Name: Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende a reprogramar células germinales en neuronas usando RNAi y expresión inducida por choque térmico del factor CHE-1 en C. elegans. Este método permite estudiar procesos de reprogramación celular in vivo.

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Agradecemos a Alina El-Khalili y Martina Hajduskova para asistencia técnica. Agradecemos a los miembros del grupo Tursun para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue patrocinado por el ERC-StG-2014-637530 y PCIG12-GA-2012-333922 CIG de ERC y es apoyado por el centro de Max Delbrueck de Medicina Molecular en la Asociación Helmholtz.

Todos los métodos aquí descritos con respecto al cuidado de los animales han sido aprobados por la LaGeSo Berlín, Alemania
1. preparación de la solución
<ol>
	<li>Placas de NGM-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>Añadir 3 g de NaCl, 2.5 g de medio de peptona (p. ej., Bacto-peptona) y 20 g de agar. Después de la esterilización en autoclave, añadir 1 mL de colesterol (5 mg/mL en la acción de EtOH 95%), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M de CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4y 1 mL de anfotericina B (acción de 2,5 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Placas de Agar NGM RNAi (1 L)
	<ol>
		<li>Añadir 3 g de NaCl, 2.5 g de medio de peptona y 20 g de agar. Después de autoclavar agregar, 1 mL de colesterol (5 mg/mL en la acción de EtOH 95%), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M de CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4, 1 mL de anfotericina B (acción de 2,5 mg/mL), 1 mL de 1 M IPTG y carbenicilina 1 mL (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>Añadir 10 g de medio de peptona, extracto de 5 g de levadura, 5 g de NaCl, 20 g de agar, 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Añadir H2O a 1 L. Después de la esterilización en autoclave, añadir 1 mL de carbenicilina 50 mg/mL y 2.5 mL de la tetraciclina de 5 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Medio LB (1 L)
	<ol>
		<li>Añadir 10 g de medio de peptona, extracto de 5 g de levadura, 5 g de NaCl y 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Añadir H2O a 1 L. Después de la esterilización en autoclave, añadir 1 mL de carbenicilina 50 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-buffer (1 L)
	<ol>
		<li>Añadir 6,0 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 5 g de NaCl y 50 mg de gelatina. Antes de su uso, agregar 1 mL de 1 M de MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Solución decolorante (10 mL)
	<ol>
		<li>Añadir 1 mL de NaClO y 2 mL de 5 N NaOH. Añadir H2O a 10 mL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. preparación de placas de ARNi
Nota: C. elegans se cultiva normalmente en el laboratorio en placas de Petri de 6 cm que contiene 7,5 mL de nematodo crecimiento medio Agar (Agar NGM)10,11. Este protocolo está optimizado para gusanos a 15 ° C. Para preparar las placas con NGM, use técnicas estériles estándar para prevenir la contaminación de hongo y bacterias. El siguiente es el protocolo para preparar placas NGM complementadas con reactivos para RNAi.
<ol>
	<li>Preparar platos para RNAi NGM-Agar 6 cm que contiene 1 mM isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y 50 carbenicilina μg/mL. Deje secar por 24-48 h a temperatura ambiente en el oscuro12.
	<ol>
		<li>Mantener las placas ARNi a 4 ° C en la oscuridad. No use si es mayor de 14 días.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Seleccionar el clon de bacterias (Escherichia coli HT115) de RNAi que contiene el plásmido de L4440 con la secuencia de ADN del gen lin-53 del stock de glicerol congelado de la RNAi disponible biblioteca13 en placas de LB-agar que contienen 50 μg/mL carbenicilina y 12.5 de μg/mL tetraciclina, usando el patrón de manchas de tres fases. Crecer las bacterias a 37 ° C durante la noche12. Esta copia permite la producción de IPTG dependiente de dsRNA de lin-53 en las bacterias.
