Etiquetado metabólico y perfiles de RNAs de transferencia utilizando Macroarrays

Describimos a una plataforma de análisis de ARN de transferencia original llamada SPOt (plataforma optimizada para la observación de tRNA). Lugar simultáneamente mide los niveles celulares de todos los tRNAs en muestras biológicas, en sólo tres pasos y en menos de 24 horas.

El objetivo general de este procedimiento es medir simultáneamente los niveles celulares de todos los ARN de transferencia en muestras biológicas mediante la combinación de marcaje metabólico in vivo con análisis de macroarrays. Los ARN de transferencia se consideraron durante mucho tiempo como moléculas de mantenimiento que carecían de funciones reguladoras. Sin embargo, cada vez hay más pruebas que indican que los niveles de ARNt celular fluctúan en respuesta a diversas condiciones, como el tipo de célula, el entorno y el estrés.

La fluctuación de la expresión del ARNt influye directamente en la traducción de los genes, favoreciendo o reprimiendo la expresión de determinadas proteínas. La comprensión de la dinámica de la síntesis de proteínas requiere métodos capaces de proporcionar perfiles de ARNt de alta calidad. Presentamos aquí una técnica fiable y sencilla que permite la cuantificación rápida y precisa de los niveles de ARN de transferencia en organismos cultivados en laboratorio.

Para empezar, con una aguja de calibre 18, coloque un solo orificio en el centro de la tapa de un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros para permitir una aireación adecuada. Luego, con cinco microlitros de Mycobacterium smegmatis de un cultivo iniciador durante la noche, inocule 500 microlitros de caldo 7H9 estéril suplementado. Siguiendo las prácticas estándar de radioprotección, agregue 20 microcurios por mililitro de ortofosfato marcado con fósforo-32.

Cultive bacterias a 37 grados centígrados y 1.200 rpm, en una incubadora agitadora colocada detrás de un escudo acrílico de nueve milímetros de grosor. En la fase de mitad de registro, transfiera todo el cultivo a un tubo de rosca de dos mililitros y granule las bacterias radiactivas a temperatura ambiente centrifugando a 10.000 veces la gravedad durante dos minutos. Recoja el sobrenadante que contenga ortofosfato radiactivo no incorporado en un contenedor de residuos adecuado.

Para preparar el ARN total, agregue un mililitro de reactivo de extracción de ARN comercial y aproximadamente 200 microlitros de perlas de vidrio al pellet. Tape firmemente el tubo y altere las bacterias en un homogeneizador bajo agitación máxima durante dos minutos. Centrifugar la muestra a 12.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.

Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros y deseche adecuadamente las perlas. Agregue 0,2 mililitros de cloroformo y agite vigorosamente el tubo con la mano durante 15 segundos. A continuación, centrifuga la muestra a 12.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 15 minutos.

Recoja la fase acuosa de la muestra en un nuevo tubo inclinando el tubo a 45 grados. Evite dibujar alguna capa orgánica o de interfase. Añadir dos microlitros de precipitante coloreado y 0,5 mililitros de isopropanol al 100% a la fase acuosa.

Agite el tubo vigorosamente con la mano durante cinco segundos y vuelva a centrifugar. Retire el sobrenadante del tubo y deséchelo adecuadamente, ya que la fracción líquida puede contener trazas de radiactividad. Luego, después de secar al aire el pellet durante cinco minutos, vuelva a suspenderlo en 200 microlitros de SSC 2X con 0.1% de peso por volumen SDS.

Con la base de datos de ARNt genómico, diseñe sondas de ADN recuperando primero secuencias de ARNt o genes que codifican ARNt. Después de recortar los CCA conservados de tres extremos primos si están codificados y generar el complemento inverso, ordene las sondas en función de los primeros 70 nucleótidos. Para llevar a cabo la impresión de matriz, descongele la placa de 96 pocillos a temperatura ambiente.

Con un bolígrafo de diamante, etiquete portaobjetos de vidrio recubiertos de amina. A continuación, coloque las diapositivas en una unidad de indexación. Después de las colocaciones de la cuadrícula, sumerja con cuidado los pines del replicador en los pozos.

Con una presión mínima, imprima suavemente la matriz en los portaobjetos de vidrio. Continúe imprimiendo sin limpiar el arreglo hasta que termine con el bloque A.It se necesita algo de práctica para poder imprimir de manera consistente. Se recomienda imprimir no más de ocho a 10 matrices por sesión.

