Name: Cuantificación de endógeno auxina y citoquinina durante cultura de entrenudo de Ipecacuana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprende a cuantificar auxina y citoquinina endógenas en cultivos de entrenudo de ipecacuana mediante LC-MS/MS. Este método de alta sensibilidad permite analizar la dinámica de fitohormonas durante la formación de brotes adventicios.

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Agradecemos al Sr. Akira Murakami del Departamento de Biociencias Aplicadas, la Universidad de Toyo y el Sr. Koudai Taniguchi del centro de tecnología agrícola de Gunma su asistencia técnica. Agradecemos también al profesor Shosaku Kashiwada y Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Universidad de Toyo por sus sugerencias. Este estudio fue apoyado en parte por el centro de investigación para la vida y ciencias ambientales, Universidad de Toyo.

Nota: Jarabe de Ipecacuana (C. ipecacuanha) fue utilizado en este estudio porque facilita el análisis de fitohormonas endógenas.
1. crecimiento condiciones para inducir brotes adventicios de Ipecacuana
<ol><li>Preparar medio de B5 sin phytohormone ajustado a pH 5.710y agregar 0.2% la goma de gellan. Esterilice en autoclave.</li>
	<li>Vierta 25 mL del medio esterilizado en una placa Petri estéril (90 mm × 20 mm).</li>
	<li>Corte 8 mm segmentos internodales de plántulas de ipecac usando un bisturí con hoja nº 22 en una placa de acrílico estéril y colocar en el medio (figura 1).</li>
	<li>Cultura en medio de B5 sin fitohormonas a 24 ° C con 15 μmol m−2 s−1 de la luz en un ciclo oscuro de 14 h luz/10-h por 5 semanas.</li>
	<li>Identificar las regiones que (apical) a IV (basal) en cada segmento (figura 1B). Contar el número de brotes adventicios > 0,3 mm de longitud en cada región bajo un microscopio una vez por semana.</li>
</ol>2. extracción y purificación de fitohormonas
<ol><li>Poner un grano de circonio de 5 mm en cada uno de los cuatro tubos de 2 mL de muestra.</li>
	<li>Cortar los segmentos de las regiones I a IV (cada 2 mm de longitud) con un bisturí en una placa de acrílico estéril.</li>
	<li>Recoger ocho segmentos de cada región en tubos de muestras separadas (10-30 mg de peso fresco).</li>
	<li>Pesan y luego congelar las muestras en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Triturar las muestras congeladas utilizando un homogeneizador basado en grano.</li>
	<li>Suspender las muestras machacadas en acetonitrilo 1 mL que contiene 500 pg de cada estándar interno de Auxina y CKs (d5-IAA d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- derechos de propiedad intelectual) usando un mezclador de tipo vórtex.</li>
	<li>Mantener a 4 ° C por 1 h, luego centrifugar a 3.500 × g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar el precipitado en 80% (v/v) de acetonitrilo que contenga ácido acético al 1% (v/v). Centrifugar nuevamente a 3.500 × g por 5 min a temperatura ambiente. Combinar los sobrenadantes (de pasos 2.7 y 2.8) en un tubo de vidrio desechable.</li>
	<li>Añadir 600 μl que contiene ácido acético al 1% (v/v) a cada sobrenadante combinado de agua y evaporar el acetonitrilo utilizando un concentrador de vacío.</li>
	<li>Equilibrar hidrofílico-lipofílico-equilibrado cartuchos de columna (HLB) mediante la aplicación de 1 mL de acetonitrilo, metanol y agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).</li>
	<li>Aplique una solución de la muestra por medio cartucho HLB.</li>
	<li>Lavar los cartuchos con 1 mL de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).</li>
	<li>Responsables todas las hormonas con acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL que contiene ácido acético al 1% (v/v) en un tubo de vidrio.</li>
	<li>Evaporar el acetonitrilo en el efluente para obtener el extracto en agua que contiene ácido acético al 1% (v/v) utilizando un concentrador de vacío. Nota: No esta seco completamente.</li>
	<li>Equilibre los cartuchos de columna de modo mixto, fuerte intercambio catiónico (MCX) mediante la aplicación de 1 mL de metanol, acetonitrilo 1 mL, 0,5 mL 0.1 M de HCl y 1 mL de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).</li>
	<li>Aplique una solución de la muestra por medio cartucho MCX.</li>
	<li>Lavar los cartuchos con 1 mL de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).</li>
	<li>Eluir IAA con acetonitrilo del de 30% (v/v) de 2 mL que contiene ácido acético al 1% (v/v) en un tubo de vidrio.</li>
	<li>Lavar los cartuchos con acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL que contiene ácido acético al 1% (v/v).</li>
	<li>Lavar los cartuchos con 2 mL de agua y 1 mL de agua con amoniaco acuosa 5%.</li>
	<li>Eluir el CKs con acetonitrilo del de 60% (v/v) de 2 mL que contiene 5% de amoníaco acuoso en un tubo de vidrio.</li>
	<li>Evaporar el solvente de cada fracción de la hormona mediante un concentrador de vacío y almacenar a −30 ° C hasta el análisis de LC-MS/MS.</li>
</ol>3. LC-MS/MS análisis de IAA y CKs
<ol><li>Disolver el extracto de cada hormona en un tubo con 600 μl de metanol y transferir la solución a un frasco de recuperación total del cuello de tornillo. Evaporar el disolvente utilizando un concentrador de vacío.</li>
	<li>Disolver la fracción de IAA en 20 μL 30% (v/v) acetonitrilo y las fracciones CK en 20 μl de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v) en viales de tornillo cuello recuperación total.</li>
	<li>Analizar las muestras en el modo de iones positivos en un sistema de MS triple cuadrupolo equipado con un sistema HPLC. Nota: Hemos creado las condiciones HPLC como se indica en la tabla 1.<ol>
<li>Para la elución de la IAA, utilizar un gradiente binario de 5% - 50% de disolvente B sobre 7 minutos, luego aumentar por 98% solvente B durante 1 min y luego equilibre durante 2 min a 5% disolvente B por inyección de nido.</li>
		<li>Para la elución de CK, utilizar un gradiente binario de 2% - 40% disolvente B sobre 5 minutos, 40% - 70% de disolvente B en 7 minutos, luego aumentar al 95% solvente B durante 1 min y luego equilibre durante 2 min a 2% solvente B por inyección de nido.</li>
		<li>Establecer la ionización por electrospray (ESI)-MS los parámetros de la fuente de iones que se enumeran en la tabla 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar la reacción múltiple control de transición (MRM) para la cuantificación de cada analito que se enumeran en la tabla 3.</li>
	<li>Cuantificar los niveles endógenos de IAA y CK contra una curva estándar de la proporción de a los estándares marcados con deuterio.</li>
</ol>