	<ol>
		<li>Además, crecen bacterias de RNAi que contienen el plásmido L4440 sin cualquier secuencia genética como el vector vacío control14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Al día siguiente, escoge una sola Colonia de lin-53 o placas vacías vector LB-agar utilizando una pipeta de 200 μL Punta e inoculan cada una de ellas en un tubo de cultivo separado que contiene 2 mL de líquido LB medio14 suplementado con 50 carbenicilina μg/mL. Crecen las culturas durante la noche a 37 ° C hasta alcanzar una densidad óptica (OD) a 600 nm de 0,6 – 0,8. Medir la do mediante un espectrofotómetro15. PRECAUCIÓN: El medio LB líquido no contengan tetraciclina en contraste con la placa de LB-agar utilizada para rayar las bacterias del stock de glicerol, desde la inclusión de la tetraciclina durante la alimentación conduce a una disminución de eficacia ARNi 12</li>
	<li>Añadir 500 μl de cada cultivo bacteriano (lin-53 o vector vacío) a placas de Agar NGM ARNi 6 cm usando una pipeta múltiple. Incube las placas con una tapa cerrada durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad para secar. Durante este tiempo, el IPTG en las planchas NGM inducirá la producción de dsRNA en las bacterias.
	<ol>
		<li>Utilice al menos 3 placas por cultivo bacteriano por experimento. Esto proporcionará técnicas 3 repeticiones para cada experimento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tienda de secado ARNi NGM-agar placas con bacterias a 4 ° C en la oscuridad hasta por dos semanas.</li>
</ol>
3. preparación de BAT28 de cepa de C. elegans
<ol>
	<li>Mantener la cepa de gusano BAT288 que contiene el otIs305 de los transgenes [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] y ntIs1 [gcy-5prom::gfp] en bacterias OP50 usando placas de NGM-Agar estándar a 15 ° C. Nota: Para el protocolo detallado en la cultura de nematodos, véase10. El rol-6(su1006) es un alelo dominante y usados inyección fenotípica marcador16 que causa el movimiento de balanceo típico. Se utiliza en el transgen otIs305 a seguir hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Mantenga la tensión de BAT28 a 15 ° C en todo momento para evitar la activación de precaución de la hsp-16.2prom::che-1 transgen. Reducir la exposición a temperaturas superiores a 15 ° C durante la manipulación de la tensión tanto como sea posible.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para la edad-sincronización gusanos, utilizar el blanqueo de la técnica17.
	<ol>
		<li>Lavar las placas 6 cm NGM-Agar con adultos y huevos de BAT28 con 900 μl de tampón de M9. Gusanos de sedimento por centrifugación a 900 x g durante 1 minuto retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Agregar 0.5-1 mL de solución del blanqueo y agitar el tubo durante aproximadamente 1 minuto hasta gusanos adultos comiencen a reventar abierto. Monitor mediante un estereomicroscopio estándar.</li>
		<li>Gusanos de sedimento por centrifugación a 900 x g durante 1 minuto retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar el precipitado de gusano 3 veces por añadir 800 μl de buffer M9 y centrifugación a 900 x g.</li>
		<li>Coloque los huevos limpios en frescas NGM-placas sembradas con las bacterias OP50. Crecer una población blanqueada en bacterias OP50 a 15 ° C hasta que alcancen la etapa de L4 (aproximadamente 4 días). Las larvas L4 pueden ser reconocidas por una mancha blanca a aproximadamente la mitad a lo largo del lado ventral del gusano18 mediante un estereomicroscopio estándar. Nota: Para obtener la célula de germen al fenotipo de conversión de la neurona al agotamiento de los lin-53, tiene que agotarse en la generación parental (P0).</li></ol></li></ol>El marcador para el fenotipo de la conversión se realiza en la siguiente generación (generación filial F1). Para lograr agotan lin-53 ya en el P0, L4 los animales son sometidos a ARNi.
	
	
	<li>Transferir manualmente 50 L4 etapa gusanos por repetición usando un alambre de platino para una placa NGM que no contienen las bacterias y dejar la gusanos alejarse de cualquier bacteria OP50 transferido. Que gusanos moverse sobre la placa durante unos 5 minutos. Uso de bacterias de las placas de Agar NGM ARNi previamente sembrada con lin-53 ARNi bacterias (o control de vectores vacíos) para transferir a las respectivas placas de RNAi.