Cuente de 10 a 15 minutos por matriz. Es fácil perder la noción de la secuencia del patrón de impresión, así que dedique toda su atención a la tarea y apague todas las distracciones. Cuando esté listo para pasar al siguiente bloque, sumerja el replicador en lejía al 5% y agite suavemente.

Presione el replicador en papel absorbente. Luego, sumerja el replicador en agua destilada, agite suavemente y presione en papel. Repita este paso una vez.

A continuación, sumerja el replicador en isopropanol, agítelo suavemente y presiónelo en el papel. Seque el replicador en el ventilador durante unos 20 segundos antes de pasar al siguiente bloque de la placa de 96 pocillos. Continúe hasta el número deseado de impresiones.

Luego, deja que los portaobjetos se sequen. Coloque los portaobjetos secos boca arriba sobre una superficie limpia en un reticulante UV de 254 nanómetros. Establezca el nivel de energía en 999, 990 microjulios por centímetro cuadrado y, a continuación, presione inicio.

Transfiera las matrices a 450 mililitros de solución de bloqueo e incube a temperatura ambiente en un agitador magnético, bajo agitación lenta durante la noche. Lave los portaobjetos en 500 mililitros de agua destilada a temperatura ambiente, dos veces durante cinco minutos cada una. Seque los portaobjetos mediante centrifugación en una centrífuga de microarrays a temperatura ambiente durante 10 segundos.

Guarde las matrices en un lugar seco y oscuro hasta por seis meses. Antes de la hibridación, enjuague los portaobjetos en agua hirviendo y séquelos por centrifugación. Coloque la matriz dentro de un casete de hibridación y cargue la muestra de ARN radiomarcada.

Ejecute las muestras en una estación de hibridación-lavado automatizada para obtener la máxima reproducibilidad de acuerdo con el protocolo de texto. Al final de la tirada, seque los portaobjetos por centrifugación. Envuelva los portaobjetos con plástico fino.

A continuación, utilice un contador Geiger en su configuración más sensible para comprobar si hay señal radiactiva en los portaobjetos. Exponga las diapositivas en una pantalla de fósforo de almacenamiento en un casete de exposición a temperatura ambiente durante 10 a 90 horas, dependiendo de la intensidad de la señal. El tiempo de exposición, que puede durar desde unas horas hasta unos días, depende directamente de la señal de la matriz.

Se necesita algo de práctica para poder traducir los recuentos en el contador Geiger en tiempo de exposición. Escanee portaobjetos con una resolución de 50 micrómetros con un generador de imágenes de fósforo. Cuantifique y reste las intensidades de radiactividad de fondo en cada punto de la sonda utilizando el software gratuito ImageJ actualizado con un perfilador de microarrays.

Generar mapas de calor según el protocolo de texto. Aquí se muestran macromatrices escaneadas de bacterias, ratones y humanos. Las matrices de M.smegmatis usan solo 43 sondas en lugar de las 48 que se usan para ratones y humanos.

Como resultado, la matriz bacteriana muestra 40 puntos vacíos que se mezclan con el fondo. Tres réplicas biológicas independientes muestran que, en las condiciones de crecimiento probadas, todos los ARNt de M. smegmatis se expresan por encima del nivel de fondo. En este experimento en particular, la desviación estándar observada para cada sonda está entre el 2% de arginina TCT y el 22% de cisteína GCA con la mediana en 5% Además, este experimento muestra que la expresión de los isoaceptores de ARNt no es uniforme.

Por ejemplo, todos los isoaceptores de alanina se expresan a niveles similares, mientras que los ARNt que aceptan arginina más alto y más bajo difieren en tres veces. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente 24 horas si se realiza correctamente y si la señal puntual es la adecuada. Nuestro método es aplicable a cualquier organismo cuyo genoma esté disponible para el diseño de sondas.

Los organismos modelo que se cultivan in vitro son candidatos ideales para el marcaje metabólico. El protocolo presentado aquí está optimizado para Mycobacterium smegmatis, pero también se utilizó con éxito para perfilar el ARNt en E. coli, levadura, ratones y células cultivadas humanas. Nuestra técnica es reproducible y específica.

Su amplio rango dinámico y umbral fácilmente ajustable permiten perfilar especies de baja abundancia, como los ARNt asociados a polisomas, simplemente prolongando los tiempos de exposición de la matriz.