<ol><li>Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).</li>
<li>Skoog, F., Miller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regulation+of+growth+and+organ+formation+in+plant+tissues+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Symp+Soc+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro.</a> Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).</li>
<li>Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. <a target="_blank" href="NULL">Transgenic plants and crops</a>. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).</li>
<li>Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+emetic+alkaloid+by+in+vitro+culture+of+Cephaelis+ipecacuanha%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).</li>
<li>Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Cultivation-Utilization-Medicinal-Plants-Kapur/dp/B001I6AQI6">Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research</a>. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).</li>
<li>Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/0167-7799(94)90092-2">Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).</li>
<li>Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24241769">Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).</li>
<li>Yoshimatsu, K., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+shoot+formation+on+internodal+segments+and+alkaloid+formation+in+the+regenerates+of+Cephaelis+ipecacuanha+A.+Richard%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard.</a> Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).</li>
<li>Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9684-8">Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac.</a> J. Plant Growth Regul. , (2017).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).</li>
<li>Watad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304423896008746">Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures.</a> Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).</li>
<li>Ajithkumar, D., Seeni, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050418">Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree.</a> Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).</li>
<li>Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1010652006417">Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).</li>
<li>Rao, M. S., Purohit, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10535-006-0079-0">In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd.</a> Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).</li>
<li>Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9050-6">TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+negatively+regulates+cell+death+by+controlling+NPR1-dependent+salicylic+acid+signaling+during+senescence+and+the+innate+immune+response+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).</li>
<li>Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+hormones%3A+cytokinin+and+auxin+interactions+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development.</a> Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que tienen no hay conflictos de intereses.

Para identificar la distribución de fitohormonas en la organogénesis, es importante utilizar materiales de la planta en la que puede observarse en medio libre de fitohormonas, organogénesis porque cuando fitohormonas exógeno se aplican a los explantes para la inducción de brotes o raíces, afectan el explante entero, lo que hace difícil evaluar la plasticidad inherente de las plantas en la diferenciación celular y organogénesis. Brotes adventicios pueden ser inducidos en medios de cultivo libres de fitohormonas en otras e...