	<ol>
		<li>Evite transferir bacterias OP50 a las actuales placas de RNAi. Trabajar rápidamente para minimizar el tiempo de exposición de la tensión a temperaturas superiores a 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incubar gusanos en placas de Agar NGM ARNi a 15 ° C durante aproximadamente 7 días, hasta que la progenie F1 de los gusanos llega a L3 – L4 etapa. Pueden claramente separar de los animales de P0 ya que son más grandes y más gruesas que la progenie de la F1.
	<ol>
		<li>Revise visualmente bajo un estereomicroscopio estándar si gusanos de progenie F1 muestran el fenotipo que sobresale de la vulva (pvul) como se muestra en la figura 1. Arni lin - 53 tiene efectos pleiotrópicos y causa el fenotipo de pvul que puede utilizarse para evaluar si ARNi lin - 53 ha sido exitosa. Nota: ARNi lin - 53 también puede causar mortalidad de embriones F1. Este efecto aumenta si las placas están expuestas a grados superiores a 15 ° C antes de animales el L3 – L4 habían llegado. Embriones muertos pueden ser reconocidos por desarrollo arrestado y falta de eclosión.</li>
		<li>Incube las placas en la oscuridad como IPTG es sensible a la luz.</li>
	</ol>
	</li>

4. inducción de la reprogramación de la célula de germen
<ol>
	<li>Incube las placas examinadas de ARNi con lin-53 y vacíe el vector F1 tratados con ARNi progenie durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad para activar CHE-1. Utilizar una incubadora de ventilación ya que permite para un choque de calor más eficiente.</li>
	<li>Permiten animales calor sorprendió a recuperar por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad y luego incubar las placas a 25 ° C durante la noche en la oscuridad.</li>
	<li>Usando un estereomicroscopio estándar junto a una fuente de luz de fluorescencia, examinar los animales bajo el filtro de la GFP para gcy-5prom::gfp-derivado de las señales en el área de la mitad del cuerpo de los gusanos como se muestra en la figura 2. Set Microscopio para señales de GFP: excitación máxima a 488 nm con emisión máxima a 509 nm.</li>
	<li>Evaluar el grado de la célula de germen a la conversión de la neurona por animales de montaje con las señales de la GFP en el área de la mitad del cuerpo en agar que contiene el pad microscopio diapositivas19.
	<ol>
		<li>Contar el número de animales que muestren la célula de germen a la conversión de neurona vs evaluar la penetrancia del fenotipo de los animales oscuros. Típicamente, alrededor 30% de los animales muestran señales discretas de GFP en el germline sobre agotamiento de la lin-53 , mientras que no más del 5% de los animales muestran señales difusas de GFP en el germline en vector vacío ARNi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores han declarado que no hay intereses contrapuestos existen.

Mientras el protocolo se describe utilizando el transgénico C. elegans colar BAT28 y ARNi lin - 53 es directo, una serie de pasos es crítica en orden a asegurar el resultado esperado de la célula de germen para la reprogramación de la neurona. Es importante que la cepa BAT28 se mantiene a 15 ° C en todo momento antes de los experimentos. Durante su manipulación y mantenimiento de la cepa, el tiempo a temperaturas superiores a 15 ° C debe reducirse tanto como sea posible. Condiciones de shock térmico apropiado son importantes ya que insuficiente inducción de sobreexpresión de che-1 no dará lugar a la célula de germen a la conversión de la neurona de ASE. Esto puede detectarse midiendo la penetrancia del fenotipo como se describe en el protocolo. Gran choque térmico puede conducir a la mortalidad de los animales. Por ejemplo, las placas que se han colocado cerca de las paredes internas o en el suelo de la parte inferior de una incubadora de aire estática a menudo experimentan extensa del tratamiento térmico. Por lo tanto, se recomienda utilizar una incubadora de calor ventilado. Además, momento de la inducción del choque del calor es crítica desde la sobre expresión de che-1 durante estadios larvarios antes entonces L3 puede conducir a la inducción de ectópico gcy-5prom::gfp en diversas regiones del cuerpo como la vulva (figura 3) 9. Además, gran choque térmico puede ser detectada por la penetrancia del fenotipo en los animales de RNAi vectores vacíos que no debe extenderse 5% y mayor auto-fluorescencia de otros tejidos, es decir, el intestino.
