Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

El objetivo general de esta técnica es probar los efectos de diferentes compuestos en los organismos modelo C. elegans en un ensayo de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la química, la biología y el envejecimiento, como ¿las estructuras químicas específicas extienden la vida útil de C. elegans? La principal ventaja de esta técnica es que permite el cribado de numerosos compuestos de una manera rápida y eficiente en el tiempo.

Para preparar placas de cultivo masivo para la producción de grandes cantidades de gusanos, en un gabinete de flujo laminar, primero dispense 30 mililitros de agar medio de crecimiento de nematodos a 60 grados Celsius en placas de cultivo de 10 centímetros para la solidificación durante la noche. A la mañana siguiente, agregue dos mililitros de E. coli concentrada en cada plato, inclinando y girando el plato para propagar las bacterias completamente por la superficie del plato. Cuando las placas de cultivo masivo se hayan secado, guárdelas a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos semanas.

Para preparar placas de cultivo de ensayo de alto rendimiento para el cribado, utilice un dispensador automático de ocho canales para añadir 0,15 mililitros de agar medio de crecimiento de nematodos fundidos en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Deje que el agar se solidifique durante la noche. A continuación, almacene las placas de ensayo de alto rendimiento a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos semanas.

Para establecer los cultivos de C. elegans, use un palillo de lombrices y un microscopio de disección para transferir 20 huevos a cada placa de cultivo masivo e incubar las placas a 20 grados Celsius durante seis días. Al séptimo día, use un microscopio de disección para confirmar visualmente la presencia de óvulos en el útero. Para recolectar los adultos grávidos, use una pipeta de vidrio para agregar de dos a tres mililitros de solución basal de S por placa y agite las soluciones alrededor de cada placa con la mano.

Utilice la pipeta de vidrio para transferir las lombrices a un tubo de 15 mililitros y granular las lombrices por centrifugación. Vuelva a suspender las lombrices en 10 mililitros de solución de hipoclorito y agite rápidamente los tubos hacia arriba y hacia abajo durante cinco segundos. Luego, incuba las lombrices durante cinco minutos a temperatura ambiente agitando cada 2,5 minutos.

Al final de la incubación, vuelva a centrifugar los gusanos. Los gránulos deben ser de color marrón amarillento. Reemplace los sobrenadantes con 10 mililitros de solución de hipoclorito fresco y vuelva a agitar vigorosamente el tubo.

Incuba los gusanos durante uno a tres minutos más, agitándolos de vez en cuando. Cuando solo queden huevos, centrifugar los tubos y aspirar los sobrenadantes. Los gránulos deben ser blancos sin coloración marrón.

Utilizando una técnica estéril, abra los tubos en una cabina de flujo laminar estéril y agregue 14 mililitros de solución basal de S a cada pellet. Lavar el pellet tres veces con 14 mililitros de S Basal. Después de tres lavados por centrifugación, vuelva a suspender los huevos en dos o tres mililitros de solución basal S fresca.

Para preparar larvas de C. elegans en etapa L1, transfiera los sobrenadantes a una placa de Petri de vidrio estéril por tubo y use de dos a tres mililitros de solución basal S para enjuagar los huevos restantes de los tubos en cada placa. Agregue cinco mililitros de solución basal S a cada plato para aliviar el hacinamiento y coloque el plato en un agitador orbital a 20 grados Celsius y 20 rpm durante 16 a 24 horas para fomentar la eclosión. Todas las crías se detendrán en la primera etapa larvaria debido a la falta de alimento.

Con una pipeta serológica, transfiera las larvas L1 a un tubo de 15 mililitros para su centrifugación. Después de que todos los L1 eclosionados se hayan consolidado mediante centrifugación y aspiración repetidas, vuelva a suspender el pellet de larva con 10 mililitros de solución basal S estéril. Luego, transfiera 10 microlitros a un plato sin semillas y cuente el número de larvas que están presentes en el plato.

Repita esto 10 veces para obtener la densidad promedio de L1s en su solución. Con una pipeta serológica estéril, determine el volumen total de solución que contiene las L1. A continuación, utilice el volumen de la solución L1 y la densidad de L1 en la solución para calcular el número total de L1 presentes en su solución.

Para colocar los gusanos en una placa de ensayo de alto rendimiento de 96 pocillos, diluya la suspensión L1 a una larva L1 por microlitro en una botella de medio redonda estéril, equipada con una barra de agitación de giro moderadamente lenta y deje que las placas de ensayo se calienten a temperatura ambiente. A continuación, en una cabina de flujo laminar, agregue cinco microlitros de E. coli concentrada a cada pocillo, seguidos de 10 microlitros de suspensión L1 por pocillo para producir un promedio de 10 gusanos por pocillo. Cuando todos los gusanos hayan sido colocados, cubra los platos e incube los gusanos durante dos días a 25 grados centígrados, para permitir que las larvas se conviertan en adultos.

Al final de la incubación, lleve las placas de la biblioteca química a la temperatura ambiente desde la congelación. Agite suavemente las placas descongeladas a 60 rpm en un agitador de microplacas durante un minuto inmediatamente antes de usarlas. Utilizando un manipulador de líquido automatizado de 96 pocillos, transfiera 0,75 microlitros de compuesto de la placa de biblioteca a la placa de ensayo.

Cuando se hayan tratado todos los pocillos, seque al aire el compuesto de la superficie de las placas en una cabina de flujo laminar durante cuatro a ocho horas, retirando las placas individuales tan pronto como estén secas. Selle las placas secas con una película transparente y tápallas. A continuación, gire las placas durante 45 segundos a 1000 g y guárdelas en posición invertida a 25 grados centígrados.

Para probar las respuestas de C. elegans a los compuestos de interés, se puede utilizar una placa de control negativa para puntuar la supervivencia total hasta que el 95% de los animales de control estén muertos, momento en el que se pueden puntuar todas las placas de prueba. Por ejemplo, en este estudio, se observaron 57 resultados de la biblioteca de retest de 179 compuestos, lo que demuestra que el 32% de los productos químicos retest dieron positivo en total. El agrupamiento de las puntuaciones promediadas del porcentaje de vivos vivos para los pozos de control negativos y de prueba indicó que los pozos de prueba superaron a los pozos de control.

También se pueden realizar cribados a pequeña escala, como se demuestra en este ensayo de prueba representativo en el que se utilizaron concentraciones de 50 micromolares y 100 micromolares del compuesto de ensayo. La repetición de la puntuación de estas placas de prueba de ensayo de pantalla pequeña cuando más del 99% de los animales tratados con control negativo estaban muertos, indicó que los pocillos de control positivo superaron con creces a los pocillos de control negativo y de prueba en el sentido de que los pocillos de prueba se comportaron ligeramente mejor que los controles negativos. En este experimento, el último resultado estuvo sesgado por la indicación de que muchos de los pozos de prueba parecían exhibir toxicidad en relación con el tratamiento de control, lo que confundió esta simple interpretación.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos a cuatro semanas si se realiza correctamente. Al realizar este procedimiento, es importante mantener la integridad de las placas de ensayo, asegurándose de que estén impecables antes de usarlas. Siguiendo esta técnica, se pueden responder preguntas adicionales, como por ejemplo, ¿cuál de estos compuestos induce la mitofagia?

Para un ensayo de mitofagia, se utilizaría una hebra reportera de mitofagia. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar un cribado químico de alto rendimiento utilizando C. elegans como organismo modelo.