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propuso el concepto de "totipotencia", por que las plantas las células pueden dividir, diferenciar y regenerar plantas enteras incluso después de su previa diferenciación en tipos celulares específicos en plantas maduras1. En cultivo de tejidos, si la regeneración de plantas puede ser inducida o no se determina por la combinación y concentración de fitohormonas exógeno aplicados en el medio de crecimiento. Skoog y Miller encontraron que se podían inducir brotes adventicios de callo de tabaco en el medio de cultivo que contiene una alta proporción de CKs a auxinas, mientras que se podían inducir raíces adventicias en medio que contiene una proporción baja de2. Desde aquel hallazgo, cultivo de tejidos ha sido ampliamente utilizado para la propagación de cultivos de importancia económica y para la regeneración de plantas transgénicas3. Pueden inducir brotes adventicios de tejidos que no sean de meristemo apical de brote, como hojas, raíces y entrenudos. Se requiere para la inducción de brotes adventicios en la mayoría de especies de plantas tratamiento de fitohormonas. Sin embargo, las concentraciones óptimas y combinaciones diferencian por especie y tejido utilizado como explantes. Por lo tanto, mucho esfuerzo va a determinar las concentraciones óptimas y combinaciones de fitohormonas para experimentos.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Ipecacuana) es una planta medicinal que contiene alcaloides como la emetina y la cefalina, principalmente en las raíces4. Extractos de la raíz se utilizan como expectorante, emético y un amoebicide5. Aunque Ipecacuana crece naturalmente en las selvas tropicales de Brasil, es reacio a establecer las semillas en la cultura, y la tasa de germinación disminuye durante el almacenamiento de la semilla en Japón, con su frío clima6. En cambio, se propaga por cultivo de tejidos, en adventicias que dispara la formación de entrenudos es el método más eficiente7,8. Curiosamente, se pueden inducir brotes adventicios en esta especie sin fitohormonas tratamiento8.
Brotes adventicios se forman en la epidermis de la región apical de los segmentos internodales sin callusing, pero no en la región basal9. Esta diferencia indica polaridad de tejido en los segmentos internodales, que es probablemente bajo Reglamento fitohormonal. El sistema de cultivo de jarabe de Ipecacuana permite una oportunidad única para analizar cambios en los niveles de fitohormonas endógenas durante la formación de brotes adventicios. Aquí presentamos nuestro método para el análisis de los niveles endógenos de una auxina (ácido indol-3-acético (AIA)) y cuatro CKs (isopentenyl adenina (iP), isopentenyl adenina riboside (iPR), trans-zeatina (tZ) y trans-riboside zeatina (tZR)) en los segmentos internodales mediante LC-MS/MS.

<table><tbody><tr><td>[2H5]ácido indol-3-acético</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>031 1531</td><td>Norma interna para LC-MS/MS[</td></tr><tr><td>2H5]trans-zeatina</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0301</td><td>Norma interna para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H5]ribósido de trans-zeatina</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0311</td><td>Norma interna para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H6]N6-isopentenil adenina</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0161</td><td>Norma interna para LC-MS/MS[</td></tr><tr><td>2H6]N6-isopentenil adenosina</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0171</td><td>Norma interna para el ácido indol-3-acético LC-MS/MS</td></tr><tr><td></td><td>Wako</td><td>098 00181</td><td>norma para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>trans-zeatina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z0876 5MG</td><td>norma para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>ribósido trans-zeatina</td><td>Wako</td><td>262 01081</td><td>norma para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenil adenina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D7674 1G</td><td>estándar para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenil adenosina</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>22648 1000</td><td>estándar para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>ACETONITRILO HIPERGRADO PARA LC-MS LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.00029.1000</td><td>disolvente para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Agua para cromatografía LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.15333.1000</td><td>disolvente para LC-MS/MS</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>SHIMADZU</td><td>Prominence</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Sciex</td><td>3200QTRAP</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 30 mg/1 cc</td><td>Columna</td> de <td>cartucho</td><td>WAT094225</td> Waters</tr><tr><td>Oasis MCX 30 mg/1 cc</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td>columna de cartucho</td></tr> con <tr><td>cuello de rosca vial de recuperación total</td><td>Waters</td><td></td> 186002805 <td></td></tr><tr><td>azul, tapón de rosca de 12 x 32 mm y tabique de PTFE/silicona</td><td>Waters</td><td></td><td></td>186000274</tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18, 2,1x100 mm</td><td>Waters</td><td>186002350</td><td>columna UPLC</td></tr><tr><td>Proshell 120 EC-C18, 2,1x50 mm</td><td>Agilent</td><td>699775-902</td><td>Columna UPLC</td></tr><tr><td>Microscopio digital</td><td>Leica</td><td>DHS1000</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica</td><td>Feather</td><td>No. 22</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>Feather</td><td>Nº 4</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac/Trampa de vapor refregerada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD111/RVT4104</td><td>Concentrador</td></tr> de <tr><td>vacío Desechable (13x100 mm)</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri estéril</td><td>INA OPTICA</td><td>I-90-20</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de endógeno auxina y citoquinina durante cultura de entrenudo de ipecacuana