Esporádicamente, ARNi bacterias pueden perder su actividad para producir eficientemente dsRNA del gene de la blanco. Por desgracia, esto no puede ser detectado antes del experimento de RNAi. En tales casos debe cultivarse una racha fresca desde el glicerol como se describe en la sección 2 del protocolo. Si hay todavía no causado por ARNi pleiotrópico fenotipo visible como el fenotipo pvul causada por ARNi éxito lin-53, luego un plásmido aislamiento de ADN de las bacterias correspondientes debe ser realizado y bacterias HT115 frescas deben ser transformadas con el plásmido L4400 que contiene la secuencia de lin-53 .
Lo importante, la cepa de BAT28 tiene un fenotipo rodillo causado por la inyección marcador pRF4, que fue utilizado durante la transgénesis de animales con la hsp-16.2prom::che-1 construcción de ADN. En ocasiones, los animales pierden el fenotipo de balanceo, que puede indicar el silenciamiento de la hsp-16.2prom::che-1 transgen. Para mantener bien la tensión de BAT28, escoger 10 animales de rodillo para un plato fresco y propagar seleccionando para el balanceo de los animales.
La aplicación del Protocolo se limita a lo F1 ARNi, que quiere decir que los animales cuyos padres (generación de P0) no han estado expuestos a lin-53 ARNi no aparecerá la célula de germen a la conversión de la neurona por rescate materna4. Un procedimiento alternativo para convertir células de germen para las neuronas ha sido descrito por Ciosk y colegas15 utilizando RNAi precipitación de 1 gld y mex-3 sin sobreexpresión de un factor de transcripción. Sin embargo, las neuronas obtenidas no pertenecen a un tipo específico de neuronas y células de germen también convertir células músculo al agotamiento RNAi-mediada de 1 gld y mex-315. Previamente, se ha demostrado el ARNi lin - 53 permitió la conversión de la célula de germen en GABAergic neurona-como las células con sobreexpresión del Pitx-tipo homoedomain del factor de transcripción UNC-3016 en vez de CHE-14 . Para las direcciones futuras, transcripción inductores de destino diferentes factores pueden comprobarse si lin-53 agota las células de germen se puede convertir en otros tipos celulares de las neuronas específicas. En este contexto, la sobreexpresión del bHLH miógeno del factor de transcripción HLH-1, homólogo de mamífero MyoD17, induce la conversión de la célula de germen a los músculos a lin-53 RNAi5. La reprogramación establecida de células de germen para un tipo específico de células somáticas en lin-53 ARNi y sobreexpresión de un factor de transcripción inductores de destino apropiada puede utilizarse para un número de diferentes pantallas genéticas. Tales pantallas supresoras o reforzador pueden ayudar a caminos regulatorios que juegan un papel durante la conversión de la célula sino de disección.

