Cuantificación de endógeno auxina y citoquinina durante cultura de entrenudo de Ipecacuana

El objetivo general de este procedimiento es describir cómo cambian los niveles de fitohormonas endógenas durante la formación de brotes adventicios en ipecacuana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la regeneración de tejidos en el ciclo de cultivo de tejidos vegetales. La principal ventaja de esta técnica es que el nivel endógeno de ácido indol-3-acético y las citoquininas se pueden analizar de forma sencilla y con alta sensibilidad.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a lo largo del establecimiento de la degeneración del tejido vegetal porque los cambios en el nivel de fitohormonas endógenas desencadenan la formación de brotes adventicios. Para empezar, prepara un medio B5 libre de fitohormonas y añade un 0,2 por ciento de goma gellan. Luego, autoclave el medio para esterilizarlo.

Con un bisturí quirúrgico en una placa acrílica estéril, corte segmentos internodales de ocho milímetros de plántulas de ipecacuana y colóquelos en el medio. Luego, cultive los segmentos de ipecacuana a 24 grados Celsius bajo 15 micromoles por metro cuadrado de segundos de luz en un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad durante cinco semanas. Después de cultivar los segmentos de ipecacuana, identifique las regiones del uno al cuatro en cada segmento.

Una vez a la semana, use un microscopio para contar el número de brotes adventicios en cada región. Primero, coloque una perla de circonio de cinco milímetros en cuatro tubos de muestra de dos mililitros. Luego, use un bisturí quirúrgico en una placa acrílica estéril para cortar los segmentos de ipecacuana en las regiones I a IV. Luego recoja ocho segmentos de cada región en un tubo de muestra.

Pesa cada una de las muestras y congélalas en nitrógeno líquido. A continuación, utilice un homogeneizador a base de perlas para triturar las muestras congeladas. Utilice un mezclador de vórtice para suspender las muestras en un mililitro de acetonitrilo con 500 picogramos de cada patrón interno de bueyes y CK.

Coloque las muestras a cuatro grados centígrados durante una hora. Y luego centrifugar las muestras a 3500 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lave el pellet con un 80 por ciento de nitrilo acetálico y un uno por ciento de ácido acético.

A continuación, repita la centrifugación y utilice un tubo desechable para combinar los sobrenadantes. Agregue 600 microlitros de agua con ácido acético al uno por ciento al sobrenadante combinado. A continuación, utilice un concentrador de vacío para evaporar el nitrilo acetal.

Cargue las soluciones de muestra en cartuchos de HLB equilibrados individuales. Y lavar los cartuchos con un mililitro de agua con ácido acético al uno por ciento. Luego alude a todas las hormonas con dos mililitros de 80 por ciento de nitrilo acetil con 1 por ciento de ácido acético en un tubo de vidrio.

Usando un concentrador de vacío, evapore el nitrilo acetal para obtener extracto en agua con ácido acético al uno por ciento. Cargue las soluciones de muestra en cartuchos MCX equilibrados individuales y lave los cartuchos con un mililitro de agua con ácido acético al uno por ciento. Luego alude al IAA en un tubo de vidrio, con dos mililitros de 30 por ciento de nitrilo acetal con uno por ciento de ácido acético.

A continuación, lavar los cartuchos con dos mililitros de nitrilo acetálico al 80 por ciento con ácido acético al 1 por ciento. A continuación, lave los cartuchos con dos mililitros de agua y un mililitro de agua con un cinco por ciento de amoníaco acuoso en una cámara de tiro. Alude a los CKs en un tubo de vidrio con dos mililitros de 60 por ciento de nitrilo acetálico con cinco por ciento de amoníaco acuoso en una cámara de tiro.

A continuación, utilice un concentrador de vacío para evaporar el disolvente de cada fracción hormonal. Agite las muestras a menos treinta grados centígrados hasta el análisis LCMSMS. Primero, disuelva cada extracto hormonal en un tubo con 600 microlitros de metanol.

A continuación, transfiera la solución a un vial de recuperación total con cuello de rosca y utilice un concentrador de vacío para evaporar el disolvente. Disolver la fracción IAA en 20 microlitros de nitrilo acetálico al 30 por ciento y las fracciones CK en 20 microlitros de agua con ácido acético al uno por ciento. A continuación, utilice un sistema MS de triple cuadrupolo equipado con un sistema HPLC para analizar las muestras en modo de iones positivos.

Por último, cuantificar el AAI endógeno en los niveles de CK frente a una curva estándar de la proporción de patrones de etiqueta sin marcar a deuterio. En este protocolo, la citoquinina oxidante endógena en conductos adventicios se midió mediante LCMSMS durante cinco semanas. En la primera semana, no se habían formado conductos adventicios y los primeros conductos pequeños aparecieron durante la segunda semana.

Durante la tercera y cuarta semana, el número de rampas aumentó principalmente en los regentes uno y dos. Durante la quinta semana, el número de rampas fue de aproximadamente siete en la región uno y de cinco en la región dos. Antes de la cultura, el nivel de AAI era ligeramente más alto en la región uno que en las regiones dos, tres y cuatro.

Durante la primera semana, el nivel de IAA aumentó considerablemente en la región cuatro y disminuyó ligeramente en las regiones uno, dos y tres. A las cinco semanas de cultivo emergió un gradiente de concentración de IAA. Con niveles que aumentan de la región uno a la región cuatro.

Antes de la cultura, solo había niveles de trazas de la mayoría de las CK. En la primera semana, el nivel de tZR aumentó a 13,8 picogramos por miligramo en la región dos. Y 18.1 picogramos por miligramo en la región tres.

Por el contrario, los niveles de tZ, iP e iPR solo cambiaron ligeramente durante el cultivo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las hormonas de la parte endógena son estables. Una vez desarrollado el hombre, esta técnica allana el camino para los investigadores en el campo del cultivo de tejidos vegetales.

Explorar la formación adventicia en otros organismos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar el ácido indol-3-acético endógeno y las citoquininas.