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

Formación de brotes adventicios es una técnica importante para la propagación de cultivos de importancia económica y para la regeneración de plantas transgénicas. Tratamiento de fitohormonas se requiere para la inducción de brotes adventicios en la mayoría de las especies. Si se pueden inducir brotes adventicios se determina por el balance entre auxinas y citoquininas (CK) niveles. Mucho esfuerzo se va a determinar concentraciones óptimas y combinaciones de fitohormonas en cada tejido utilizado como explantes y en cada especie de planta. En jarabe de Ipecacuana, sin embargo, brotes adventicios se pueden inducir en los segmentos internodales en medio de cultivo sin tratamiento de fitohormonas. Esto permite la plasticidad inherente del jarabe de ipecacuana para la diferenciación de la célula ser evaluados. Para inducir brotes adventicios en el jarabe de Ipecacuana, nos cultiva segmentos internodales a 24 ° C con 15 μmol m−2 s−1 de la luz en un ciclo oscuro de 14 h luz/10-h en medio de B5 sin fitohormonas solidificado con la goma de gellan 0.2% durante 5 semanas. Para investigar la dinámica de la fitohormona durante la formación de brotes adventicios, medimos endógeno ácido indol-3-acético y CKs en los segmentos por líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas LC-MS/MS. Este método permite el análisis de ácido indol-3-acético endógeno y CKs de una manera sencilla. Puede ser aplicado para investigar la dinámica de la auxina endógena y CK durante la organogénesis en otras especies vegetales.

En la 1 semana dest , no habían formado brotes adventicios. En la semana 2nd , aparecieron pequeños brotes. En el 3rd y 4 semanas demayo , el número de brotes mayor sobre todo en las regiones apicales (I y II) (figura 2A). Enla semana 5, el número de brotes fue aproximadamente 7 en región I y 5 en la región II (figura 2B). En cambio, sólo uno...

Brotes adventicios pueden ser inducidas en los segmentos internodales de Ipecacuana sin tratamiento de fitohormonas. Para evaluar la dinámica de la fitohormona durante la formación de brotes adventicios, medimos endógeno auxina y citocinina en segmentos internodales por LC-MS/MS.

Cuantificación de endógeno auxina y citoquinina durante cultura de entrenudo de Ipecacuana

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

El objetivo general de este procedimiento es describir cómo cambian los niveles de fitohormonas endógenas durante la formación de brotes adventicios en ipecacuana. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con la regeneración de tejidos en el ciclo de cultivo de tejidos vegetales. La principal ventaja de esta técnica es que el nivel endógeno de ácido indol-3-acético y las citoquininas se pueden analizar de forma sencilla y con alta sensibilidad.Las implicaciones de esta técnica se extienden a lo largo del establecimiento de la degeneración del tejido vegetal porque los cambios en el nivel de fitohormonas endógenas desencadenan la formación de brotes adventicios. Para empezar, prepara un medio B5 libre de fitohormonas y añade un 0,2 por ciento de goma gellan. Luego, autoclave el medio para esterilizarlo.Con un bisturí quirúrgico en una placa acrílica estéril, corte segmentos internodales de ocho milímetros de plántulas de ipecacuana y colóquelos en el medio. Luego, cultive los segmentos de ipecacuana a 24 grados Celsius bajo 15 micromoles por metro cuadrado de segundos de luz en un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad durante cinco semanas. Despué

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