Celular sino reprogramación por expresión ectópica de TF como la MyoD miógena de la TF, que, cuando overexpressed, fibroblastos convertidos directamente en músculo-como las células1, ha sido un foco de investigación durante décadas. Sin embargo, las células diferenciadas suelen ser refractarias a este proceso, debido a mecanismos que salvaguarden la identidad celular. Las células germinales muestran un grado de protección similar y hay mecanismos subyacentes que a menudo actúan como una barrera para evitar la conversión de la célula de germen en otros tipos de células con sobreexpresión de un TF sino inducir. Por lo general, regulación epigenética como modificaciones de las histonas y la estructura de la cromatina impone un obstáculo para la conversión de células sinos2,3. Previamente hemos aplicado genética inversa utilizando RNAi knock-downs en C. elegans e identificaron factores que salvaguardar identidades celulares y así contrarrestar la reprogramación de las células germinales en las neuronas4. Específicamente, el polycomb 2 complejo represivo (PRC2) y el acompañante de histona altamente conservado LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 en los seres humanos) previenen la conversión directa de las células germinales en tipos específicos de células somáticas como las neuronas de gusto glutamatérgica en C. elegans 4 , 5. para identificar estos factores barrera de reprogramación de la célula de germen, utilizan animales transgénicos portadores del shock térmico inducible Zn-dedo CHE TF-1. CHE-1 se expresa normalmente en dos neuronas cabeza de C. elegans, donde especifica el destino de las neuronas del gusto glutamatérgica como ASE6. El destino de la neurona del ASE puede ser visualizado por la expresión de la específica ASE reportero fluorescente gcy-5prom::gfp. GCY-5 es un quimioreceptor sólo expresada en ASE neurona derecha7. Al agotamiento de la lin-53 por ARNi e inducción de amplia expresión ectópica de-1 por choque térmico, las células de germen se puede convertir en neuronas en vivo4,5. Importante, el tiempo de tratamiento de RNAi es crucial como gusanos sólo adultos (generación de P0) expuestos a lin-53 ARNi dan lugar a animales de progenie F1 con una línea germinal que es permisivo para reprogramación en las neuronas4.
La célula de germen antes descrita para el procedimiento de conversión de neurona en C. elegans puede utilizarse para estudiar una variedad de cuestiones biológicas como la implicación de vías en la celda destino reprogramación de señalización. Por ejemplo, se utilizó la célula de germen inducido por el-1 reprogramación en las neuronas de la ASE en RNAi contra lin-53 con el fin de estudiar la implicación de la muesca que se vía en el proceso de la célula de germen reprogramación8de señalización. Realizando doble ARNi para agotan Co 53 lin y la histona codificación demetilasa gen utx-1 demostramos que la muesca de señalización vía contrarresta el silenciamiento del gen PRC2-mediada por activación de la expresión de UTX-1 en la línea germinal8 . Este hallazgo demuestra que la conversión de la célula de germen para las neuronas que se describe en este protocolo podría utilizarse para estudiar un proceso biológico complejo como reprogramación celular en un organismo intacto y en el contexto de diferentes desarrollo y medio ambiente condiciones. Además, ofrece la perspectiva para desafiar a las células germinales sobre-expresando diferentes TFs inducir sino para estudiar su papel en la restricción de la plasticidad celular9, o para evaluar su potencial para inducir la reprogramación de células de germen para otra célula tipos en vivo.
Mientras que los cultivos de tejidos de mamíferos también permiten estudiar diferentes aspectos de la célula sino reprogramación, las células cultivadas en cultivo tienen una capacidad limitada para imitar las condiciones de vía señalización en comparación con un organismo intacto. Por lo tanto, C. elegans es un modelo versátil para el examen de los papeles de diversos procesos biológicos como la señalización de Notch en reprogramación en vivo. Además, es un poderoso modelo de pantallas genéticas que es relativamente fácil de mantener y modificar genéticamente para bajos costos.

