método in vivo podría utilizarse para estudiar la reprogramación celular en diferentes condiciones de desarrollo y ambientales.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de reprogramación son difíciles de aprender. Porque el fenotipo de conversión de células germinales a neuronas, tras el agotamiento de lin-53, solo ocurre en condiciones cuidadosamente controladas. Para las placas de ARNi, cargue placas de seis centímetros con agar NGM que contenga IPTG y carbenicilina.

Déjalos secar de 24 a 48 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego transfiéralos a cuatro grados centígrados durante un máximo de 14 días. A continuación, placas selectivas de rayas que contienen carbenicilina y tetraciclina con clones de bacterias RNAi con plásmido L4440 portadores del gen lin-53.

Use un patrón de rayas trifásico y asegúrese de colocar un control vectorial vacío. Luego, cultive las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, elija al menos tres colonias individuales e inocule cada una de ellas en un tubo de cultivo separado con dos mililitros de LB, suplementado con carbenicilina, pero no con tetraciclina.

Planee tener tres cultivos saludables por afección. A continuación, cultive los cultivos durante la noche a 37 grados centígrados hasta que alcancen una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,6 a 0,8. A continuación, se añaden 500 microlitros de cada cultivo bacteriano a una placa de ARNi de agar NGM de seis centímetros.

Incube las placas durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Este protocolo está optimizado para gusanos de la cepa BAT28 mantenidos a 15 grados centígrados, donde los transgenes son más estables. Los detalles sobre la genética de la cepa se proporcionan en el texto.

La sincronización de la edad de los gusanos es fundamental. Utiliza la técnica de blanqueo. Lave platos de agar NGM de seis centímetros que contengan adultos y huevos con 800 microlitros de M9. A continuación, granule los gusanos por centrifugación y retire el sobrenadante.

A continuación, agregue de 1/2 a un mililitro de solución blanqueadora a los gusanos. Y mientras observa a los gusanos bajo un estereoscopio, agite el tubo hasta que los gusanos adultos comiencen a abrirse y luego recoja los huevos. Ahora, separa los residuos de los huevos.

Primero centrifuga el tubo y desecha el sobrenadante. A continuación, lavar el pellet de pañuelos con 800 microlitros de M9 tres veces. Asegúrese de usar la centrifugación para agrupar los tejidos entre los lavados.

Ahora, transfiera los huevos limpios a placas NGM frescas sembradas con la bacteria OP50. Comprobar brevemente el éxito del aislamiento de los embriones y su transferencia a las placas NGM. Cultive los animales a 15 grados centígrados.

Para lograr la conversión de células germinales en neuronas tras el agotamiento de lin-53, el agotamiento debe comenzar en la generación parental. Para agotar lin-53, someta a los animales L4 a ARNi. Transfiera manualmente 50 gusanos L4 por réplica a una placa NGM RNAi sin bacterias.

Usa un alambre de platino. Los gusanos L4 se pueden reconocer por una mancha blanca aproximadamente a la mitad de sus lados ventrales. Ahora, incuba los gusanos a 15 grados centígrados en la oscuridad durante unos siete días.

El IPTG es sensible a la luz. Cuando la progenie F1 alcance las etapas L3 y L4, sepárelos de los animales parentales más grandes y gruesos. En este punto, se examina la F1 para detectar el fenotipo de vulva protuberante, lo que indica que el ARNi contra lin-53 ha tenido éxito.

La actividad del ARNi también puede provocar letalidad, que aumenta por encima de los 15 grados centígrados. Para activar che-1 e inducir la conversión de células germinales en neuronas en la progenie F1, se someten a los gusanos a un choque térmico durante 30 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad. Utilice una incubadora ventilada, ya que permite un choque térmico más eficiente.

Después del choque térmico, incube las placas a 25 grados centígrados durante la noche en la oscuridad. Es importante evitar inducir una sobreexpresión de che-1 por choque térmico antes de que los animales alcancen la mitad de la etapa L3. Esto puede conducir a la expresión de la proteína che-1 en tejidos no dirigidos.

Al día siguiente, instaló una fuente de luz de fluorescencia y un filtro GFP para examinar a los animales en busca de fluorescencia derivada de transgenes en el área media del cuerpo. Para evaluar la penetrancia del fenotipo, encuentre la proporción de animales que emiten una señal fluorescente. Por lo general, alrededor del 30% mostrará una señal GFP discreta.

En comparación, en los animales portadores del ARNi vectorial vacío, incluso una señal difusa en la línea germinal no se observa en más del 5% de la población. Los animales F1 que exhiben el fenotipo de vulva protuberante ilustran la aplicación exitosa del ARNi lin-53. En estos animales, es común la conversión de células germinales en células similares a las neuronas ASE tras la inducción por choque térmico de che-1.

Un examen minucioso revela proyecciones similares a las neuronas que son típicas de las neuronas de las células germinales. Por el contrario, los controles vectoriales vacíos mostraron una expresión mínima de GFP, que era, a lo sumo, difusa. Las células germinales de estos animales carecían de características similares a las neuronas.

Cuando los animales eran demasiado jóvenes en el momento de la inducción de la sobreexpresión de che-1, a menudo mostraban expresión ectópica de transgenes en otras regiones del cuerpo, como la vulva en desarrollo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo planificar y realizar cuidadosamente los experimentos con gusanos vivos para reprogramar las células germinales en neuronas. El método descrito aquí en este video le permitirá ahora investigar la implicación de una serie de factores diferentes en la regulación de la reprogramación celular.

Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en 10 días. Al intentar el experimento, es importante organizar cuidadosamente a los animales antes de la inducción de la reprogramación, y mantener la cepa BAT28 a 15 grados. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el doble ARNi para abordar preguntas adicionales como: ¿Cuáles son los mecanismos subyacentes que juegan un papel durante las conversiones del destino celular?