<table><tbody><tr><td>Chemicals&nbsp; </agar>-</td><td></td><td></td><td></td>agar fuerte</tr><tr><td>, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptona&nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&nbsp;</td></tr><tr><td>Extracto de levadura&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>USBiológico</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K2PO4</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth&nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>25,163,364</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>Incubadoras</Incubadora></td><td></td><td></td><td></td>fuerte</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td> para incubadora <td>de choque térmico</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>para el mantenimiento de cepas de gusanos a 15 & grados; C o 25 &deg; Microscopio > fluorescencia C</td></tr><tr><td><strong</microscopio ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluorescencia</td><td>fuerte M205 FA</td><td>Microscopio Leica</td><td></td></tr><tr><td>(Imagen) + cámara</td><td>Axio Imager 2</td> Microscopio <td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>(Imagen) + cámara</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Bacteriano cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HT115</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lisógeno: lavUV5 promotor -T7 polimerasa) (polimerasa T7 inducible por IPTG) (RNAsa III menos).</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Uracilo auxótrofo E. coli cepa</td></tr><tr><td><fuerte>Cepas de gusanos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td><td></td><td></td><td>derivado de OH9846 por 4 veces más cruzamiento retrocruzado con N2</td></tr><tr><td> Clones de ARNi</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>FuenteBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Biblioteca Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>vetor vacío: L4440</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>Misc.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm pick&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Hecho por él mismo con una pipeta Pasteur y un alambre de platino</td></tr></tbody></table>

aplicación de rnai y expresión del factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en c. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Estudiar los procesos biológicos de la célula durante la conversión de la identidad de tipos específicos de la célula proporciona penetraciones importantes en mecanismo que mantengan y protegen la identidad celular. La conversión de las células germinales en neuronas específicas en el nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) es una potente herramienta para realizar pantallas genéticas para diseccionar las vías reguladoras que salvaguardar identidades celulares establecidas. Reprogramación de las células de germen para un tipo específico de neuronas denominado ASE requiere animales transgénicos que permiten amplia expresión de la transcripción dedo de Zn factor (TF)-1. -1 endógeno se expresa exclusivamente en dos neuronas cabeza y es necesario especificar el destino de las neuronas glutamatérgica ASE, que fácilmente puede ser visualizado por el reportero gcy-5prom::gfp . Un gen de trans que contienen el shock térmico impulsado por el promotor che-1 gene expresión constructo permite amplia expresión errónea de-1 en el animal entero sobre el tratamiento de choque térmico. La combinación de RNAi contra el factor de regulación de cromatina LIN-53 y provocado por el choque de calor che-1 expresión conduce a la reprogramación de la célula de germen en ASE neurona-como las células. Aquí describimos el procedimiento específico RNAi y condiciones adecuadas para el tratamiento de choque térmico de los animales transgénicos para inducir con éxito la célula de germen a la conversión de la neurona.

Como se muestra en la figura 1, animales F1 que presentan el fenotipo pvul ilustran el uso acertado de la lin-53 ARNi. Estos animales son propensos a permitir la conversión de sus células de germen en ASE neurona-como las células por inducción de shock térmico de la expresión che-1 como se ilustra en la figura 2. En contraste con los gusanos que crecían en el control de vacíos vector ARNi lin-53 ARNi tratamiento producirá animales que muestran señales de GFP ectópicas en el área de la mitad del cuerpo después de choque térmico e incubación de 25 ° C durante la noche anterior descrito4, 8. detenimiento bajo un microscopio de epifluorescencia de estos gusanos revela que las células que muestran señales GFP también Mostrar la neurona-como proyecciones (figura 2B, flechas blancas) que son típicas para las células neuronales. Si ARNi lin - 53 no fue exitosa o condiciones de shock térmico inadecuadas señales GFP se se asemejan a ésos en control ARNi animales tratados (figura 2). Lo importante es evitar inducir la sobreexpresión de che-1 por inducción de calor antes de animales lleguen a etapa mediado de L3. Animales que eran demasiado jóvenes en el momento de la inducción de la sobreexpresión de che-1 pueden mostrar expresión ectópica gcy-5prom::gfp en otras regiones del cuerpo como la vulva en vías de desarrollo como se muestra en la figura 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Figura 1: Pvul fenotipo causado por ARNi lin-53. (Top) Foto DIC de gusanos de progenie de etapa adulta F1 L4 joven deriva de control o lin-53 madres ARNi tratado. Barras de escala = 20 μm. (abajo) los animales tratados con lin-53 pantalla ARNi el fenotipo que sobresale de la vulva (pvul) (cabezas de flecha negras). El fenotipo de pvul confirma que el ARNi lin - 53 era acertado. Barras de escala = 20 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Figura 2: Gusanos con la célula de germen con éxito reprogramada en las neuronas. (A) BAT28 animales de cepa cultivados en el vector vacío no muestran señales GFP en el germline después de la inducción del choque del calor de la sobreexpresión de che-1 . Gusano de contornos de línea blanca discontinua. Barras de escala = 20 μm. (B) en contraste con animales de cepa de BAT28 cultivados en el control de vector vacío ARNi animales cultivados en lin-53 RNAi muestran gcy-5prom::gfp señales en el área de la mitad del cuerpo. Fotos de la sección de la mitad del cuerpo con señales GFP en 63 aumentos revelan células GFP-positivas que muestran salientes (cabezas de flecha blancas). Esta característica morfológica indica que las células germinales experimentó la conversión en ASE neurona-como las células. Asteriscos blanco marcan auto-fluorescencia derivadas del intestino. Todas las imágenes fueron adquiridas mediante un microscopio de epifluorescencia con aumento de 63 aumentos 20 X. Línea blanca discontinua describe gusanos. Barras de escala = 20 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Figura 3: Gusano de etapa temprana con GFP ectópico. BAT28 animales de cepa cultivados en el vector vacío ARNi bacterias choque del calor inducida por la sobreexpresión de che-1 en las primeras etapas larvales como L2 muestran señales GFP en el área de la mitad del cuerpo (asteriscos blancos). Estas señales no son debido a la reprogramación de la célula de germen. Gusano de contornos de línea blanca discontinua. Barras de escala = 20 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe cómo estudiar procesos celulares durante la conversión de destino celular en Caenorhabditis elegans en vivo. Uso de animales transgénicos, permitiendo sobreexpresión impulsado por el promotor de shock térmico la neurona destino-inducción del factor de transcripción CHE-1 y agotamiento RNAi-mediada de la regulación de cromatina factor LIN-53 germen célula neurona reprogramación puede observarse en vivo.

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir la conversión de células germinales en neuronas en C. elegans. Este método puede ayudar a investigar la implicación de procesos biológicos, como las vías de señalización o la epigenética en la regulación de la reprogramación del destino celular. La principal ventaja del método descrito en este video es que en animales vivos, las células germinales pueden ser desafiadas por la sobreexpresión de un factor de transcripción que induce el destino.Mientras tanto, en paralelo, se puede realizar un cribado genético como un cribado de ARNi para identificar nuevos factores que están implicados en la regulación de la reprogramación celular. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia regenerativa. Porque este método in vivo podría utilizarse para estudiar la reprogramación celular en diferentes condiciones de desarrollo y ambientales.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de reprogramación son difíciles de aprender. Porque el fenotipo de conversión de células germinales a neuronas, tras el agotamiento de lin-53, solo ocurre en condiciones cuidadosamente controladas. Para las placas de ARNi, cargue placas de seis centímetros con agar NGM que contenga IPTG y carbenicilina.Déjalos secar de 24 a 48 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego transfiéralos a cuatro grados centígrados durante un máximo de 14 días. A continuación, placas selectivas de rayas que contienen carbenicilina y tetraciclina con clones de bacterias RNAi con plásmido L4440 portadores del gen lin-53.Use un patrón de rayas trifásico y asegúrese de colocar un control vectorial vacío. Luego, cultive las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, elija al menos tres colonias individuales e inocule cada una de ellas en un tubo de cultivo separado con dos mililitros de LB, suplementado con carbenicilina, pero no con tetraciclina.Planee tener tres cultivos saludables por afección. A continuación, cultive los cultivos durante la noche a 37 grados centígrados hasta que alcancen una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,6 a 0,8. A continuación, se añaden 500 microlitros de cada cultivo bacteriano a una placa de ARNi de agar NGM de seis centímetros.Incube las placas durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Este protocolo está optimizado para gusanos de la cepa BAT28 mantenidos a 15 grados centígrados, donde los transgenes son más estables. Los detalles sobre la genética de la cepa se proporcionan en el texto.La sincronización de la edad de los gusanos es fundamental. Utiliza la técnica de blanqueo. Lave platos de agar NGM de seis centímetros que contengan adultos y huevos con 800 microlitros de M9. A continuación, granule los gusanos por centrifugación y retire el sobrenadante.A continuación, agregue de 1/2 a un mililitro de solución blanqueadora a los gusanos. Y mientras observa a los gusanos bajo un estereoscopio, agite el tubo hasta que los gusanos adultos comiencen a abrirse y luego recoja los huevos. Ahora, separa los residuos de los huevos.Primero centrifuga el tubo y desecha el sobrenadante. A continuación, lavar el pellet de pañuelos con 800 microlitros de M9 tres veces. Asegúrese de usar la centrifugación para agrupar los tejidos entre los lavados.Ahora, transfiera los huevos limpios a placas NGM frescas sembradas con la bacteria OP50. Comprobar brevemente el éxito del aislamiento de los embriones y su transferencia a las placas NGM. Cultive los animales a 15 grados centígrados.Para lograr la conversión de células germinales en neuronas tras el agotamiento de lin-53, el agotamiento debe comenzar en la generación parental. Para agotar lin-53, someta a los animales L4 a ARNi. Transfiera manualmente 50 gusanos L4 por réplica a una placa NGM RNAi sin bacterias.Usa un alambre de platino. Los gusanos L4 se pueden reconocer por una mancha blanca aproximadamente a la mitad de sus lados ventrales. Ahora, incuba los gusanos a 15 grados centígrados en la oscuridad durante unos siete días.El IPTG es sensible a la luz. Cuando la progenie F1 alcance las etapas L3 y L4, sepárelos de los animales parentales más grandes y gruesos. En este punto, se examina la F1 para detectar el fenotipo de vulva protuberante, lo que indica que el ARNi contra lin-53 ha tenido éxito.La actividad del ARNi también puede provocar letalidad, que aumenta por encima de los 15 grados centígrados. Para activar che-1 e inducir la conversión de células germinales en neuronas en la progenie F1, se someten a los gusanos a un choque térmico durante 30 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad. Utilice una incubadora ventilada, ya que permite un choque térmico más eficiente.Después del choque térmico, incube las placas a 25 grados centígrados durante la noche en la oscuridad. Es importante evitar inducir una sobreexpresión de che-1 por choque térmico antes de que los animales alcancen la mitad de la etapa L3. Esto puede conducir a la expresión de la proteína che-1 en tejidos no dirigidos.Al día siguiente, instaló una fuente de luz de fluorescencia y un filtro GFP para examinar a los animales en busca de fluorescencia derivada de transgenes en el área media del cuerpo. Para evaluar la penetrancia del fenotipo, encuentre la proporción de animales que emiten una señal fluorescente. Por lo general, alrededor del 30% mostrará una señal GFP discreta.En comparación, en los animales portadores del ARNi vectorial vacío, incluso una señal difusa en la línea germinal no se observa en más del 5% de la población. Los animales F1 que exhiben el fenotipo de vulva protuberante ilustran la aplicación exitosa del ARNi lin-53. En estos animales, es común la conversión de células germinales en células similares a las neuronas ASE tras la inducción por choque térmico de che-1.Un examen minucioso revela proyecciones similares a las neuronas que son típicas de las neuronas de las células germinales. Por el contrario, los controles vectoriales vacíos mostraron una expresión mínima de GFP, que era, a lo sumo, difusa. Las células germinales de estos animales carecían de características similares a las neuronas.Cuando los animales eran demasiado jóvenes en el momento de la inducción de la sobreexpresión de che-1, a menudo mostraban expresión ectópica de transgenes en otras regiones del cuerpo, como la vulva en desarrollo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo planificar y realizar cuidadosamente los experimentos con gusanos vivos para reprogramar las células germinales en neuronas. El método descrito aquí en este video le permitirá ahora investigar la implicación de una serie de factores diferentes en la regulación de la reprogramación celular.Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en 10 días. Al intentar el experimento, es importante organizar cuidadosamente a los animales antes de la inducción de la reprogramación, y mantener la cepa BAT28 a 15 grados. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el doble ARNi para abordar preguntas adicionales como: ¿Cuáles son los mecanismos subyacentes que juegan un papel durante las conversiones del destino celular?

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Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans (Video) | JoVE Journal

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

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